醬香型白酒釀造酒醅中產(chǎn)香芽孢桿菌的分離鑒定

戴奕杰，楊文佳，劉 燕

(1.貴陽(yáng)學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550005；2.貴州省山地珍稀動(dòng)物與經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州貴陽(yáng) 550005)

中國(guó)傳統(tǒng)白酒與白蘭地、威士忌、伏特加、杜松子酒和朗姆酒并稱為世界六大蒸餾酒。作為我國(guó)一種傳統(tǒng)的糧食發(fā)酵蒸餾酒，白酒釀造以高粱為原料，大曲作為糖化發(fā)酵劑，通過(guò)固態(tài)微生物發(fā)酵、固態(tài)蒸餾、貯存和勾兌生產(chǎn)而成。我國(guó)白酒歷史悠久，是全球白酒行業(yè)的重要貢獻(xiàn)者。根據(jù)其獨(dú)特的香氣特征，可將中國(guó)白酒劃分為12 類，其中濃香型白酒、清香型白酒、醬香型白酒、米香型白酒是我國(guó)白酒的四大基礎(chǔ)酒類。

醬香型白酒生產(chǎn)工藝復(fù)雜，距今已有上千年歷史，經(jīng)兩次投料（下沙、糙沙）、九次蒸煮、八次發(fā)酵以及七次蒸餾取酒，最終貯存、勾兌、調(diào)味、貯存而成。

堆積發(fā)酵是醬香型白酒生產(chǎn)過(guò)程中非常關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)。這個(gè)階段涉及的微生物群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化十分復(fù)雜，細(xì)菌、酵母等迅速生長(zhǎng)繁殖，并產(chǎn)生多種酶類和其他代謝物質(zhì)。原料中的蛋白質(zhì)在這些酶的作用下被水解成各種氨基酸，酶與各代謝物質(zhì)間也會(huì)相互作用發(fā)生美拉德反應(yīng)和其他化學(xué)反應(yīng)，促進(jìn)具有醬香風(fēng)味的化合物的生成，賦予白酒獨(dú)特風(fēng)味特征。Wang 等通過(guò)16S、18S rRNA 基因測(cè)序技術(shù)研究了大曲、高粱及空氣、窖池、窖泥等3 個(gè)發(fā)酵谷物樣品和12 個(gè)環(huán)境樣品中的微生物群落組成，得出細(xì)菌主要來(lái)源于大曲，其次是空氣、窖泥和高粱。高溫大曲（60～65 ℃）的優(yōu)勢(shì)菌群是細(xì)菌，而非真菌，原因在于芽孢桿菌等部分細(xì)菌能夠適應(yīng)高溫等環(huán)境條件。醬香型白酒發(fā)酵過(guò)程中，高溫大曲中的細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)于最終白酒的風(fēng)味和質(zhì)量至關(guān)重要。

Wang 等使用表型分類和常規(guī)生化鑒定大曲中的微生物群落結(jié)構(gòu)。得出優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為芽孢桿菌屬（）、醋桿菌屬（）、乳桿菌屬（）和梭菌屬（），其中芽孢桿菌屬菌株數(shù)量最多。有學(xué)者研究了茅臺(tái)酒發(fā)酵過(guò)程中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)大曲成熟期的主要優(yōu)勢(shì)菌為芽孢桿菌科，且該菌同為堆積發(fā)酵前期和窖池發(fā)酵厭氧階段的優(yōu)勢(shì)菌。芽孢桿菌屬于嗜熱性細(xì)菌，發(fā)酵后期迅速生長(zhǎng)繁殖，釋放大量熱量。研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌內(nèi)生孢子的耐熱性是由spo-VA2moboperon 介導(dǎo)的。且研究證明：、和能 夠代謝產(chǎn)生丙酸、1，3-丁二醇、乙酸、甲酯等物質(zhì)，其中大部分物質(zhì)是醬香型白酒中常見(jiàn)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

