叢枝菌根真菌對(duì)玉米生育期土壤N2O排放的影響

張學(xué)林，何堂慶，張晨曦，田明慧，李曉立，吳梅，周亞男，郝曉峰

叢枝菌根真菌對(duì)玉米生育期土壤N2O排放的影響

張學(xué)林，何堂慶，張晨曦，田明慧，李曉立，吳梅，周亞男，郝曉峰

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/省部共建小麥玉米作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/2011河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450002

【目的】明確叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）影響玉米生育期土壤氧化亞氮（N2O）排放的機(jī)制，為增加玉米產(chǎn)量、提高氮素利用效率、減少溫室氣體排放提供理論依據(jù)。【方法】采用分室（生長(zhǎng)室和菌絲室）箱體裝置，盆栽設(shè)置氮肥用量（N1：180 kg N·hm-2；N2：360 kg N·hm-2）和叢枝菌根真菌（M0：作物根和AMF均不能從生長(zhǎng)室進(jìn)入菌絲室；M1：只有叢枝菌根真菌能從生長(zhǎng)室進(jìn)入菌絲室；M2：作物根和叢枝菌根真菌均能從生長(zhǎng)室進(jìn)入菌絲室）雙因素試驗(yàn)，測(cè)定玉米生長(zhǎng)期間植株生物量、植株氮素積累量、N2O排放量；采用Illumina平臺(tái)Hiseq 2500 PE250高通量測(cè)序技術(shù)分析土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性對(duì)叢枝菌根真菌的響應(yīng)?！窘Y(jié)果】氮肥用量和叢枝菌根真菌均顯著影響玉米產(chǎn)量、植株生物量、植株氮素積累量和N2O排放量。不同氮肥用量條件下接種叢枝菌根真菌均顯著增加玉米籽粒產(chǎn)量、植株生物量和氮素積累量。與M0相比，N1條件下M1和M2處理產(chǎn)量均值分別增加38%和82%，地上部氮素積累量增加30%和52%，無機(jī)氮含量減少26%和65%；N2條件下M1和M2處理籽粒產(chǎn)量分別增加16%和48%；地上部氮素積累量增加9%和33%，無機(jī)氮含量減少34%和55%。與M0相比， N1條件下M1和M2處理N2O累積排放量分別降低17%和40%，N2O排放強(qiáng)度分別降低41%和67%；而N2條件下N2O累積排放量降低26%和45%，排放強(qiáng)度分別降低28%和57%。NMDS 分析表明，施肥和叢枝菌根真菌均對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有較大影響。與N1均值相比，N2處理門水平變形菌門（Proteobacteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）相對(duì)豐度分別降低6%和15%，而放線菌門（Actinobacteria）增加32%；屬水平鏈霉菌（）增加27%，芽單胞菌屬（）降低8%。與M0相比，N1條件下M1和M2處理的分別增加64%和205%，細(xì)菌豐度分別增加31%和53%；N2條件下M1和M2處理的分別增加10%和93%，M1處理的細(xì)菌豐度降低2%，M2處理細(xì)菌豐度增加56%。土壤中和與N2O排放量呈顯著負(fù)相關(guān)，而與玉米產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)?！窘Y(jié)論】不同氮肥水平玉米接種叢枝菌根真菌均能顯著降低土壤N2O排放量，這種影響主要通過提高玉米氮素的吸收利用和改善土壤細(xì)菌群落組成實(shí)現(xiàn)的，其中主要增加了土壤鏈霉菌屬和芽單胞菌屬的相對(duì)豐度。

