Adiporedoxin對TNF-α誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞Integrin α4和Integrin β1表達(dá)的影響

蘇 波， 楊詠梅， 劉政海， 何 慧， 蘇 琦

(南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院 1.藥學(xué)院藥物藥理研究所，2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院應(yīng)用解剖與生殖醫(yī)學(xué)研究所，3.腫瘤研究所，湖南省衡陽市 421001)

脂過氧化物酶(adiporedoxin，Adrx)是過氧化物酶-2(peroxiredoxin-2，PRDX-2)家族成員之一。最初發(fā)現(xiàn)其與破骨細(xì)胞分化相關(guān)，且具有抗氧化功能[1]。Adrx具有抗脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)作用[2]；He等[3]發(fā)現(xiàn)Adrx在人血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，且過表達(dá)Adrx抑制腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)誘導(dǎo)的血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)和細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)表達(dá)。

整合素(Integrin)在炎癥反應(yīng)中介導(dǎo)細(xì)胞間的相互作用和跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，Integrin異常表達(dá)與動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)、腫瘤發(fā)生和進(jìn)展等有關(guān)[4-6]。本文研究Adrx對TNF-α誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞Integrin α4和Integrin β1表達(dá)的影響，證實(shí)Adrx在血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中對Integrin α4和Integrin β1表達(dá)的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 試劑

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(human umbilical vein endothelial cell line，HUVEC)(Walkersville，MD公司)，EGM或EGM2(Lonza公司)，Total RNA Kit(Omega公司)，Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems公司)，SYBR熒光定量PCR檢測試劑盒(ABI公司)，抗Integrin α4和Integrin β1抗體(Abcam公司)，TNF-α、抗Adrx和β-actin抗體(Sigma公司)，二抗和si-Adr(Santa Cruz公司)，Adrx質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[4]。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞轉(zhuǎn)染

HUVEC在37 ℃、含5%CO2、飽和濕度條件下，置于EGM或EGM2(Lonza公司)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。采用電穿孔方法將Adrx質(zhì)粒和si-Adrx轉(zhuǎn)染到HUVEC，24 h后用抗Adrx抗體檢測Adrx蛋白，驗(yàn)證Adrx質(zhì)粒和si-Adrx轉(zhuǎn)染效率。建立Adrx過表達(dá)細(xì)胞株分為對照組、空載體和Adrx組；干擾Adrx表達(dá)分為Control、si-Control、si-Adrx組。過表達(dá)實(shí)驗(yàn)分為空載體組、空載體+TNF-α組、Adrx+TNF-α組；si-RNA干擾實(shí)驗(yàn)分為si-Control組、TNF-α組、si-Adrx+TNF-α組。

1.3 qRT-PCR

將提取的細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；利用Primer Express 4.0設(shè)計(jì)引物，Integrin α4: F 5′-CAG GTT TAA AGC ATG GCC ACA-3′，R 5′-TGG CAT TGG CAT TGT GTA CC-3′; Integrin β1: F 5′-GCC GCG CGG AAA AGA TGA A-3′，R 5′-TGC TGT TCC TTT GCT ACG GT-3′; β-actin: F 5′-CTC TTC CAG CCT TCC TTC CT-3′，R 5′-AGC ACT GTG TTG GCG TAC AG-3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 15 s，58 ℃20 s，72 ℃ 20 s，36個(gè)循環(huán)；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行相對值的定量分析。

1.4 Western blotting檢測

將0.5 mL裂解液加入收集的細(xì)胞，置于冰上超聲20 min后，12 000 r/min離心10 min，提取上清液。取等量樣本凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫封閉1 h，4 ℃孵育一抗過夜，洗膜3次后孵育二抗1 h。用化學(xué)發(fā)光顯影膠片，灰度掃描后以β-actin作為內(nèi)對照進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的蛋白相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TNF-α對HUVEC細(xì)胞Adrx和Integrin α4、Integrin β1表達(dá)的影響

用10 μg/L TNF-α處理細(xì)胞0、2、4、8、16、24 h，如圖1所示。與0 h組比較，Adrx蛋白水平在2、4 h增高，8 h達(dá)到峰值(P<0.05)，16、24 h下降，而Integrin α4和Integrin β1表達(dá)水平呈時(shí)間依賴性上調(diào)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TNF-α誘導(dǎo)Adrx表達(dá)，但呈現(xiàn)先上調(diào)后下降的趨勢，而Integrin α4和Integrin β1表達(dá)水平在Adrx下調(diào)后明顯升高。

圖1 TNF-α對HUVEC細(xì)胞Adrx、Integrin α和Integrin β1表達(dá)的影響

2.2 過表達(dá)Adrx對TNF-α誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞Integrin α4、Integrin β1表達(dá)的影響

將Adrx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞24 h，Western blotting結(jié)果顯示細(xì)胞高表達(dá)Adrx(圖2A)。用TNF-α(10 μg/L)處理細(xì)胞16 h后，分別檢測Integrin α4和Integrin β1的mRNA和蛋白水平。與單用TNF-α處理的細(xì)胞比較，Adrx+TNF-α處理組Integrin α4和Integrin β1的mRNA水平和蛋白表達(dá)量顯著下降(圖2)。

