血清腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)在原發(fā)性肝癌診斷中的價(jià)值研究

楊 結(jié)，謝萬(wàn)珍，劉樹業(yè)

原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）是全世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率高，死亡率高，也是癌癥死亡的常見原因之一，其發(fā)病率在消化系統(tǒng)的惡性疾病中居于第3位，僅次于胃癌及食管癌[1]。PLC病情進(jìn)展快，臨床治療預(yù)后差，病死率高，每年大約有84萬(wàn)例肝癌新發(fā)患者，至少有78萬(wàn)人死于肝癌[2]。目前治療肝癌的方法以手術(shù)治療為主和結(jié)合介入治療、局部治療以及放化療為輔的多學(xué)科治療[3]，但由于肝癌患者被診斷時(shí)往往已發(fā)展為肝癌晚期，腫瘤解剖位置不佳、腫瘤過(guò)大、原發(fā)腫瘤數(shù)量多和肝外轉(zhuǎn)移使其錯(cuò)過(guò)了最佳治療的時(shí)機(jī)，預(yù)后往往很差[4]。因此，為實(shí)現(xiàn)早診斷早治療，提高患者的生存率及生活質(zhì)量，尋找早期診斷的方法就顯得尤為重要。

肝癌的早期診斷包括病理、影像學(xué)、血清腫瘤標(biāo)志物等手段，對(duì)于腫瘤體積較小的原發(fā)性肝癌患者，影像學(xué)檢查漏診率較高[5]；病理及臨床癥狀在人體內(nèi)的變化相對(duì)滯后，較血清標(biāo)志物水平變化要晚數(shù)月到半年以上，容易延誤病情；同時(shí)血清標(biāo)本具有采集方便，并且檢驗(yàn)過(guò)程操作簡(jiǎn)單、快速，費(fèi)用低的優(yōu)勢(shì)，故而近年來(lái)，血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)越來(lái)越多地運(yùn)用到臨床及科研中[6]。因此，血清標(biāo)志物為肝癌的早期診斷提供了更多的參考指標(biāo)[7]。甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)是最常用的血清腫瘤標(biāo)志物，在肝癌的早期診斷和療效評(píng)估上也有極其重要的作用，但仍有接近35%的PLC患者AFP檢測(cè)結(jié)果呈陰性，其單項(xiàng)檢測(cè)的敏感性和準(zhǔn)確度還不能滿足臨床需要[8]。近年來(lái)，腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)已經(jīng)逐漸應(yīng)用到了腫瘤的診斷。AFP與其他腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于惡性腫瘤疾病的診斷也成為了首選。本研究對(duì)血清中甲胎蛋白AFP、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、癌抗原199(cancer antigen 199，CA199)、癌抗原724(cancer antigen 724，CA724)及細(xì)胞周期素A2（cyclin A2，CCNA2）聯(lián)合檢測(cè)在原發(fā)性肝癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行探討，以期能為原發(fā)性肝癌的早期診斷提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取天津市第三中心醫(yī)院2020年10月—2021年3月收治的經(jīng)病理學(xué)和影像學(xué)明確診斷為PLC的患者72例為肝癌組，患者均為初次確診，并且之前未經(jīng)任何治療。另選取同期住院的良性肝病患者80例設(shè)為肝良性疾病組，80例健康體檢者為健康對(duì)照組。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 正常對(duì)照組納入、排除標(biāo)準(zhǔn) 年齡18～75歲，無(wú)惡性腫瘤，無(wú)呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病等慢性疾病。各項(xiàng)化驗(yàn)結(jié)果均在正常范圍內(nèi)。排除孕產(chǎn)婦、HIV陽(yáng)性、惡性腫瘤史。

