大瀧六線(xiàn)魚(yú)精巢支持細(xì)胞分離培養(yǎng)體系的建立和優(yōu)化?

王旭亮， 彭美婷， 趙 茜， 牛晶晶， 齊 潔,2??

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院, 海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266003; 2. 中國(guó)海洋大學(xué)三亞海洋研究院， 熱帶海洋生物種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)與種業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室， 海南 三亞 572000)

支持細(xì)胞是精巢中不可或缺的一類(lèi)重要細(xì)胞，在生物體的精巢生長(zhǎng)發(fā)育和精子發(fā)生過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用，并且可以促進(jìn)精原干細(xì)胞的維持與自我更新[1]。在成熟精巢中，支持細(xì)胞的數(shù)量影響了生殖細(xì)胞和精子的數(shù)量[2]。支持細(xì)胞呈不規(guī)則的多邊形，四周有很多形態(tài)各異的凹陷，生殖細(xì)胞多附著于凹陷中。在體外單獨(dú)培養(yǎng)精原細(xì)胞往往不易成活，但將支持細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞與之共同培養(yǎng)時(shí)，可促進(jìn)精原細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖[3-4]。這是由于支持細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中含有大量的細(xì)胞器，如線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等[5]，這些細(xì)胞器可為精原細(xì)胞提供自我更新和維持過(guò)程中所需的多種因子，包括轉(zhuǎn)鐵蛋白、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF2)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)和白血病抑制因子(LIF)等[6-15]。此外，相鄰的支持細(xì)胞間通過(guò)緊密連接的形式構(gòu)成血睪屏障(BTB)，其外質(zhì)特化結(jié)構(gòu)可維持細(xì)胞之間的連接，促進(jìn)精原細(xì)胞黏附于支持細(xì)胞上[16-21]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)支持細(xì)胞的研究報(bào)道大多數(shù)集中在哺乳動(dòng)物上，在鼠、兔、牛和羊中已經(jīng)報(bào)道了精巢支持細(xì)胞的分離、純化及培養(yǎng)方法[22-25]。魚(yú)類(lèi)中，在尼羅羅非魚(yú)、褐牙鲆和暗色頜須鮈中已有精巢支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)研究，而其他魚(yú)類(lèi)中關(guān)于精巢支持細(xì)胞的研究較少[26-28]。

大瀧六線(xiàn)魚(yú)(Hexagrammosotakii)是中國(guó)北方特有的海水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)之一，因其懷卵量少、魚(yú)卵具有高黏性以及遇到海水后極易黏結(jié)成團(tuán)塊狀等特性，導(dǎo)致其人工授精與孵化存在著諸多困難[29]。通過(guò)移植大瀧六線(xiàn)魚(yú)的精原細(xì)胞至種內(nèi)或種間受體魚(yú)可能是解決大瀧六線(xiàn)魚(yú)大規(guī)模繁育的方法之一。本研究對(duì)大瀧六線(xiàn)魚(yú)精巢支持細(xì)胞進(jìn)行了分離、體外培養(yǎng)和鑒定，以期為建立其支持細(xì)胞的細(xì)胞系奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為其精原細(xì)胞穩(wěn)定的體外培養(yǎng)環(huán)境提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來(lái)源與取樣

本實(shí)驗(yàn)選取健康、生長(zhǎng)狀態(tài)良好且處于精原細(xì)胞增殖期的大瀧六線(xiàn)魚(yú)(體長(zhǎng)12～18 cm，體質(zhì)量40～60 g)，用濃度100 mg/L的MS-222麻醉劑將大瀧六線(xiàn)魚(yú)麻醉10 min后，對(duì)其進(jìn)行斷椎處理，從泄殖孔剖開(kāi)腹腔后取出精巢并將其放于含20%三抗(青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合溶液)的PBS緩沖液(1 L配方：8.5 g NaCl、2.684 g Na2HPO4·12H2O、0.39 g NaH2PO4·2H2O，pH=7.4)中浸泡除菌10 min。