圖2 過表達(dá)Adrx抑制TNF-α誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞Integrin α4和Integrin β1表達(dá)

2.3 下調(diào)Adrx對HUVEC細(xì)胞Integrin α4、Integrin β1表達(dá)的影響

將si-Adrx轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞24 h，Western blotting結(jié)果顯示si-RNA下調(diào)Adrx表達(dá)(圖3A)。用TNF-α(10 μg/L)處理細(xì)胞16 h后檢測Integrin α4和Integrin β1 的mRNA和蛋白水平。結(jié)果顯示，與單用TNF-α處理的細(xì)胞比較，用si-RNA處理細(xì)胞后，TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞 Integrin α4和Integrin β1的mRNA水平明顯上調(diào)(圖3B)；si-RNA下調(diào)Adrx表達(dá)后，TNF-α誘導(dǎo)的Integrin α4和Integrin β1蛋白水平增加(圖3C)。

圖3 Adrx-si-RNA增強(qiáng)TNF-α誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞Integrin α4和Integrin β1表達(dá)

3 討 論

Adrx又稱為巨噬細(xì)胞集落刺激因子誘導(dǎo)激活的過氧化物酶-2類分子(PRDX-like 2 activated in M-CSF stimulated monocytes，PAMM)。Xu等[1]報(bào)道，在誘導(dǎo)骨髓單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化時(shí)發(fā)現(xiàn)這個(gè)基因，并證實(shí)它是一種氧化還原調(diào)節(jié)蛋白。過表達(dá)Adrx可下調(diào)LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞炎性因子IL-1β、IL-6、IL-12表達(dá)，表明Adrx對炎癥反應(yīng)具有抑制作用[2]。

炎癥刺激因子所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)與As發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，黏附分子表達(dá)增高是內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的特征之一[7]。He等[3]證實(shí)，Adrx抑制TNF-α誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1和ICAM-1表達(dá)，同時(shí)減少單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附。促炎細(xì)胞因子TNF-α促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞Integrin α4和Integrin β1表達(dá)，后者介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)及As進(jìn)展[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，在用TNF-α處理細(xì)胞后Adrx表達(dá)先上調(diào)后降低，與He等[3]的研究結(jié)果一致；過表達(dá)Adrx可拮抗TNF-α上調(diào)Integrin α和Integrin β1表達(dá)，而用si-RNA干擾Adrx表達(dá)則增強(qiáng)TNF-α上調(diào)Integrin α和Integrin β1的作用，表明Adrx負(fù)調(diào)控Integrin α4和Integrin β1表達(dá)。

Adrx分子結(jié)構(gòu)與PRDX-2相似，后者具有抗氧化和抗炎作用。在ApoE-/-小鼠As易感區(qū)內(nèi)皮組織PRDX-2表達(dá)增高；在高膽固醇飲食喂養(yǎng)的ApoE-/-和PRDX-2-/-雙敲除小鼠，內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)增加，單核細(xì)胞黏附增多并滲入主動(dòng)脈內(nèi)膜，從而加速As斑塊形成，表明As發(fā)生與 PRDX-2 表達(dá)減少有關(guān)[9]。Adrx參與黏附分子和細(xì)胞因子的表達(dá)調(diào)控，它可能具有與PRDX-2相似的抗血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的功能；在TNF-α誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的過程中，隨著炎癥進(jìn)展Adrx表達(dá)下降可能導(dǎo)致其負(fù)調(diào)控Integrin α4、Integrin β1作用減弱，而Integrin α4和Integrin β1表達(dá)持續(xù)性增高可能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)和As發(fā)展。

Integrin介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移[10]。血管內(nèi)皮細(xì)胞Integrin α4和Integrin β1在腫瘤細(xì)胞腦轉(zhuǎn)移的早期表達(dá)增高，Integrin α4和Integrin β1功能阻斷抗體可抑制腫瘤細(xì)胞腦轉(zhuǎn)移[11]。VCAM-1在乳腺癌細(xì)胞表達(dá)異常增高，Integrin α4、Integrin β1與VCAM-1相互作用可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移[12]。血管內(nèi)皮細(xì)胞Integrin α4、Integrin β1與腫瘤細(xì)胞VCAM-1相互作用不僅介導(dǎo)細(xì)胞黏附，還可能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞經(jīng)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，下調(diào)Adrx表達(dá)可促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞Integrin α4和Integrin β1表達(dá)，過表達(dá)Adrx則能下調(diào)Integrin α4和Integrin β1。由此推測Adrx在血管內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞相互作用中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，它可能通過下調(diào)Integrin α4和Integrin β1抑制內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞黏附、影響腫瘤細(xì)胞跨血管轉(zhuǎn)移，而在內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中Adrx表達(dá)下降可能導(dǎo)致Integrin α和Integrin β1上調(diào)，后者促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞黏附。

本研究證實(shí)，Adrx在TNF-α誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞Integrin α4和Integrin β1表達(dá)中起著負(fù)調(diào)控作用。目前，Adrx在血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中對黏附分子表達(dá)的調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。