1.2.2 肝癌疾病組納入、排除標(biāo)準(zhǔn) 年齡18～75歲，同時(shí)滿足以下條件：1)具有肝硬化及乙肝病毒(HBV)和/或丙肝病毒(HCV)感染(即HBV和/或HCV抗原陽(yáng)性)的證據(jù)；2)肝臟占位直徑≥2 cm，CT和MRI兩項(xiàng)影像學(xué)檢查中有一項(xiàng)顯示肝臟占位具有肝癌的典型特征。或者同時(shí)滿足以下條件：1)具有肝硬化以及HBV和/或HCV感染(即HBV和/或HCV抗原陽(yáng)性)的證據(jù)；2)如果肝臟占位直徑為1～2 cm，則需要CT和MRI兩項(xiàng)影像學(xué)檢查都顯示肝臟占位具有肝癌的典型特征；3)血清AFP≥400 μg/L持續(xù)1個(gè)月或≥200 μg/L持續(xù)2個(gè)月，并能排除其他原因引起的AFP升高，包括妊娠、生殖系胚胎源性腫瘤、活動(dòng)性肝病及繼發(fā)性肝癌等。或者典型的肝細(xì)胞癌影像學(xué)特征如下：同期多排CT掃描和/或動(dòng)態(tài)對(duì)比增強(qiáng)MRI檢查顯示肝臟占位在動(dòng)脈期快速不均質(zhì)血管強(qiáng)化而靜脈期或延遲期快速洗脫。

1.3 研究方法 所有患者均在治療前采集5 mL清晨空腹靜脈血，高速離心機(jī)3 500 r/min離心10 min，取上層血清，置于-20 ℃冰箱內(nèi)冷藏待檢。

CCNA2采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)，試劑盒是美國(guó)Abcam公司生產(chǎn)。AFP、CEA、CA199和CA724通過(guò)全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀羅氏e801及其配套試劑進(jìn)行檢測(cè)。正常參考范圍：1)AFP＜20 μg/L；2)CEA＜5 μg/L；3)CA199＜39 U/mL；4)CA724＜8.2 U/mL；5)CCNA2＜1295 pg/mL(注：本次數(shù)據(jù)經(jīng)ROC曲線分析所得的診斷點(diǎn))。若腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)數(shù)值高于上述正常參考值，則該項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。

聯(lián)合檢測(cè)任意一項(xiàng)陽(yáng)性即判斷為陽(yáng)性。敏感性=肝癌組檢測(cè)陽(yáng)性例數(shù)/肝癌組檢測(cè)總例數(shù)×100%，特異性=良性組檢測(cè)陰性例數(shù)/良性組檢測(cè)總例數(shù)×100%，準(zhǔn)確性= (肝癌組檢測(cè)陽(yáng)性例數(shù)+良性組檢測(cè)陰性例數(shù))/(肝癌組檢測(cè)總例數(shù)+良性組檢測(cè)總例數(shù))×100%。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組、肝良性疾病組及健康組血清腫瘤標(biāo)志物水平比較 肝癌組血清AFP、CEA、CA199、CA724及CCNA2水平均顯著高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；肝癌組血清中AFP及CCNA2水平均顯著高于肝良性疾病組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；肝癌組血清CEA、CA199及CA724水平與肝良性疾病組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 3組血清AFP、CEA、CA199、CA724與CCNA2水平比較

2.2 單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)原發(fā)性肝癌臨床診斷價(jià)值比較 血清腫瘤標(biāo)志物AFP+CEA、AFP+CEA+CA199、AFP+CEA+CA199+CA724及AFP+CEA+CA199+CA724+CCNA2聯(lián)合檢測(cè)肝癌的敏感性、準(zhǔn)確性與除AFP外的單項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)相比，均有所提高(P＜0.05)，其中AFP+CEA+CA199+CA724+CCNA2聯(lián)合檢測(cè)原發(fā)性肝癌的敏感性為63.2%、準(zhǔn)確性為 74.6%，特異性為77.5%，見表2。

表2 血清腫瘤標(biāo)志物單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)原發(fā)性肝癌臨床診斷價(jià)值比較