高溫大曲生產(chǎn)和堆積發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌是芽孢桿菌，對(duì)醬香型白酒的品質(zhì)具有一定的貢獻(xiàn)作用。堆積發(fā)酵及入窖發(fā)酵過(guò)程中微生物種類繁多、復(fù)雜多變，對(duì)其中優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行篩選并將其作為功能發(fā)酵劑充分利用是目前的研究熱點(diǎn)。

本研究通過(guò)選擇性培養(yǎng)基從傳統(tǒng)醬香型白酒釀造工藝中的窖池厭氧發(fā)酵的酒醅中篩選得到1株產(chǎn)香菌株，通過(guò)進(jìn)一步形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)方法確定該菌株為解淀粉芽孢桿菌，為今后該菌株發(fā)酵性能的研究及白酒釀造工藝中功能發(fā)酵劑的挖掘奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 樣品采集

按照傳統(tǒng)醬酒的釀造工藝，本研究對(duì)某醬香型白酒生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行實(shí)地采樣。選取同一窖池七個(gè)輪次窖池發(fā)酵工序的酒醅，根據(jù)如圖1 的9 個(gè)取樣點(diǎn)的位置進(jìn)行取樣，每輪次取樣量保持一致。將收集到的9 個(gè)取樣位置的酒醅混合均勻后，分裝于無(wú)菌袋封裝標(biāo)記，置于4 ℃的冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 窖池發(fā)酵酒醅取樣示意圖

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

培養(yǎng)基：肉湯（瓊脂）培養(yǎng)基購(gòu)于北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

試劑：GN、BCL 反應(yīng)卡購(gòu)買(mǎi)于梅里埃（VITEK2）；16S 引物（F16S-27、R16S-1492）、2×Rapid Taq Master Mix、回收試劑盒（NEP025-1 50T）均來(lái)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱（HPX9272MBE），上海博訊；均質(zhì)器，梅里埃（Smasher）；PCR儀（DL9700 96孔），東林昌盛；恒溫孵育器，鼎國(guó)昌盛；全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)，梅里埃（VITEK2）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離純化

稱取25 g 七個(gè)輪次混勻后的酒醅，放置于盛有225 mL 無(wú)菌生理鹽水的均質(zhì)袋中，用均質(zhì)器拍打1 min，制成1∶10 的菌懸液。用無(wú)菌吸管吸取1 mL 的1∶10 菌懸液，注入盛有9 mL 無(wú)菌生理鹽水的無(wú)菌試管中，振搖試管混合均勻，制成1∶100 的樣品勻液。重復(fù)上述操作進(jìn)行梯度稀釋至10，然后分別吸取10 μL 不同稀釋度（10～10）的菌懸液于肉湯（LB）瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行涂布，每個(gè)稀釋度涂布兩個(gè)平皿。將平板置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)1 d。挑取多個(gè)不同形態(tài)的單個(gè)菌落，于培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線以純化菌株，每日觀察并記錄菌落的生長(zhǎng)情況。

1.2.2 菌株的保藏

挑取純化好的單個(gè)菌落于肉湯瓊脂斜面培養(yǎng)基中劃線，將斜面培養(yǎng)基置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，菌落長(zhǎng)滿斜面后，將培養(yǎng)基置于4 ℃冰箱中保藏。每三個(gè)月需將試管中的菌種傳代一次，保證其活力。

1.2.3 菌株的鑒定

挑取斜面培養(yǎng)基中的菌種在肉湯瓊脂培養(yǎng)基中劃線，置于30 ℃培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h 以活化菌種，以備優(yōu)勢(shì)菌株的形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定及分子生物學(xué)鑒定。

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察

菌落形態(tài)觀察：將活化好的菌株接種至LB 固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)，每天觀察并記錄固體培養(yǎng)基上菌落的顏色、形狀、光澤、突起程度、邊緣形狀等。

