發(fā)酵工藝對(duì)白啤4-VG 含量的影響分析

張健唯，梁 宸，劉助水

（1.北京燕京啤酒股份有限公司，北京 100083；2.燕京啤酒（桂林漓泉）股份有限公司，廣西桂林 541002）

啤酒的風(fēng)味質(zhì)量包括啤酒的風(fēng)味強(qiáng)度、風(fēng)味組成和風(fēng)味穩(wěn)定性三個(gè)主要方面，啤酒的口感一致性和風(fēng)味穩(wěn)定性對(duì)消費(fèi)者的影響比較直接、重要，受到啤酒行業(yè)的廣泛關(guān)注，提高啤酒的口感一致性和風(fēng)味穩(wěn)定性也是啤酒行業(yè)面臨的重要挑戰(zhàn)。

酚類(lèi)是構(gòu)成啤酒活性風(fēng)味物質(zhì)的重要組成之一，已經(jīng)檢測(cè)出的有揮發(fā)性酚、愈創(chuàng)木酚、苯酚等，其中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（4-vinylguaiacol,4-VG）是小麥啤酒的特征性香氣物質(zhì)，具有揮發(fā)性，有獨(dú)特發(fā)酵香氣，嗅覺(jué)識(shí)別度較高，能夠給小麥啤酒帶來(lái)特殊香味。4-VG 并非天然存在于啤酒原料中，而是在生產(chǎn)啤酒的制麥、糖化和發(fā)酵各個(gè)環(huán)節(jié)中由阿魏酸發(fā)生脫羧反應(yīng)。4-VG 的產(chǎn)生途徑有兩種：（1）前體物質(zhì)阿魏酸經(jīng)過(guò)高溫?zé)崦擊确磻?yīng)生成4-VG；（2）阿魏酸經(jīng)過(guò)酶催化脫羧反應(yīng)生成4-VG。

白啤是小麥啤酒的一種，關(guān)于糖化工藝參數(shù)對(duì)白啤4-VG 含量影響的研究較多，但關(guān)于發(fā)酵工藝參數(shù)對(duì)白啤4-VG 含量影響的研究不是非常完全。因此，本研究系統(tǒng)研究酵母菌種、酵母代數(shù)、酵母接種量、發(fā)酵溫度、冷麥汁充氧量5 種發(fā)酵工藝參數(shù)對(duì)白啤4-VG 含量的影響，以期通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)提高白啤中4-VG的含量。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料和菌株：大麥芽（麥特卡夫），粵海永順泰（廣州）麥芽有限公司；小麥芽，歐麥(保定)麥芽有限公司；酵母菌株，燕京啤酒（桂林漓泉）股份有限公司保藏。

試劑及耗材：乙腈（色譜純），美國(guó)Fisher 公司；三氟乙酸（純度99.5%），阿拉丁試劑（上海）有限公司；4-VG（純度98%），德國(guó)Sigama公司。

儀器設(shè)備：液相色譜儀（規(guī)格型號(hào)：1200系列），安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；紫外檢測(cè)器，安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；電子天平（精度0.0001 g），梅特勒-托利多集團(tuán)；超聲波儀，昆山市超聲儀器有限公司；燕京啤酒（桂林漓泉）股份有限公司精釀啤酒生產(chǎn)線（糖化麥汁單鍋產(chǎn)量2 t，發(fā)酵一鍋麥汁進(jìn)罐），寧波樂(lè)惠國(guó)際工程裝備股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 麥汁制備

原料配比為60%大麥芽+40%小麥芽，麥芽采用干法粉碎，下料溫度38 ℃（保溫時(shí)間10 min），蛋白質(zhì)休止溫度45 ℃（保溫時(shí)間10 min），糖化溫度63 ℃（保溫時(shí)間30 min），糖化溫度72 ℃（保溫時(shí)間25 min），醪液升溫到76 ℃后送入過(guò)濾槽，煮沸90 min（蒸發(fā)率控制8%），回旋沉淀30 min，麥汁冷卻35 min（冷麥汁溫度與發(fā)酵溫度相同），充氧后進(jìn)入立式發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵。冷麥汁理化指標(biāo)控制：原麥汁濃度12°P±0.3°P，氨基氮250 mg/L±20 mg/L，總酸1.6 mL/100 mL±0.1 mL/100 mL，pH5.6±0.1，色度10 EBC±1 EBC。

