miR-7-5p通過靶向抑制成纖維生長因子受體4影響膽囊癌細胞的增殖和遷移

李云超，孫占峰，蘇 彬，胡金朋，王振國，王月明

膽囊癌（GBC）是膽道系統(tǒng)惡性腫瘤中最具侵襲性的一種，因其臨床特征不明顯，缺乏有效的檢測和預后指標，診斷時往往已到疾病晚期，即使行GBC根治手術，預后仍不理想[1]。因此，研究GBC的發(fā)病機制具有十分重要的臨床意義。近年來的研究報告顯示，微小RNA（microRNA，miR）表達異常與腫瘤進展有關[2]，miR-197可以促進膽囊癌細胞增殖，抑制細胞凋亡[3]；miR-182促進膽囊癌上皮-間充質(zhì)轉化[4]；miR-204抑制膽囊癌細胞的增殖、侵襲和凋亡[5]。研究表明，成纖維生長因子受體（FGFR）高表達是膽囊癌的敏感的不良預后標志物[6]，miR-7-5p在多種癌癥中充當抑制腫瘤因子或抗癌基因[7]，miR-7-5p靶向結合FGFR4的3’-UTR，但其在膽囊癌中的作用尚不清楚[8]。本研究旨在闡明miR-7-5p在膽囊癌中的作用機制，以期為臨床相關研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 膽囊癌GBC-SD細胞及正常膽囊細胞購自上海中科院細胞庫，miR-7-5p、pmirGLO、FGFR4WT、FGFR4 MUT、miR-7-5p inhibitor、miR-7-5p mimics和mimics-NC由上海生工生物工程有限公司合成，F(xiàn)GFR4抗體購自美國abcam公司，MTT、Trizol及去RNA酶處理的物品購自美國sigma公司，RT-qPCR引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，Transwell小室、細胞培養(yǎng)板及計數(shù)板購自美國康寧公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶等細胞培養(yǎng)試劑購自美國Gibco公司，BCA蛋白試劑盒購自上海碧云天科技公司。其他試劑均由當?shù)卦噭┥烫峁?/p>

1.2 RT-qPCR檢測 使用Trizol提取總RNA，利用反轉錄試劑盒將引物（表1）得到cDNA鏈。以β-actin為內(nèi)參，定量PCR檢測miR-7-5p和FGFR4的表達水平。實驗重復3次，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進行分析。

表1 PCR引物序列及擴增產(chǎn)物大小

1.3 細胞培養(yǎng)及轉染 轉染miR-7-5p、對照（NC）和抑制劑（Inhibitor）進入GBC-SD細胞。根據(jù)細胞的密度進行換液或者傳代。每次傳代時，加入2.5 μg/mL嘌呤霉素繼續(xù)篩選穩(wěn)定的細胞株。72 h后將細胞一部分用于后續(xù)的RT-qPCR、Transwell、Western blotting等實驗，另一部分凍存保種。

1.4 雙熒光素酶檢測 生物信息學網(wǎng)站TargetScan用于預測FGFR4的目標mRNA。通過Creative Biogene克隆FGFR4 mRNA 3’-UTR靶序列。將FGFR4UTR的野生型（WT）/突變型（MUT）、miR-7-5p序列插入pmirGLO質(zhì)粒中，以建立重組熒光素酶報告質(zhì)粒（FGFR4 WT/FGFR4 MUT和miR-7-5p mimics）。分別將pmirGLO、FGFR4 WT、FGFR4 MUT、miR-7-5p mimics和mimics-NC分別轉染至293T細胞。孵育48 h后，使用雙重熒光素酶?報告基因檢測法檢測了293T細胞的螢火蟲和海藻熒光素酶活性。