細(xì)胞形態(tài)：無(wú)菌操作下，挑取菌株于載玻片上進(jìn)行革蘭氏染色，于100×油鏡下觀察其顏色變化及細(xì)胞形態(tài)特征。

革蘭氏染色法：參考《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》（第三版）進(jìn)行。

1.2.3.2 生理生化鑒定

菌株生理生化鑒定通過(guò)全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)VITEK?2 Compact 實(shí)現(xiàn)。包括：革蘭氏陽(yáng)性菌鑒定卡（GP）、芽孢菌鑒定卡（BCL）。主要操作流程為：挑取單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行純培養(yǎng)，制備一定濃度的菌懸液，將卡片按順序放在載卡架上，將導(dǎo)液管插入菌懸液中，上機(jī)測(cè)試。2～10 h 系統(tǒng)自動(dòng)打印鑒定結(jié)果。

1.2.3.3 分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)操作步驟使用試劑盒提取待待測(cè)菌株的總DNA。使用引物F16S-27（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和R16S-1492（CGGTTACCTTGTTACGACTTC）擴(kuò)增菌株的目的片段。PCR 擴(kuò)增過(guò)程如下：94 ℃初始變性5 min，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)，即94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)結(jié)束后，72 ℃單次延伸10 min，最后在4 ℃孵育結(jié)束。PCR 反應(yīng)體系為：25 μL 的2×Rapid Taq Master Mix，10 μM的每個(gè)引物（1.0 μL），1.0 μL 的模板DNA及22.0 μL 的ddHO。1 %的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

在NCBI 網(wǎng)站將獲得的基因序列進(jìn)行BLAST（Basic Local Alignment Search Tool），選取數(shù)據(jù)庫(kù)中與測(cè)定序列同源性高于99 %的序列進(jìn)行比對(duì)，將得到的比對(duì)結(jié)果使用MEGA 軟件中的Neighborjoining算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)香菌株的篩選

每個(gè)稀釋度（10～10）的平板上挑取20 個(gè)菌落進(jìn)一步分離純化，觀察菌株在LB 固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)特征，七輪次混合酒醅中共分離到12 株菌落形態(tài)不同的菌，結(jié)合革蘭氏染色結(jié)果，12 株菌落形態(tài)不同的菌中6 株菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，其在肉湯瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)如表1所示。

表1 菌株的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)

為判斷各菌的產(chǎn)香性能，將篩選到的6 株革蘭氏陽(yáng)性菌DAI bj-1、DAI bj-2、DAI bj-3、DAI db-1、DAI db-2、DAI db-3 接種至肉湯液體培養(yǎng)基（試管）中，分別編號(hào)為1、2、3、4、5、6，于30 ℃培養(yǎng)5 d，通過(guò)感官評(píng)價(jià)試管內(nèi)的香氣特征進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果如表2所示。

表2 菌株香氣特征

由表2 可知，除4 號(hào)、6 號(hào)試管無(wú)明顯香味外，其余4 支試管均有一定的清香味，1 號(hào)、3 號(hào)試管香氣特征相似，菌株生長(zhǎng)較旺盛，香氣強(qiáng)度均高于2號(hào)、5 號(hào)試管，且均具有一定的醬香味，但3 號(hào)試管除醬香外還有微微的酸味，2 號(hào)試管具有淡淡的酯香味。因此從篩選到的6 株菌中選用綜合產(chǎn)香性能較優(yōu)的DAI bj-1作為目標(biāo)菌株。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察

菌株DAI bj-1 菌落形態(tài)與細(xì)胞形態(tài)如圖2 所示，由圖2 可知，純化后的單個(gè)菌落在LB 固體培養(yǎng)基上形狀為圓形，顏色呈淡黃色，邊緣不規(guī)則，中間突起不透明，表面濕潤(rùn)。挑取單個(gè)菌落于載玻片上通過(guò)革蘭氏染色法于顯微鏡下觀察到該菌株的細(xì)胞形態(tài)為：形狀呈桿狀，革蘭氏染色結(jié)果為陽(yáng)性。