1.2.2 發(fā)酵工藝

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，調(diào)整5 種發(fā)酵工藝參數(shù)。一是接種的酵母菌株，分別采用公司保藏的4 款上面酵母，編號(hào)為No.1、No.2、No.3、No.4，0 代酵母經(jīng)實(shí)驗(yàn)室純培，再用20 L卡式罐下種至精釀啤酒生產(chǎn)線進(jìn)行擴(kuò)培，最后根據(jù)發(fā)酵工藝的酵母接種量，將擴(kuò)培液送入發(fā)酵罐，再將冷麥汁送入發(fā)酵罐；二是酵母代數(shù)，分別為0 代、1 代、2 代、3 代，除0 代酵母之外，其余代數(shù)的酵母通過(guò)酵母在線添加管道，在冷麥汁進(jìn)罐0.1 t 且冷麥汁溫度穩(wěn)定后定量添加；三是酵母接種量，分別為4 百萬(wàn)個(gè)/mL、6 百萬(wàn)個(gè)/mL、8 百萬(wàn)個(gè)/mL、10 百萬(wàn)個(gè)/mL，除0 代酵母之外，其余代數(shù)的酵母通過(guò)使用ABER 活性酵母計(jì)數(shù)儀進(jìn)行定量添加，從而達(dá)到試驗(yàn)酵母接種量的要求；四是發(fā)酵溫度，分別為14 ℃、16 ℃、18 ℃、20 ℃；五是冷麥汁充氧量，分別為18 mg/L、20 mg/L、22 mg/L、24 mg/L（mg/L表示每升冷麥汁充入氧氣的質(zhì)量），充氧后段使用蛇形管，以提高冷麥汁充氧的效果。

1.2.3 4-VG含量的測(cè)定

從發(fā)酵液滿罐后第1 天起，每天上午定時(shí)取樣，測(cè)量發(fā)酵液4-VG 含量。檢測(cè)方法參考T/CBJ 3103—2020白啤酒團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)中高效液相色譜法（第一法）進(jìn)行測(cè)定。檢測(cè)步驟大致如下：先制定標(biāo)準(zhǔn)溶液/校正曲線、控制樣，再將樣品經(jīng)振蕩脫氣，先后經(jīng)過(guò)單層中速濾紙、0.22 μm過(guò)濾頭過(guò)濾，直接進(jìn)樣，最后進(jìn)行結(jié)果計(jì)算，結(jié)果取小數(shù)點(diǎn)后一位。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌種對(duì)白啤4-VG含量的影響

試驗(yàn)將酵母菌株設(shè)置為變量，其余發(fā)酵工藝參數(shù)為：酵母代數(shù)0 代、酵母接種量6百萬(wàn)個(gè)/mL、發(fā)酵溫度18 ℃和冷麥汁充氧量20 mg/L。酵母是啤酒的靈魂，它對(duì)啤酒風(fēng)味起著決定性作用，接種不同酵母釀造出的啤酒風(fēng)味各異，選擇適宜的上面發(fā)酵酵母是產(chǎn)生白啤特色丁香香氣的關(guān)鍵因素。

如圖1 所示，4 種不同酵母釀造的白啤中4-VG含量差異明顯。上面發(fā)酵酵母的POF（phenolic off-flavour）基因編碼的阿魏酸脫羧酶能夠催化4-VG 的前體物質(zhì)阿魏酸脫羧生成4-VG，從而賦予白啤酚香味。上面發(fā)酵酵母中含有POF 基因，賦予小麥啤酒酚香味，根據(jù)酚香味的差異將上面發(fā)酵酵母分為POF+型和POF-型，POF+酵母比POF-酵母產(chǎn)生的酚香和丁香香氣更加濃郁。能夠釀造啤酒產(chǎn)生4-VG 含量高于2.5 mg/L 的酵母為POF+酵母，低于此含量的為POF-酵母。

圖1 酵母菌種與4-VG含量的關(guān)系

試驗(yàn)的4 種上面酵母中，No.3 和No.4 發(fā)酵產(chǎn)生的4-VG 含量較高，No.2 發(fā)酵產(chǎn)生的4-VG 含量適中，No.1 發(fā)酵產(chǎn)生的4-VG 含量較少。此結(jié)果證明上面酵母No.3和No.4為POF+菌，上面酵母No.1和No.2為POF-菌。

在選擇酵母的同時(shí)需要考慮其對(duì)白啤“酸感”帶來(lái)的影響，口感過(guò)酸往往會(huì)降低消費(fèi)者的體驗(yàn)感。乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸是白啤釀造過(guò)程中帶來(lái)“酸感”的主要物質(zhì)，不同酵母對(duì)以上4 種酸的代謝能力差別較大。本研究的檢測(cè)和品評(píng)結(jié)果顯示，上面酵母No.3 和No.4 釀造的白啤在產(chǎn)生4-VG含量合適的情況下，“酸感”表現(xiàn)良好。