1.5 MTT檢測 采用MTT法檢測GBC-SD細胞活性，取對數(shù)生長期的各組細胞計數(shù)（2×105個/mL）后接種于96孔板，每孔50 μL，每組設置3個復孔。培養(yǎng)12 h后，每孔加MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h，加150 μL DMSO終止反應，選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔吸光度值，記錄結果，連測48 h，以時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.6 Transwell實驗 取重懸各組細胞（1×104/mL）200 μL加入Transwell小室中，置于實驗孔中培養(yǎng)24 h；取出Transwell小室，PBS清洗后，利用棉簽擦去小室薄膜上層細胞后，結晶紫染色薄膜下層細胞后，置于顯微鏡下計數(shù)拍照。

1.7 Western blotting 取各組細胞提取的蛋白質(zhì)，BCA試劑盒測量樣品的總蛋白質(zhì)量，電泳分離后轉膜。將膜在4 ℃下用一抗孵育過夜：FGFR4抗體（1:1 000）、兔單抗 β-actin抗體（1:1 000）。然后將膜與二抗孵育2 h，TBST沖洗4次，用ECL plus檢測信號，用Image J軟件定量分析。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件處理實驗數(shù)據(jù)，Graphpad prism 5軟件繪圖，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；相關性分析采用Person相關；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 GBC-SD細胞中miR-7-5p、FGFR4表達情況 與正常膽囊細胞相比，GBC-SD細胞中miR-7-5p mRNA表達水平明顯降低，F(xiàn)GFR4 mRNA表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖1A、1B）；FGFR4蛋白表達量也高于正常膽囊細胞（0.15±0.07 vs.0.73±0.09；P＜0.01，圖1C）；且GBC-SD細胞中miR-7-5p mRNA表達水平與FGFR4 mRNA表達水平呈負相關（r=-0.036，P＜0.05，圖1D）。

圖1 GBC-SD細胞與正常膽囊細胞中miR-7-5p及FGFR4的mRNA和蛋白表達水平比較

2.2 miR-7-5p靶向作用FGFR4 經(jīng)過生物信息學網(wǎng)站TargetScan預測，miR-7-5p作為保守序列作用于人源FGFR4基因，作用位點見圖2A。雙重熒光素酶基因檢測系統(tǒng)結果顯示，與FGFR4 WT+mimics-NC組相比，F(xiàn)GFR4+miR-7-5p模擬組的熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），而且miR-7-5p的過表達對用pmirGLO MUT FGFR4 3’UTR轉染的細胞的螢光素酶活性無影響（圖2B）。

圖2 miR-7-5p靶向作用FGFR4

2.3 miR-7-5p靶向抑制FGFR4 表達 抑制miR-7-5p后，與對照組相比，GBC-SD細胞miR-7-5p mRNA表達水平明顯下降，F(xiàn)GFR4 mRNA及蛋白表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖3A、3B）；過表達miR-7-5p后，miR-7-5p mRNA表達水平明顯高于對照組和miR-7-5p抑制組，F(xiàn)GFR4 mRNA及蛋白表達水平明顯低于對照組和miR-7-5p抑制組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖3C、3D）。

圖3 miR-7-5p靶向抑制FGFR4表達

2.4 miR-7-5p過表達促進GBC-SD細胞增殖和侵襲 MTT實驗結果顯示，實驗48 h，miR-7-5p抑制組細胞增殖率明顯高于對照組[（2.31±0.09）%vs （2.06±0.06）%]，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），miR-7-5p過表達組細胞增殖率（1.87±0.06）%明顯低于其他兩組（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義（圖4A）。Transwell實驗結果顯示，miR-7-5p抑制組穿膜細胞數(shù)明高于對照組[（94.3±7.5）個vs （55.5±8.2）個]，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），miR-7-5p過表達組穿膜細胞數(shù)（28.7±2.5）個明顯低于其他兩組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖4B）。