1.2 大瀧六線(xiàn)魚(yú)精巢支持細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)

用含10%三抗(青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合溶液，其中青霉素含量為10 mg/mL，鏈霉素含量為10 mg/mL，兩性霉素B含量為25 μg/mL)的PBS緩沖液將解剖獲得的精巢清洗5～6次，徹底去除精巢外部的結(jié)締組織及血塊；取適量精巢組織放入含有1 mL無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，剪成1 mm3左右的組織塊；并用直徑0.4 μm的篩網(wǎng)將組織塊與精子、其他游離的細(xì)胞以及細(xì)胞碎片分離；然后用無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)組織塊進(jìn)行清洗，清洗2次后暫存于無(wú)血清培養(yǎng)基中備用。

1.2.1 組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng) 將組織塊均勻鋪在培養(yǎng)瓶中，靜置待組織塊固定后，向培養(yǎng)瓶中無(wú)組織塊的一側(cè)加入培養(yǎng)基，在組織塊不接觸培養(yǎng)基的條件下倒置4 h使組織塊黏附在培養(yǎng)瓶中，隨后將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)使組織浸入培養(yǎng)基，在無(wú)CO2、24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待組織周?chē)屑?xì)胞呈放射狀遷出后，更換培養(yǎng)基，此后每3天進(jìn)行1次換液。

1.2.2 酶解法原代培養(yǎng) 將收集的組織塊放于含1 mg/mL膠原酶Ⅳ的無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在24 ℃條件下?lián)u晃酶解2 h，期間通過(guò)鏡檢觀(guān)察酶解程度，待大多數(shù)組織被酶解成單個(gè)細(xì)胞后，加入胎牛血清(FBS)終止酶解反應(yīng)，用移液槍將酶解后的細(xì)胞團(tuán)吹散。然后向培養(yǎng)瓶中加入適量的培養(yǎng)基，放于24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，更換新的培養(yǎng)基，此后每3天進(jìn)行1次換液。

1.3 不同培養(yǎng)基對(duì)支持細(xì)胞原代培養(yǎng)的影響

1.3.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)支持細(xì)胞原代培養(yǎng)的影響 分別使用L-15、DMEM/F12和DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行支持細(xì)胞原代培養(yǎng)，24 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，觀(guān)察不同培養(yǎng)基中細(xì)胞的遷出和貼壁狀態(tài)。

1.3.2 胎牛血清(FBS)濃度和生長(zhǎng)因子對(duì)支持細(xì)胞原代培養(yǎng)的影響 在含有不同濃度FBS的L-15培養(yǎng)基中，添加0.1 mmol/L非必需氨基酸(BioInd)或1%魚(yú)胚胎提取液，24 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后觀(guān)察細(xì)胞的遷出和貼壁狀態(tài)。

魚(yú)胚胎提取液的制備：取大瀧六線(xiàn)魚(yú)桑椹胚或囊胚時(shí)期的胚胎，經(jīng)過(guò)3次反復(fù)低溫凍融(-80 ℃)，4 000 r/s離心5 min，吸取上清液并通過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌獲得魚(yú)胚胎提取液。

1.4 大瀧六線(xiàn)魚(yú)精巢支持細(xì)胞傳代培養(yǎng)

待細(xì)胞的貼壁率達(dá)到75%以上時(shí)，可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。首先，棄去原有培養(yǎng)基，使用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基或PBS緩沖液清洗貼壁細(xì)胞2次，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶室溫酶解5 min后，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶使細(xì)胞脫落。待細(xì)胞懸浮后，加入1 mL FBS終止酶解反應(yīng)；然后，用移液槍將細(xì)胞團(tuán)吹打成單細(xì)胞，再加入適量新鮮培養(yǎng)基，于24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d進(jìn)行1次換液。