2.2 酵母代數(shù)對(duì)白啤4-VG含量的影響

試驗(yàn)將酵母代數(shù)設(shè)置為變量，其余發(fā)酵工藝參數(shù)為：酵母No.3、酵母接種量6 百萬(wàn)個(gè)/mL、發(fā)酵溫度18 ℃和冷麥汁充氧量20 mg/L。

如圖2 所示，用0 代到3 代酵母釀造的白啤中4-VG 含量呈逐漸下降趨勢(shì)，這與上面酵母中苯丙烯酸活性脫羧酶PADl(POFl)的作用效果有關(guān)。本試驗(yàn)使用立式發(fā)酵罐，采用一罐法進(jìn)行釀造，只有在對(duì)發(fā)酵罐降溫后，才能從發(fā)酵罐錐底得到足夠多的上面酵母，從而進(jìn)行傳代投料試驗(yàn)，此時(shí)酵母已長(zhǎng)時(shí)間處于缺乏營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，且初期沉降下來(lái)的酵母，其自身活力及脫羧酶活性相對(duì)較弱。隨著酵母代數(shù)增多，白啤4-VG 含量會(huì)逐漸下降。根據(jù)本公司的研發(fā)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，要想保持口感和風(fēng)味的穩(wěn)定性，對(duì)于大部分酵母來(lái)說(shuō)，一般將代數(shù)控制在3 代以?xún)?nèi)為佳。這一論斷也并不是絕對(duì)的，與酵母菌株的特性有關(guān)，有些酵母控制在第5 代也不會(huì)對(duì)生產(chǎn)造成明顯的不良影響。

圖2 酵母代數(shù)與4-VG含量的關(guān)系

2.3 酵母接種量對(duì)白啤4-VG含量的影響

試驗(yàn)將酵母接種量設(shè)置為變量，其余發(fā)酵工藝參數(shù)為：酵母No.3、酵母代數(shù)0 代、發(fā)酵溫度18 ℃和冷麥汁充氧量20 mg/L。

如圖3 所示，白啤中4-VG 的含量隨著酵母接種量的增加而上升，當(dāng)酵母添加量大于6 百萬(wàn)個(gè)/mL時(shí)，4-VG 的含量高于5 mg/L。接種量的多少直接影響發(fā)酵周期長(zhǎng)短、酵母的生長(zhǎng)繁殖速度、酵母峰值和風(fēng)味代謝物質(zhì)的含量。適宜的接種量可為酵母創(chuàng)造種群優(yōu)勢(shì)，排除雜菌的影響。接種量通過(guò)影響酵母的增殖數(shù)量和發(fā)酵速度，間接對(duì)白啤中4-VG等酚類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)生影響。

圖3 酵母接種量與4-VG 含量的關(guān)系

上面酵母的酵母接種量不建議太高，一般控制在15 百萬(wàn)個(gè)/mL 以?xún)?nèi)為佳。過(guò)高的酵母接種量，一方面會(huì)造成發(fā)酵液前期降糖速度偏快，出現(xiàn)溢泡現(xiàn)象，容易染菌；另一方面，酵母在高溫下大量繁殖會(huì)導(dǎo)致酒液的雜醇和總酸含量增加，進(jìn)而嚴(yán)重影響啤酒的口感協(xié)調(diào)性和可飲性，消費(fèi)者會(huì)出現(xiàn)飲后“上頭”的現(xiàn)象。

2.4 發(fā)酵溫度對(duì)白啤4-VG含量的影響

試驗(yàn)將發(fā)酵溫度設(shè)置為變量，其余發(fā)酵工藝參數(shù)為：酵母No.3、酵母代數(shù)0代、酵母接種量10百萬(wàn)個(gè)/mL 和冷麥汁充氧量20 mg/L。上面發(fā)酵酵母發(fā)酵溫度通常高于下面發(fā)酵酵母，一般控制在15～25 ℃。發(fā)酵溫度通過(guò)影響酵母新陳代謝的速度進(jìn)而影響發(fā)酵所產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)含量。發(fā)酵過(guò)程中酶催化脫羧反應(yīng)生成4-VG，合理控制發(fā)酵溫度有利于酵母處于最佳生長(zhǎng)繁殖狀態(tài)及阿魏酸脫羧酶在最適反應(yīng)條件下發(fā)揮催化作用，進(jìn)而提高最終白啤中的4-VG 含量。一般情況下，發(fā)酵溫度不同，白啤中4-VG 含量存在一定的差異，4-VG含量隨發(fā)酵溫度的升高而上升。