氮肥；叢枝菌根真菌；玉米；土壤氧化亞氮排放通量；土壤細(xì)菌

0 引言

【研究意義】氧化亞氮（N2O）是一種重要的溫室氣體，其溫室效應(yīng)約是CO2的298倍，對(duì)全球變暖的貢獻(xiàn)約占全部溫室氣體的5%—6%[1-2]；N2O還參與光化學(xué)反應(yīng)，破壞大氣臭氧層，增強(qiáng)紫外線輻射影響人體健康[3-5]。叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）能與地球上80%的植物包括各種作物形成叢枝菌根共生體，共生體不僅增強(qiáng)植物抗逆性，而且促進(jìn)宿主植物吸收土壤磷、氮等養(yǎng)分，提高產(chǎn)量[6-8]。明確叢枝菌根真菌在土壤N2O排放方面的作用，對(duì)于提高作物產(chǎn)量、減少氮素流失具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)叢枝菌根真菌對(duì)土壤N2O等溫室氣體排放方面的研究相對(duì)較少，研究結(jié)果也不一致。CAVAGNARO等[9]在田間原位條件下利用15N示蹤技術(shù)，以番茄突變體（不能被AMF侵染）和番茄野生型76R為材料，研究發(fā)現(xiàn)AMF顯著促進(jìn)了植物生長(zhǎng)和養(yǎng)分獲取，對(duì)N2O排放沒有影響。BENDER等[10-11]分別設(shè)置滅菌土壤播種多花黑麥草后接種AMF或不接種AMF、添加AMF菌劑的土壤種植番茄野生型或番茄突變體兩個(gè)完全不同的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)接種AMF主要通過增加微生物固持氮素和植株氮素吸收顯著降低N2O 的排放；LAZCANO等[12]采用盆栽試驗(yàn)，比較了不同含水量條件下野生型番茄和其突變體接種AMF后對(duì)N2O排放的影響，發(fā)現(xiàn)較高水分含量條件下AMF主要是提高了番茄水分利用效率，而不是促進(jìn)了氮素吸收所致。ZHANG等[13]把接種AMF的水稻秧苗移栽到大田后進(jìn)行原位測(cè)定，發(fā)現(xiàn)水稻田N2O排放通量降低。GUI等[14]利用分室箱體培養(yǎng)裝置，以玉米為寄主植物，發(fā)現(xiàn)AMF通過降低土壤全氮含量，改變氮代謝相關(guān)基因的豐度，降低與反硝化過程相關(guān)的細(xì)菌類群的豐度，從而降低了玉米土壤N2O的排放。AMF一方面可能通過促進(jìn)宿主植物側(cè)根的形成和伸長(zhǎng)，提高宿主對(duì)無機(jī)氮（NH4+）的吸收利用，降低轉(zhuǎn)化為N2O的底物濃度，減少N2O的排放[15-17]。另一方面AMF 可能通過改變根際土壤微生物群落組成，影響土壤硝化和反硝化過程，進(jìn)而調(diào)控N2O的排放[18]。土壤微生物尤其是細(xì)菌在陸地生態(tài)系統(tǒng)中負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)養(yǎng)分生物地球化學(xué)循環(huán)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性[19-21]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】針對(duì)AMF影響土壤N2O排放的機(jī)制，國(guó)內(nèi)外科研人員主要從菌根改善植株生長(zhǎng)和養(yǎng)分吸收入手，開展了大量研究[22-24]。土壤N2O排放是微生物介導(dǎo)的氮素生物地球化學(xué)循環(huán)過程[10,25]，其中細(xì)菌在氮素循環(huán)過程中的作用是研究的關(guān)鍵[3]。目前關(guān)于土壤細(xì)菌對(duì)AMF響應(yīng)的研究相對(duì)較少，AMF作用下細(xì)菌群落組成的變化與N2O排放之間的關(guān)系尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用盆栽試驗(yàn)，系統(tǒng)研究氮肥用量和叢枝菌根真菌交互作用對(duì)N2O排放的影響，分析土壤細(xì)菌群落組成對(duì)AMF的響應(yīng)以及細(xì)菌群落組成變化在調(diào)控N2O排放方面的作用，為充分發(fā)揮AMF在降低溫室氣體排放、減少氮素流失、提高作物產(chǎn)量和氮素利用效率方面的作用，進(jìn)而優(yōu)化生物肥料管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)和試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)于2016和2017年6—10月玉米生育期，在河南省西平縣二郎鄉(xiāng)張堯村（114°02′E，33°20′N，平均海拔49 m）進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，土壤類型為砂姜黑土。該地區(qū)處于黃淮海平原南部，屬于亞濕潤(rùn)大陸性季風(fēng)氣候，年平均氣溫15.2℃，無霜期220 d，年平均降雨量為852 mm。供試土壤取自于長(zhǎng)期定位試驗(yàn)不施肥處理0—20 cm的耕層，避光自然風(fēng)干后過2 mm篩備用。供試土壤基本理化性質(zhì)為：全氮2.76 g·kg-1，有機(jī)質(zhì)8.17 g·kg-1，堿解氮110 mg·kg-1，速效磷20 mg·kg-1，速效鉀330 mg·kg-1，pH 6.81，砂粒39.09%，粉（砂）粒21.35%，黏粒39.56%。