圖2 菌株的菌落形態(tài)（a）和細(xì)胞形態(tài)（b）

2.3 生理生化鑒定

由菌株DAI bj-1的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，可初步得到該菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，因此可通過(guò)VITEK? 2 Compact 系統(tǒng)中的革蘭氏陽(yáng)性菌鑒定卡（GP）和芽孢菌鑒定卡（BCL）進(jìn)一步確定。該全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)可快速、高效、準(zhǔn)確地通過(guò)各生理生化試驗(yàn)確定該菌株。其GP 和BCL 鑒定結(jié)果如表3、表4所示。根據(jù)最終結(jié)果報(bào)告顯示：革蘭氏陽(yáng)性菌鑒定卡（GP）中，苦杏仁苷（AMY）、D-甘露糖（dMNE）、D-半乳糖（dGAL）、α-葡萄糖苷酶（AGLU）、水楊素（SAL）等21 項(xiàng)結(jié)果呈陽(yáng)性，磷酸酶（PHOS）、D-木糖（dXYL）、α-半乳糖苷酶（AGAL）、β-D-葡萄糖苷酸酶（BGUR）等22 項(xiàng)結(jié)果呈陰性；芽孢菌鑒定卡（BCL）中，β-木糖苷酶（BXYL）、丙酮酸鹽（PVATE）、肌醇（INO）、D-葡萄糖（dGLU）、腐胺同化（PSCNa）等32 項(xiàng)結(jié)果呈陽(yáng)性，磷酰膽堿（PHC）、L-脯氨酸芳胺酶（ProA）、N-乙酰-D-氨基葡萄糖（NAG）、麥芽三糖（MTE）等14 項(xiàng)結(jié)果呈陰性。根據(jù)VITEK? 2 Compact 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)中的GP、BCL結(jié)果，判斷該菌株可能為芽孢桿菌。

表3 VITEK 2 GP鑒定結(jié)果

表4 VITEK 2 BCL鑒定結(jié)果

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立

為驗(yàn)證VITEK? 2 Compact 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)結(jié)果的準(zhǔn)確性及確定酒醅中分離到的菌株DAI bj-1 為哪種芽孢桿菌，提取該菌株DNA 后，PCR擴(kuò)增上機(jī)測(cè)序。

將測(cè)序所得的該菌株的基因序列與NCBI在線基因數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行比對(duì)，按照相似性高低進(jìn)行排序后得到：菌株DAI bj-1的基因序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的strain Ba13（Sequence ID：MG846076.1）具有99.93 %的相似性。選取Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)中與測(cè)試菌株的序列同源性較高的已知菌株的序列進(jìn)行多序列比對(duì)，將比對(duì)結(jié)果通過(guò)Mega-X 軟件使用Neighbor-joining 算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖3。

由圖3 可知，菌株DAI bj-1 為芽孢桿菌，且其與的遺傳進(jìn)化距離接近，位于同一個(gè)分支。因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定結(jié)果，可確定，傳統(tǒng)醬香型白酒釀造工藝中的窖池厭氧發(fā)酵的酒醅中篩選出的優(yōu)勢(shì)菌為解淀粉芽孢桿菌（）。

圖3 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

本研究涉及了一種全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)（VITEK 2 Compact），該鑒定系統(tǒng)通過(guò)改良后的氧化、水解等生化反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的鑒定和藥敏試驗(yàn)。其自動(dòng)化程度高，與PCR 檢測(cè)技術(shù)、API 鑒定系統(tǒng)鑒定出的結(jié)果具有較高的符合率，具有快速、高效及較高的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和安全性等特點(diǎn)，因此可廣泛應(yīng)用于食品中各類微生物的鑒定分析。