圖4 MTT和Transwell實驗

3 討論

miRNAs的異常表達與人類惡性腫瘤的發(fā)生相關，其中miR-7-5p的上調(diào)在多種癌癥中表現(xiàn)出癌癥抑制作用[7,9-10]。在肝細胞肝癌中，miR-7-5p的上調(diào)可以通過靶向細胞分裂相關基因SPC24顯著抑制肝癌細胞的惡性行為[11]，miR-7-5p下調(diào)表皮生長因子受體（EGFR）表達，滅活PI3K/Akt信號通路，抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和微管形成，減少腫瘤形成和轉移[12]，miR-7-5p通過靶向神經(jīng)腫瘤腹側抗原2 （NOVA2）抑制非小細胞肺癌的腫瘤轉移[13]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-7-5p在GBC-SD細胞中的表達下調(diào)，提示作為抑癌基因的miR-7-5p可能參與了抑制GBC的腫瘤發(fā)生。細胞增殖試驗和Transwell試驗進一步證實miR-7-5p能抑制GBC-SD細胞增殖和侵襲。這些數(shù)據(jù)共同支持了miR-7-5p在GBC中充當腫瘤抑制miRNA的推斷。

FGFR4是成纖維細胞生長因子受體家族成員，被認為是一種癌蛋白。有研究證明miR-491-5p抑制某些癌癥的腫瘤生長并可以間接抑制FGFR4，從而削弱上皮間質(zhì)轉化（EMT）誘導的腫瘤遷移[14]。另一項研究表明，過表達的miR-29c-3p會減少KIAA1199（一種細胞遷移誘導蛋白）的分泌，隨后抑制EGFR和FGFR4/AKT通路激發(fā)的EMT效應[15]。因此，F(xiàn)GFR4已成為抑制癌癥發(fā)展的潛在目標。以往的研究中FGFR1-3 在許多實驗和臨床試驗中被證實是癌癥有希望的靶標。而與FGFR1-3相比，以FGFR4為靶點的小分子抑制劑的開發(fā)是近幾年才取得突破的。選擇性小分子FGFR4抑制劑BLU9931，在具有異常FGFR4 信號的肝細胞癌細胞中表現(xiàn)出顯著腫瘤抑制能力[16]。BLU9931在GBC的研究中可以顯著抑制FGFR4的表達，抑制GBC細胞的增殖和侵襲[17]。這些研究進一步證明，F(xiàn)GFR4是治療GBC有希望的靶點，具有十分重要的臨床意義。

有研究發(fā)現(xiàn)FGFR4是GBC不良預后的敏感生物標志物[6]，miR-7-5p可以直接與FGFR4的3’-UTR結合[8]。為了進一步明確miR-7-5p與FGFR4的關系，本研究通過生物信息學分析證明FGFR4作為miR-7-5p的靶點，并通過雙熒光素酶基因檢測進行這種相互作用的驗證，結果發(fā)現(xiàn)FGFR4UTR的野生型可以與miR-7-5p結合，顯著降低293T細胞的螢火蟲和海藻熒光素酶活性。而在本研究結果中，F(xiàn)GFR4在GBC-SD細胞中異常升高，并與miR-7-5p表達呈負相關。這些結果為miR-7-5p在GBC中靶向調(diào)節(jié)FGFR4提供了證據(jù)。FGFR4的遺傳畸變在各種類型的癌癥中普遍存在，例如乳腺癌、胰腺癌、肝細胞癌，而這些畸變通常與不良預后有關[18-19]。并且先前的研究結果一致表明，F(xiàn)GFR4畸變導致下游信號通路的失調(diào)，例如Wnt/β-catenin[20]、JAK/STAT[21]和PI3K-AKT[22]，從而導致癌細胞增殖和轉移潛力增強，引起癌癥進展。最近的研究表明，在肝癌進展中miR-7-5p可以通過Wnt、TGF-β和Ras信號通路靶向目的基因；而蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)網(wǎng)絡（PPI）分析表明，miR-7-5p的靶基因包括PIK3CA、AKT1、MYC、JUN 和SMAD4等[23]。上述研究結果表明，miR-7-5p與FGFR4在癌癥的發(fā)生發(fā)展中存在共同的下游信號通路。在本研究中，抑制miR-7-5p后FGFR4表達增加，GBCSD細胞的增殖侵襲能力增強。過表達miR-7-5p后FGFR4表達下降，GBC-SD細胞的增殖侵襲能力下降。這些結果進一步支持了miR-7-5p通過靶向抑制FGFR4來阻止GBC進展。