供試菌種為摩西斗管囊霉（），由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源研究所“AMF種質(zhì)資源庫”（Bank of glomeromycota in China，BGC）提供，以玉米為寄主植物進(jìn)行擴(kuò)繁，產(chǎn)生的菌劑包括相應(yīng)的培養(yǎng)基質(zhì)、孢子、根外菌絲以及植物根段等，其中菌劑孢子密度為30個(gè)/g。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)為氮肥用量和叢枝菌根真菌（AMF）雙因素設(shè)計(jì)，其中氮肥用量包括180 kg N·hm-2（N1）和360 kg N·hm-2（N2）兩個(gè)水平。試驗(yàn)采用有機(jī)玻璃做成的分室箱體培養(yǎng)裝置[25-26]，裝置規(guī)格為60 cm×20 cm×20 cm，中間用通透程度不同的隔板分成兩個(gè)隔室：一個(gè)為生長(zhǎng)室（HOST），用來種植宿主植物玉米，供試玉米品種為偉科702；另一個(gè)為菌絲室（TEST），接種AMF后用來測(cè)試菌根的功能。根據(jù)中間擋板薄膜通透性，將菌根因素分為3個(gè)水平，即對(duì)照（M0）：生長(zhǎng)室和菌絲室之間用網(wǎng)孔0.45 μm薄膜隔離，玉米根和AMF只能在生長(zhǎng)室生長(zhǎng)，不能通過擋板進(jìn)入菌絲室；AMF處理（M1）：生長(zhǎng)室和菌絲室之間用網(wǎng)孔20 μm薄膜隔開，只允許AMF菌絲通過擋板進(jìn)入菌絲室；有根有菌處理（M2）：生長(zhǎng)室和菌絲室之間用網(wǎng)孔0.46 cm尼龍網(wǎng)隔開，AMF和玉米根均可通過擋板進(jìn)入菌絲室。共計(jì)6個(gè)處理，4次重復(fù)。試驗(yàn)開始前，按照土壤2 000 t·hm-2，小麥秸稈全量還田為6 700 kg·hm-2，計(jì)算出每個(gè)箱體的秸稈還田量，小麥秸稈、風(fēng)干土與菌劑混合均勻后分布于箱體生長(zhǎng)室和菌絲室并調(diào)整土壤容重為1.2 g·cm-3，每個(gè)箱體風(fēng)干土總重為24 kg左右。玉米播種前挑選大小均勻一致的種子，用10 %的H2O2表面消毒，蒸餾水沖洗干凈后于每年6月10日播種，每個(gè)生長(zhǎng)室播種4粒種子，于三葉期留苗兩株。全部磷肥（90 kg·hm-2）和鉀肥（120 kg·hm-2）作為底肥于播種前與土壤充分混合施入，50%的氮肥于拔節(jié)期（播種后30 d）溶于蒸餾水追施，50%的氮肥于大喇叭口期（播種后60 d）溶于蒸餾水追施；玉米成熟期（10月5日）收獲，并進(jìn)行相關(guān)參數(shù)的測(cè)定分析。

1.3 樣品采集與測(cè)定

N2O采用密閉式靜態(tài)箱法采集。氣體采樣箱由箱體和底座組成。箱體為有機(jī)玻璃材質(zhì)的長(zhǎng)方體（規(guī)格為12 cm×12 cm×15 cm），箱體頂部安裝一個(gè)通氣閥；箱體底座（12 cm×12 cm×6 cm）上表面周圍有1 cm寬的凹槽。采集氣體時(shí)，首先將底座插入菌絲室土壤內(nèi)，在凹槽中加上水，然后罩上箱體，形成一個(gè)密閉環(huán)境，用20 mL針筒從通氣閥處抽取氣體樣品。播種后的第30、31、32、33、34、35、60、61、62、63、64、65、90、105天采集氣體樣品。一般于早上8：00罩上箱體，記錄箱體內(nèi)溫度，密封1 h后，每個(gè)處理采集50 mL氣體，裝入氣瓶帶入實(shí)驗(yàn)室，用日本島津氣相色譜儀GC-2010 測(cè)定N2O的濃度。