1.5 大瀧六線(xiàn)魚(yú)精巢支持細(xì)胞的染色鑒定

使用BCIP/NBT堿性磷酸酶染色試劑盒(Beyotime)對(duì)貼壁的細(xì)胞進(jìn)行染色(染色方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)，其中干性的細(xì)胞會(huì)被染成紫色，非干性的細(xì)胞無(wú)法被染色，從而可以鑒定貼壁細(xì)胞是否為支持細(xì)胞，同時(shí)以干性的精原細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.6 大瀧六線(xiàn)魚(yú)精巢支持細(xì)胞的分子鑒定

通過(guò)TRIzol法提取支持細(xì)胞總RNA，利用PrimeScript RT reagent Kit(Taraka)合成cDNA用于qPCR檢測(cè)。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)大瀧六線(xiàn)魚(yú)wt1、plzf、vasa基因的特異性引物(見(jiàn)表1)，選用18SrRNA基因作為內(nèi)參，利用LightCycler 480 real-time PCR system(Roche)進(jìn)行qPCR檢測(cè)。反應(yīng)體系共20 μL，包括10 μL 2×SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ (Takara)、0.4 μL 10 nmol/L正反向引物、2 μL 5 ng/μL模板cDNA和7.2 μL滅菌DEPC水。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)；每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt的方法，通過(guò)SPSS 14.0軟件對(duì)進(jìn)行顯著性分析，P<0.05時(shí)表明具有顯著性差異。

表1 本研究中所用到的引物序列

1.7 支持細(xì)胞增殖曲線(xiàn)的繪制

利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，即5個(gè)中方格細(xì)胞數(shù)總和÷稀釋倍數(shù)×103=1 mL的細(xì)胞總數(shù)。將懸液細(xì)胞數(shù)量控制在104個(gè)/mL左右，在24孔板中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每2 d更換1次培養(yǎng)基，每天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，連續(xù)統(tǒng)計(jì)6 d，繪制細(xì)胞增殖曲線(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 大瀧六線(xiàn)魚(yú)精巢支持細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)

2.1.1 組織塊培養(yǎng)法對(duì)原代精巢支持細(xì)胞遷出的最適培養(yǎng)條件篩選

2.1.1.1 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)原代精巢支持細(xì)胞遷出的影響 通過(guò)組織塊培養(yǎng)法分離獲得的支持細(xì)胞在L-15、DMEM/F12和DMEM 3種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中均從第三天開(kāi)始遷出。7 d后，組織塊周?chē)霈F(xiàn)小面積的生長(zhǎng)暈，如圖1所示。比較細(xì)胞遷出結(jié)果可知L-15基礎(chǔ)培養(yǎng)基(見(jiàn)圖1A)為大瀧六線(xiàn)魚(yú)組織塊培養(yǎng)法精巢支持細(xì)胞原代培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基，其細(xì)胞遷出的數(shù)量和范圍均遠(yuǎn)高于另外2種培養(yǎng)基(見(jiàn)圖1B、C)。

2.1.1.2 FBS濃度和生長(zhǎng)因子對(duì)原代精巢支持細(xì)胞遷出的影響 為探究不同濃度FBS對(duì)原代精巢支持細(xì)胞遷出的影響，向L-15培養(yǎng)基中分別添加5%和10%的FBS，結(jié)果顯示添加FBS有利于原代精巢支持細(xì)胞的遷出，F(xiàn)BS添加組(見(jiàn)圖2B、C)相對(duì)未添加組(見(jiàn)圖2A)的細(xì)胞遷出效果更好，其中添加10% FBS促進(jìn)細(xì)胞遷出效果最佳。此外，在含10% FBS的基礎(chǔ)上再添加0.1 mmol/L非必需氨基酸(見(jiàn)圖2E)或1%魚(yú)胚胎提取液(見(jiàn)圖2H)可進(jìn)一步促進(jìn)原代精巢支持細(xì)胞的遷出。

(A：L15培養(yǎng)基；B：DMEM//F12培養(yǎng)基；C：DMEM培養(yǎng)基。比例尺：100 μm。A: L15; B: DMEM/F12; C: DMEM. Scale bar: 100 μm.)