CA724單項(xiàng)檢測(cè)的敏感度為100%，明顯高于理論值。通過(guò)進(jìn)一步ROC曲線分析本次數(shù)，得到本次數(shù)據(jù)分析中CA724的診斷點(diǎn)為1.485 U/mL，即本研究所收集的肝癌患者血清中CA724的濃度水平接近100%未超過(guò)CA724的實(shí)驗(yàn)室參考值（＜8.2 U/mL），導(dǎo)致研究結(jié)果敏感度偏高。推斷可能原因?yàn)閿?shù)據(jù)收集覆蓋面不夠，導(dǎo)致結(jié)果有傾向化趨勢(shì)，另外可能由于本次研究涉及的CA724的臨床參考值范圍（＜8.2 U/mL）稍微偏高，導(dǎo)致單項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率偏高，以至于出現(xiàn)計(jì)算敏感度為100%的情況。

2.3 單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)ROC曲線分析 本研究中肝癌患者組血清 AFP、CEA、CA199、CA724與CCNA2各自單項(xiàng)檢測(cè)及分別組合檢測(cè)：包括AFP+CEA、AFP+CEA+CA 199、AFP+CEA+CA 199+CA 724及AFP+CEA+CA199+CA724+CCNA2聯(lián)合檢測(cè)對(duì)應(yīng)的ROC曲線下面積有明顯的上升趨勢(shì)，且聯(lián)合檢測(cè)的準(zhǔn)確度明顯高于CEA、CA99、CA724以及CCNA2各自單項(xiàng)檢測(cè)的準(zhǔn)確度。五種血清標(biāo)志物單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線見圖1，各檢測(cè)指標(biāo)及組合對(duì)應(yīng)的曲線下面積柱狀圖見圖2。

圖1 血清AFP、CEA、CA199、CA724和CCNA2聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線

圖2 血清AFP、CEA、CA199、CA724和CCNA2聯(lián)合檢測(cè)的曲線下面積

3 討論

原發(fā)性肝癌是常見的惡性腫瘤之一，55%以上的PLC患者當(dāng)出現(xiàn)典型的肝區(qū)疼痛等癥狀時(shí)[9]，已經(jīng)錯(cuò)過(guò)了最佳治療機(jī)會(huì)，且預(yù)后往往很差，因此PLC患者生存率的提高主要依賴于早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷及早期治療[10]。腫瘤標(biāo)志物是指腫瘤發(fā)生過(guò)程中由腫瘤細(xì)胞直接或間接合成、分泌或其它組織所產(chǎn)生的化學(xué)類物質(zhì)，是反映腫瘤存在的活性物質(zhì)，它們有些不存在于正常成人組織而僅見于胚胎組織，同時(shí)在腫瘤組織中的含量反而大大超過(guò)在正常組織里的含量，其在腫瘤的診斷、分類、預(yù)后判斷以及治療指導(dǎo)方面具有重要的臨床價(jià)值[11]。目前臨床通過(guò)檢測(cè)患者血清腫瘤標(biāo)志物來(lái)篩查和輔助診斷各種惡性腫瘤已經(jīng)受到越來(lái)越多的關(guān)注。理想的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)需要具備3個(gè)要素:敏感性高，盡早期檢測(cè)出腫瘤患者；特異性好，區(qū)別腫瘤與非腫瘤患者，并且具有器官特異性[12]。本研究對(duì)血清中AFP、CEA、CA199、CA724及CCNA2標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，以提高原發(fā)性肝癌的診斷率。

AFP 是起源于胚胎時(shí)期由卵黃囊合成的一種糖蛋白，在正常成年人的血清中含量極低。目前臨床上AFP在原發(fā)性肝癌早期診斷具有十分重要的作用，是目前臨床公認(rèn)的肝癌特異性診斷指標(biāo)[13]。也有研究表明，有些原發(fā)性肝癌并不分泌AFP，所以僅靠血清AFP的水平檢測(cè)原發(fā)性肝癌，會(huì)出現(xiàn)漏診的情況[14]。一般認(rèn)為，對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)肝癌患者來(lái)說(shuō)，血清AFP超過(guò)500 μg/L（大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室正常值為不超過(guò)20 μg/L）對(duì)PLC具有診斷性。然而，在接受篩查的患者中，PLC常在AFP處于更低水平時(shí)被診斷出[15]。Edoo等[16]研究表明，單項(xiàng)血清AFP檢測(cè)在PLC早期診斷中的敏感性僅為63.3%，而AFP與CEA及CA199聯(lián)合檢測(cè)的敏感度接近100%，提示AFP單項(xiàng)檢測(cè)的敏感性不足以滿足臨床需求。另有研究表明[17]，良性肝病患者體內(nèi)AFP表達(dá)可呈一過(guò)性升高，易出現(xiàn)假陽(yáng)性，使其臨床應(yīng)用受到限制。本研究結(jié)果顯示AFP單項(xiàng)檢測(cè)肝癌的敏感度為60.3%，而AFP與CEA及CA199聯(lián)合檢測(cè)的敏感度為72.3%。表明AFP單獨(dú)檢測(cè)的臨床敏感性不能滿足現(xiàn)有需求。