（1）N2O排放通量計(jì)算公式為：

F=×H×Δc/Δt×273/(273+T)

式中，F(xiàn)為N2O排放通量（μg·m-2·h-1）；為N2O標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下的密度（1.964 kg·m-3）；H為采樣箱高度（m）；Δc/Δt為單位時(shí)間靜態(tài)箱內(nèi)的N2O氣體濃度變化率（μg·L-1·h-1）；T為測(cè)定時(shí)箱體內(nèi)的平均溫度（℃）；

（2）N2O累積排放量計(jì)算公式為：

式中，M為N2O累積排放量（mg·m-2）；F為N2O排放通量μg·m-2·h-1；i為采樣次數(shù)；t為采樣時(shí)間（d）；24為一天小時(shí)數(shù)；

（3）N2O排放強(qiáng)度為：

I = M/Y×10

式中，I為N2O排放強(qiáng)度（kg·t-1），M為N2O累積排放量（mg·m-2），Y 為不同處理單位面積玉米籽粒平均產(chǎn)量（kg·hm-2）。

玉米收獲后測(cè)定籽粒產(chǎn)量，植株地上部和根系生物量用烘箱105℃殺青30 min后，70℃烘干至恒重并稱重。植株地上部和根系樣品粉碎后用H2SO4- H2O2消煮，流動(dòng)分析儀（AA3，SEAL-Analytical, Germany）測(cè)定全氮含量，并用植株生物量及其全氮含量計(jì)算玉米地上部和根系氮素積累量。采用流動(dòng)分析儀測(cè)定玉米成熟期菌絲室（TEST室）土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量；采用PHS-3E測(cè)定土壤pH，水土比為2.5﹕1。

1.4 DNA 提取、PCR擴(kuò)增、測(cè)序和信息分析

將2016年玉米成熟期相同處理菌絲室土壤混合均勻并隨機(jī)取土，采用CTAB 或SDS 方法對(duì)樣本的基因組DNA 進(jìn)行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng·μL-1。以稀釋后的基因組DNA 為模板，選擇鑒定細(xì)菌多樣性的16S V4區(qū)引物（515F和806R）測(cè)序區(qū)域，使用帶Barcode 的特異引物，New England Biolabs 公司的Phusion? High- Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，和高效高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，對(duì)目的條帶使用qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，由北京諾禾致源科技股份有限公司使用HiSeq 2500 PE250測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，進(jìn)行去雜、拼接、過濾以及去除嵌合體等，得到有效序列（Effective tags），利用Uparse軟件（Uparse v 7.0）對(duì)全部Effective Tags進(jìn)行聚類，按照97%的相似性劃分OTUs （Operatinal Taxonomic Units），同時(shí)選取OTUs出現(xiàn)頻率最高的序列作為OTUs的代表序列，并基于軟件Mothur（version 1. 36. 1）與SILVA（http://www.arb-silva.de/）的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8—1），獲得不同分類水平上各樣本的群落組成。使用MUSCLE（Version 3.8.31，http://www.drive5.com/ muscle/）軟件進(jìn)行快速多序列比對(duì)，得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。最后，以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理，后續(xù)的Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。采用Qiime軟件（Version 1.7.0）計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)如物種數(shù)（Observed-species），Chao1，香農(nóng)指數(shù)（Shannon），辛普森指數(shù)（Simpson），覆蓋度（Goods- coverage）等，其中Shannon 值越大說明物種的多樣性越大；Simpson值越大，說明物種的均勻度越大；Chao1與ACE值越高說明種群物種的豐富度越高。Beta多樣性分析采用Qiime軟件（Version 1.7.0）計(jì)算Unifrac距離、構(gòu)建UPGMA樣品聚類樹。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Two way ANOVA分析氮肥用量和菌根處理之間玉米籽粒產(chǎn)量、植株氮素積累量、N2O排放總量和排放強(qiáng)度的差異顯著性，并采用LSD進(jìn)行多重比較。采用One way ANOVA 比較不同處理之間土壤細(xì)菌α多樣性參數(shù)，如Species、OTU 數(shù)、Chao 1、Shannon和Simpson、Coverage。采用非度量多維尺度分析（non-metric multidimensional scaling，NMDS）確定細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)差異（R 語言，v 3.6.3）。采用Pearson Correlation分析細(xì)菌門、綱、目、科、屬5個(gè)水平的細(xì)菌群落多樣性與玉米產(chǎn)量和N2O排放量之間的相關(guān)性，并做相關(guān)性熱圖。方差分析通過SPSS 25軟件完成，并采用Sigmaplot 12.5進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 氮肥用量和菌根真菌對(duì)玉米產(chǎn)量、植株氮素積累量和土壤無機(jī)氮含量的影響