(A、D、G: 無(wú)血清添加；B、E、H：添加10% FBS；C、F、I：添加15%FBS；A、B、C：未添加血清外其他成分；D、E、F：添加0.1 mmol/L所有類(lèi)型非必需氨基酸；G、H、I：添加1%魚(yú)胚胎提取液。比例尺：100 μm。A, D, G: no serum added; B, E, H: 10% FBS added; C, F, I: 15% FBS added; A, B, C: no other components except serum added; D, E, F: 0.1 mmol/L each non-essential amino acid added; G, H, I: 1% extracting solution from fish embryos added. Scale bar: 100 μm.)

2.1.2 酶解法對(duì)原代精巢支持細(xì)胞最適培養(yǎng)條件的篩選 根據(jù)組織塊培養(yǎng)法實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)培養(yǎng)基類(lèi)型和FBS添加濃度進(jìn)行調(diào)整，酶解法培養(yǎng)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)選取L-15、DMEM/F12和M199 3種培養(yǎng)基，然后將5%和10% FBS分別添加到每種培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7 d后的細(xì)胞貼壁數(shù)量和狀態(tài)如圖3所示。對(duì)各組結(jié)果進(jìn)行比較表明含10% FBS的L-15培養(yǎng)基同樣適合酶解法分離的精巢支持細(xì)胞的原代培養(yǎng)。

(A、B：L-15；C、D: DMEM/F12；E、F: M199；A、C、E：添加5%FBS；B、D、F：添加10%FBS。比例尺：100 μm。A, B: L-15; C, D: DMEM/F12; E, F: M199； A, C, E: 5% FBS added; B, D, F: 10% FBS added. Scale bar: 100 μm.)

2.2 大瀧六線(xiàn)魚(yú)精巢支持細(xì)胞的鑒定

2.2.1 精巢支持細(xì)胞的形態(tài)觀(guān)察 用篩選的最適培養(yǎng)基(L-15)對(duì)大瀧六線(xiàn)魚(yú)精巢支持細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，在細(xì)胞貼壁率達(dá)到75%以上時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并對(duì)2種方法分離培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀(guān)察。結(jié)果顯示組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)多樣，表明除支持細(xì)胞外，還存在梭形的成纖維細(xì)胞和少量圓形的生殖細(xì)胞(見(jiàn)圖4A)；酶解法分離培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)單一，呈現(xiàn)不規(guī)則多邊形，并未出現(xiàn)其他類(lèi)型的細(xì)胞(見(jiàn)圖4B)。因此，利用酶解法分離培養(yǎng)獲得精巢支持細(xì)胞純度更高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(A：組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)的精巢支持細(xì)胞；B：酶解法分離培養(yǎng)的精巢支持細(xì)胞。比例尺：100 μm。A: Sertoli cells isolated and cultured by explanted tissue culture method； B: Sertoli cells isolated and cultured by enzyme digestion culture method. Scale bar: 100 μm.)

2.2.2 酶解法遷出的精巢支持細(xì)胞的染色鑒定 通過(guò)堿性磷酸酶染色來(lái)檢測(cè)酶解法分離并培養(yǎng)的精巢支持細(xì)胞是否存在精原細(xì)胞。結(jié)果顯示，酶解法分離和培養(yǎng)的精巢支持細(xì)胞未被染成紫色(見(jiàn)圖5A)，而具有精原細(xì)胞的對(duì)照組則被染成深紫色(見(jiàn)圖5B)，表明培養(yǎng)的細(xì)胞中不存在干性的精原細(xì)胞。

(A：支持細(xì)胞堿性磷酸酶染色結(jié)果；B：精原細(xì)胞堿性磷酸酶染色結(jié)果。比例尺：50 μm。A: Sertoli cells staining; B: Spermatogonia staining. Scale bar: 50 μm.)