CEA是位于腫瘤細(xì)胞表面一種多糖蛋白復(fù)合物，是最早應(yīng)用于惡性腫瘤診斷的標(biāo)志物之一[18]。它屬于廣譜腫瘤標(biāo)志物，包括原發(fā)性肝癌在內(nèi)的多消化系統(tǒng)器官腫瘤中均可見CEA水平增高[19]。CEA主要經(jīng)消化系統(tǒng)代謝，正常在血清中含量較低，一般參考值范圍是0～5 μg/L，發(fā)生異常時(shí)可進(jìn)入血液循環(huán)，導(dǎo)致血清CEA水平升高[20]。肝癌患者CEA的表達(dá)與癌細(xì)胞數(shù)量、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)均密切相關(guān)，在大腸癌和胰腺癌等患者中CEA均有較高的陽(yáng)性檢出率[21]。有研究表明，血清CEA結(jié)合AFP、CA199的檢測(cè)可以克服單一檢測(cè)的不足，避免漏診和誤診，顯著提高PLC的陽(yáng)性檢測(cè)率[22]。本研究結(jié)果顯示CEA單項(xiàng)檢測(cè)肝癌的特異度為45%，準(zhǔn)確度為59.9%，而CEA與AFP、CA199、CA724及CCNA2聯(lián)合檢測(cè)的特異度為77.5%，準(zhǔn)確度為74.6%，相較于單項(xiàng)檢測(cè)診斷效果有了顯著提高。

CA199是消化系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞分泌的相關(guān)抗原，在消化系統(tǒng)腫瘤診斷中有較高的應(yīng)用價(jià)值。健康人血清CA199水平極低，常被用于診斷及監(jiān)測(cè)膽管細(xì)胞型肝癌，但其臨床價(jià)值目前也不限于肝細(xì)胞系統(tǒng)，還可以擴(kuò)展到胃腸道癌癥（如結(jié)腸直腸癌和食管癌）以及胃腸道以外的癌癥[23]。Kim等[24]研究表明CA199單項(xiàng)檢測(cè)升高的患者中76.6%并非為肝癌患者，提示CA199單項(xiàng)檢測(cè)不能滿足肝癌早期診斷的臨床需要。Chen等[25]研究表明，AFP與CA199聯(lián)合檢測(cè)有助于在組織學(xué)檢查前協(xié)助診斷肝細(xì)胞-膽囊癌，相較于CA199單項(xiàng)檢測(cè)敏感度和特異度都有所提高。本研究結(jié)果表明CA199單項(xiàng)檢測(cè)準(zhǔn)確度為62.1%，而CA199與AFP、CEA、CA724及CCNA2聯(lián)合檢測(cè)的診斷準(zhǔn)確度為74.6%，對(duì)肝癌診斷效果提升顯著。