醬香型白酒共經(jīng)歷兩次投料（下沙、糙沙）、九次蒸煮、八次發(fā)酵以及七次蒸餾取酒，受到發(fā)酵溫度、酒醅中水分含量、酸度及糊化程度等影響，不同輪次酒醅中的微生物多樣性存在一定的差異性。在這復(fù)雜的工藝過(guò)程中，酒醅中的微生物資源豐富，芽孢桿菌屬（）、片球菌屬（）、乳桿菌屬（）、梭形桿菌屬（）、假絲酵母屬（）、曲霉屬（）等微生物迅速生長(zhǎng)繁殖，成為優(yōu)勢(shì)微生物，對(duì)醬香型白酒產(chǎn)品良好品質(zhì)的形成具有重要意義。

芽孢桿菌作為酒醅中的主導(dǎo)功能性細(xì)菌，在不同輪次酒醅中呈先上升后下降，最后趨于穩(wěn)定的變化趨勢(shì)。該菌屬對(duì)醬香型白酒品質(zhì)的影響主要體現(xiàn)在其代謝產(chǎn)生的蛋白酶、淀粉酶等多種酶類能將酒醅中豐富的蛋白質(zhì)、糖類等大分子物質(zhì)水解成多種風(fēng)味前體物質(zhì)，在改善產(chǎn)品風(fēng)味的同時(shí)賦予其獨(dú)特的風(fēng)味特征。羅建超等從大曲中分離篩選的解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等產(chǎn)香菌，其代謝產(chǎn)物有2,6-二甲基吡嗪、β-苯乙醇、3-羥基-2-丁酮和異戊酸等10種風(fēng)味物質(zhì)。

解淀粉芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬的一種，無(wú)毒無(wú)害，對(duì)抗生素敏感，具有良好的乙醇、牛膽汁耐受能力，能分泌木聚糖酶、β-葡聚糖酶、淀粉酶等多種酶類及胞外多糖，在促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收、抑制病原菌、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用。為了改善白酒中典型風(fēng)味物質(zhì)減少這一現(xiàn)象，有學(xué)者將篩選到的解淀粉芽孢桿菌作為發(fā)酵劑接種至冷卻后的蒸糧中堆積發(fā)酵一定時(shí)間后，發(fā)酵初期芽孢桿菌的相對(duì)豐度從82.14%增加到88.47%,與對(duì)照組相比，酒醅和白酒中的四甲基吡嗪含量分別增加了26倍和24 倍,該物質(zhì)不僅是一種含氮雜環(huán)化合物，賦予白酒焦糊和烤芝麻香氣，它還是具有多種生物活性的潛在功能成分。結(jié)合感官分析，得出解淀粉芽孢桿菌在增強(qiáng)白酒香氣的同時(shí)還具有改善產(chǎn)品質(zhì)量等作用。此外，某些極端環(huán)境條件有利于芽孢桿菌的生長(zhǎng)繁殖，因此該菌在工業(yè)酶制劑生產(chǎn)方面也具有廣大的應(yīng)用前景。

本研究從七輪次混合的酒醅中分離篩選到了一株產(chǎn)香芽孢桿菌，通過(guò)觀察該菌在LB 固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)特征，結(jié)合全自動(dòng)微生物生理生化鑒定系統(tǒng)及分子生物學(xué)等鑒定方法，最終確定該菌株為解淀粉芽孢桿菌（）。目前，已有研究證明該菌對(duì)白酒風(fēng)味具有貢獻(xiàn)作用，因此，將其作為發(fā)酵劑按照相應(yīng)比例添加至白酒中進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定并分析其與未接種發(fā)酵劑的白酒相比風(fēng)味成分的差異，初步建立了解淀粉芽孢桿菌與白酒風(fēng)味物質(zhì)間的聯(lián)系。同時(shí)可進(jìn)一步研究剖析該菌的發(fā)酵性能及其代謝途徑，了解該菌對(duì)白酒品質(zhì)的具體作用機(jī)制，在此基礎(chǔ)上，將其作為功能發(fā)酵劑對(duì)調(diào)控各類白酒風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)等品質(zhì)具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>