2.2.3 酶解法遷出的精巢支持細(xì)胞的分子鑒定 利用精巢不同類(lèi)型細(xì)胞的標(biāo)記基因?qū)γ附夥ǚ蛛x和培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果顯示生殖細(xì)胞標(biāo)記基因plzf、vasa幾乎不表達(dá)，而支持細(xì)胞標(biāo)記基因wt1高表達(dá)，因此wt1表達(dá)水平顯著高于plzf和vasa，這說(shuō)明可通過(guò)酶解法來(lái)分離培養(yǎng)獲得純度較高的大瀧六線(xiàn)魚(yú)精巢支持細(xì)胞(見(jiàn)圖6)。

圖6 wt1、vasa和plzf基因在酶解法分離培養(yǎng)的 精巢支持細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.3 大瀧六線(xiàn)魚(yú)精巢支持細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

對(duì)穩(wěn)定傳代的精巢支持細(xì)胞進(jìn)行了生長(zhǎng)周期測(cè)定，結(jié)果顯示：在接種的初級(jí)階段(1～3 d)，細(xì)胞快速增殖，細(xì)胞數(shù)目急劇增加；在中間階段(3～4 d)，細(xì)胞的增殖速度放緩，細(xì)胞數(shù)目穩(wěn)定上升；在接種后第四天，細(xì)胞有衰退跡象，但數(shù)目維持穩(wěn)定；接種后第五天，細(xì)胞進(jìn)入衰退期(見(jiàn)圖7)。

圖7 大瀧六線(xiàn)魚(yú)精巢支持細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

3 討論

3.1 支持細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法

獲取原代支持細(xì)胞一般采用胰蛋白酶消化法和差速貼壁法[30]。本研究中，采用了2種方法獲取原代細(xì)胞：組織塊培養(yǎng)法和酶解法。用組織塊培養(yǎng)法遷出的細(xì)胞中雖然大部分都是支持細(xì)胞，但還存在一些成纖維細(xì)胞及生殖細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)后期很難將除支持細(xì)胞外的其他細(xì)胞去除，而酶解法得到的細(xì)胞類(lèi)型比較單一，所以酶解法是獲取高純度支持細(xì)胞的最優(yōu)方法。

在哺乳動(dòng)物精巢支持細(xì)胞系建立的過(guò)程中，多采用胰蛋白酶對(duì)精巢組織進(jìn)行酶解消化。針對(duì)魚(yú)類(lèi)細(xì)胞通常較為脆弱這一特點(diǎn)，本文作者使用膠原酶Ⅳ對(duì)精巢組織塊進(jìn)行酶解消化，相較于胰蛋白酶酶解消化，膠原酶酶解消化組織更溫和，酶解消化后分離的細(xì)胞損傷更小，所獲得的細(xì)胞在24 h后的貼壁率可以達(dá)到95%以上。此時(shí)使用差速貼壁法除去原培養(yǎng)基中的懸浮細(xì)胞，并用1×PBS緩沖液清洗貼壁細(xì)胞2次，更換培養(yǎng)基，除去生殖細(xì)胞來(lái)進(jìn)一步純化分離的細(xì)胞，從而提高培養(yǎng)細(xì)胞的純度。

3.2 不同培養(yǎng)基對(duì)原代細(xì)胞培養(yǎng)的影響

在細(xì)胞培養(yǎng)中，培養(yǎng)基的組成成分在細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖中起到重要作用。不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，不同的FBS濃度以及生長(zhǎng)因子的添加等都會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖產(chǎn)生影響。常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基有MEM、DMEM、DMEM/F12、M199和L-15等[31]。MEM是最基本的培養(yǎng)基，主要用于一些貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)；DMEM培養(yǎng)基是在MEM基礎(chǔ)上研制的，含有葡萄糖與各種氨基酸，常用于快速生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)。DMEM/F12與M199基礎(chǔ)培養(yǎng)基中雖然加入了HEPES作為緩沖劑，但在長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞的情況下，也會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)液pH顯著升高，而支持細(xì)胞在高pH的培養(yǎng)環(huán)境中難以貼壁，不利于細(xì)胞生長(zhǎng)。L-15培養(yǎng)基中除了添加HEPES作為緩沖劑外，還含有高濃度的氨基酸，同時(shí)使用半乳糖代替常用的葡萄糖，進(jìn)一步提高了培養(yǎng)基的緩沖能力，以解除pH變化較大不利于細(xì)胞培養(yǎng)的限制。由于L-15培養(yǎng)基的組成成分中沒(méi)有添加NaHCO3，因此不需要CO2作為緩沖，本實(shí)驗(yàn)的大瀧六線(xiàn)魚(yú)精巢支持細(xì)胞在L-15培養(yǎng)基且無(wú)CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中因長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞培養(yǎng)而升高的pH可用培養(yǎng)基中的丙酮酸代謝產(chǎn)生CO2來(lái)平衡。