CA724是一種黏蛋白樣高分子量糖蛋白，不僅存在于正常成人組織中,還可見于胚胎組織，其在正常人和良性疾病患者血清中的含量很低，是一種非特異性腫瘤標(biāo)志物，該分子在腫瘤組織中的含量會(huì)明顯增加且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組織里的含量，其異常升高可以對(duì)腫瘤的組織發(fā)生、細(xì)胞分化以及細(xì)胞功能的診斷提供科學(xué)依據(jù)[26]。CA724在原發(fā)性肝癌的早期診斷中也具有重要的臨床價(jià)值，但特異性較低，有研究表明，CA199、CEA和CA724可用作胃癌（GC）中的預(yù)后和監(jiān)測(cè)工具，它們?cè)谳^短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行聯(lián)合測(cè)量是提高胃癌預(yù)后監(jiān)測(cè)敏感度和特異性的最佳方法[27]。本研究結(jié)果表明，CA724對(duì)肝癌的單項(xiàng)檢測(cè)特異度僅為34.4%，準(zhǔn)確度為69.1%，而CA724與AFP、CEA、CA199及CCNA2聯(lián)合檢測(cè)的特異度為77.5%，準(zhǔn)確性為74.6%，由此可證明，聯(lián)合檢測(cè)對(duì)肝癌的診斷效能有顯著提升。

CCNA2是一種新型的肝癌血清標(biāo)志物，將其引入肝癌診斷的腫瘤標(biāo)志物組合之中，也是本研究的創(chuàng)新性之一。前期有研究得出CCNA2基因在HCC患者癌組織中表達(dá)水平上調(diào)，并可作為PLC預(yù)后不良的分子標(biāo)志物的結(jié)論[28]。本研究進(jìn)一步深入探究了血清CCNA2水平在肝癌診斷中的價(jià)值，同時(shí)進(jìn)一步研究了CCNA2與其他四項(xiàng)常用腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能。CCNA2是具有癌基因性質(zhì)的細(xì)胞周期蛋白，在許多腫瘤中都過(guò)度表達(dá)，CCNA2在人類腫瘤中的表達(dá)可以預(yù)示腫瘤的生物學(xué)行為和臨床結(jié)果[29]。Gao等[30]證明CCNA2在乳腺癌患者無(wú)轉(zhuǎn)移生存、無(wú)病生存、無(wú)復(fù)發(fā)生存和總體生存方面具有重要的預(yù)測(cè)能力。Chen等[31]研究表明ESRP1蛋白水平與Ki-67增殖指數(shù)相關(guān)（r=-0.521；P＜0.01），并且ESRP1過(guò)表達(dá)明顯抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)G1期阻滯CCAN2的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，血清CCNA2對(duì)于肝癌診斷的特異度為82.5%，相較于CEA、CA199、CA724的單項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果的特異性來(lái)說(shuō)，具備了明顯的優(yōu)勢(shì)，由此之后可以考慮將血清CCNA2納入肝癌臨床診斷常用的腫瘤標(biāo)志物組合中。但CCNA2對(duì)于肝癌檢測(cè)的敏感度僅為38.5%，準(zhǔn)確度為60.5%，而與其他四項(xiàng)組合檢測(cè)的敏感度為63.2%，準(zhǔn)確度為74.6%，可見聯(lián)合檢測(cè)之后對(duì)于肝癌的診斷敏感度和準(zhǔn)確度均有了明顯提高。

本研究比較3組血清腫瘤標(biāo)志物水平差異，結(jié)果顯示原發(fā)性肝癌組患者AFP、CEA、CA125、CA199、CCNA2五項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物水平均顯著高于健康組，這說(shuō)明五項(xiàng)血清中腫瘤標(biāo)志物均可作為原發(fā)性肝癌臨床診斷的生化指標(biāo)。然后比較五項(xiàng)血清腫瘤標(biāo)志物單獨(dú)檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)的敏感性、特異度與準(zhǔn)確性。五項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物單獨(dú)檢測(cè)時(shí)，大多特異性較高，但敏感性較低。而聯(lián)合檢測(cè)相較于單項(xiàng)檢測(cè)對(duì)于肝癌診斷來(lái)說(shuō)，能顯著提高敏感性。此結(jié)果說(shuō)明，聯(lián)合檢測(cè)能夠彌補(bǔ)單項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物的不足，提高原發(fā)性肝癌診斷的敏感性。然而，聯(lián)合檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)，由于聯(lián)合診斷模型的選擇，與單純AFP相比，可能在診斷敏感性方面有了很大提高，但診斷的特異性方面有所降低，導(dǎo)致ROC曲線下面積稍遜于AFP。因此，聯(lián)合檢測(cè)可能在肝癌患者篩查方面稍有優(yōu)勢(shì)。