如圖4 所示，當(dāng)溫度設(shè)置為16 ℃時(shí)，4-VG 含量上升速率較慢，且最終含量較低，說(shuō)明此溫度未能使酶充分發(fā)揮活性達(dá)到轉(zhuǎn)化阿魏酸的目的；在18～20 ℃，4-VG 含量上升較快，說(shuō)明溫度在此區(qū)間內(nèi)越來(lái)越接近酶的最適反應(yīng)溫度，酶的活性逐漸提高。考慮到啤酒生產(chǎn)中的能耗和發(fā)酵過(guò)程中會(huì)生成其他風(fēng)味物質(zhì)，酵母在代謝氨基酸和糖的過(guò)程中同時(shí)會(huì)產(chǎn)生雜醇，發(fā)酵溫度過(guò)高會(huì)使啤酒中的雜醇含量過(guò)高、總酸偏高、苦味值低、泡沫性能差且容易染菌，對(duì)成品酒風(fēng)味造成不良影響。當(dāng)發(fā)酵溫度超過(guò)20 ℃時(shí)，4-VG 含量的增幅小于醇類(lèi)的增幅，醇類(lèi)增幅相對(duì)較多，飲后易出現(xiàn)“上頭”現(xiàn)象。

圖4 發(fā)酵溫度與4-VG含量的關(guān)系

2.5 冷麥汁充氧量對(duì)白啤4-VG含量的影響

試驗(yàn)將冷麥汁充氧量設(shè)置為變量，其余發(fā)酵工藝參數(shù)為：酵母No.3、酵母代數(shù)0 代、酵母接種量10百萬(wàn)個(gè)/mL和發(fā)酵溫度20 ℃。

如圖5 所示，白啤中4-VG 的含量隨著冷麥汁充氧量的增加而上升，且在18～22 mg/L 范圍內(nèi)4-VG 含量上升較快。提高冷麥汁充氧量會(huì)提高酵母數(shù)的峰值，發(fā)酵罐內(nèi)的酵母峰值越高，阿魏酸經(jīng)過(guò)酶催化脫羧反應(yīng)生成的4-VG 就會(huì)越多。當(dāng)冷麥汁充氧量超過(guò)22 mg/L 時(shí)，4-VG 含量變化趨勢(shì)逐漸平穩(wěn)，此時(shí)冷麥汁的溶氧量已基本達(dá)到飽和狀態(tài)，即使再提高冷麥汁充氧量，過(guò)飽和部分的氧在麥汁進(jìn)罐過(guò)程中也會(huì)很快形成氣泡逸出發(fā)酵罐，不能被酵母所利用，酵母數(shù)的峰值不會(huì)有明顯提高，4-VG含量就不會(huì)再增加。

圖5 冷麥汁充氧量與4-VG 含量的關(guān)系

值得注意的是，增加冷麥汁充氧量會(huì)提高酵母數(shù)的峰值，啤酒中雜醇和總酸的含量也會(huì)增加，總酯含量減少；充氧量過(guò)低不利于酵母增殖，會(huì)使乙醛含量上升、發(fā)酵周期延長(zhǎng)。所以在設(shè)計(jì)冷麥汁充氧量時(shí)，不能單方面的考慮4-VG 含量，也需兼顧白啤其他指標(biāo)。

3 結(jié)論

近年來(lái)，我國(guó)啤酒行業(yè)開(kāi)始從擴(kuò)大規(guī)模向提高檔次的發(fā)展方向轉(zhuǎn)變，各啤酒品牌相繼推出白啤產(chǎn)品來(lái)布局高端市場(chǎng)。白啤具有特殊的丁香香氣，酒體渾濁且泡沫豐富，口感飽滿且苦味值較低。本文通過(guò)單因素試驗(yàn)研究了酵母菌種、酵母代數(shù)、酵母接種量、發(fā)酵溫度和冷麥汁充氧量這5 種發(fā)酵工藝參數(shù)對(duì)白啤4-VG 含量的影響，其中酵母菌種的影響最大。對(duì)于白啤的釀造，應(yīng)該提高4-VG 含量而突出其丁香的香氣特征，但不能單一考慮此因素而影響乙醛、雜醇、總酸和總酯等指標(biāo)的含量，對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味和口感造成損失，應(yīng)該兼顧白啤風(fēng)味的平衡性和穩(wěn)定性、口感的一致性和可飲性?；谝陨峡剂坎⒔?jīng)過(guò)多次試驗(yàn)驗(yàn)證，得到提高白啤中4-VG 含量的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為:以燕京漓泉公司保藏的No.3酵母為發(fā)酵酵母、酵母代數(shù)0代、酵母接種量10百萬(wàn)個(gè)/mL、發(fā)酵溫度20 ℃、冷麥汁充氧量22 mg/L。在最佳發(fā)酵工藝條件下釀造出的白啤產(chǎn)品丁香香氣特征突出，無(wú)其他異雜味，口感豐富、一致性和可飲性良好，酒體平衡、穩(wěn)定、協(xié)調(diào)。本研究為釀造白啤工藝提供了參考依據(jù)。