細(xì)胞培養(yǎng)中必須添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或生長(zhǎng)因子等才能使細(xì)胞正常生長(zhǎng)與增殖。培養(yǎng)基需要添加一定濃度的血清，血清濃度依據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞種類(lèi)而定。目前廣泛使用的血清主要為馬血清和胎牛血清(FBS)。馬血清常用于有絲分裂后的神經(jīng)元培養(yǎng)，即使其濃度較高，也能促進(jìn)細(xì)胞的分化；FBS常用于培養(yǎng)增殖細(xì)胞，也可用于多種細(xì)胞系的傳代培養(yǎng)和細(xì)胞的原代培養(yǎng)。在大鼠睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)中，采用的FBS濃度為20%[32]，而在本研究中發(fā)現(xiàn)，較低濃度的FBS(10%)更適用于硬骨魚(yú)支持細(xì)胞的培養(yǎng)，因此推測(cè)這可能與加入FBS后培養(yǎng)基的微環(huán)境改變(pH及滲透壓)相關(guān)。綜上篩選出大瀧六線(xiàn)魚(yú)精巢支持細(xì)胞的最優(yōu)培養(yǎng)基，即添加0.1 mmol/L非必需氨基酸或1%魚(yú)胚胎提取液且含10% FBS的L-15培養(yǎng)基。

3.3 支持細(xì)胞的鑒定

由于在精原細(xì)胞的體外培養(yǎng)中，支持細(xì)胞通常作為滋養(yǎng)層細(xì)胞，所以對(duì)支持細(xì)胞類(lèi)型的鑒定尤為重要。在小鼠中，已有研究表明wt1基因可在未成熟的支持細(xì)胞中表達(dá)，且一直持續(xù)表達(dá)至支持細(xì)胞成熟后，是廣泛應(yīng)用的支持細(xì)胞標(biāo)記基因[33]；除了分子標(biāo)記鑒定外，還可以通過(guò)細(xì)胞染色的方法對(duì)支持細(xì)胞的純度進(jìn)行鑒定[34]。通過(guò)羅丹明123染色可觀(guān)察到支持細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中線(xiàn)粒體的含量較高，這與其分泌的能力強(qiáng)相關(guān)；同時(shí)用堿性磷酸酶染色，支持細(xì)胞呈陰性，未被染成紫色。這些方法都能對(duì)支持細(xì)胞進(jìn)行有效的分離和鑒定[35]。

在本研究采用了形態(tài)觀(guān)察、細(xì)胞干性染色及分子標(biāo)記基因表達(dá)等方法對(duì)分離出的細(xì)胞進(jìn)行了鑒定。分離的細(xì)胞具有與大鼠睪丸支持細(xì)胞相同的多邊形上皮樣細(xì)胞形態(tài)[36]，同時(shí)通過(guò)細(xì)胞堿性磷酸酶染色顯示細(xì)胞中沒(méi)有包含具有干性的精原細(xì)胞，并且分離的細(xì)胞中大量表達(dá)支持細(xì)胞的標(biāo)記基因wt1，這些試驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)中所分離和培養(yǎng)的細(xì)胞是大瀧六線(xiàn)魚(yú)精巢支持細(xì)胞。