2016和2017兩個(gè)試驗(yàn)?zāi)甓鹊视昧亢蛥仓婢@著影響玉米籽粒產(chǎn)量（表1）。與N1處理相比，2個(gè)試驗(yàn)?zāi)甓萅2處理玉米籽粒產(chǎn)量均值增加40%。與M0相比，N1條件下M1和M2處理產(chǎn)量均值分別增加38%和82%；N2條件下M1和M2處理籽粒產(chǎn)量分別增加16%和48%；AMF在N1和N2條件下對(duì)籽粒的貢獻(xiàn)量分別為38%和16%。說明不同氮肥用量條件下AMF均能增加玉米籽粒產(chǎn)量，其中，低氮肥（N1）條件下AMF對(duì)產(chǎn)量的貢獻(xiàn)量相對(duì)較高。與M0相比，N1條件下M1和M2兩個(gè)處理地上部氮素積累量增加30%和52%，根系氮素積累量增加13%和66%；N2條件下M1和M2兩個(gè)處理地上部氮素積累量增加9%和33%，根系氮素積累量增加9%和32%。表明不同氮肥用量條件下AMF均可以提高玉米植株氮素積累量，其中N1條件下AMF對(duì)植株氮素吸收的貢獻(xiàn)量高于N2。

*, **, and ***分別表示0.05，0.01和0.001水平差異性。同列數(shù)據(jù)后不同字母表示處理間< 0.05水平差異顯著性。下同

*, **, and *** Indicate the significant difference at the 0.05, 0.01 and 0.001 levels, respectively. Different letters after the data in the same column indicate significant difference in< 0.05 level among treatments. The same as below

地上部氮素積累量Aboveground N accumulation (ANA)；根系氮素積累量Root N accumulation (RNA)

氮肥用量和叢枝菌根真菌顯著影響土壤無機(jī)氮含量。與M0相比，N1條件下M1和M2兩個(gè)處理土壤硝態(tài)氮含量分別減少37%和64%，無機(jī)氮含量分別減少26%和65%；N2條件下M1和M2兩個(gè)處理土壤硝態(tài)氮含量分別減少44%和55%，無機(jī)氮含量分別減少34%和55%。表明玉米接種叢枝菌根真菌顯著促進(jìn)土壤無機(jī)氮的吸收利用。

2.2 氮肥用量和叢枝菌根真菌對(duì)N2O排放的影響

2016和2017兩個(gè)試驗(yàn)?zāi)甓扔衩咨谕寥繬2O排放通量呈動(dòng)態(tài)變化（圖1）。與N1相比，兩個(gè)試驗(yàn)?zāi)甓萅2條件下N2O排放通量均值增加17%，N2O累積排放量增加13%，N2O排放強(qiáng)度降低25%（圖2）。與M0相比，N1條件下M1和M2兩個(gè)處理N2O排放通量分別降低9%和37%，N2O累積排放量降低17%和40%，N2O排放強(qiáng)度降低41%和67%；N2條件下N2O排放通量降低17%和45%，累積排放量降低26%和45%，排放強(qiáng)度降低28%和57%。表明接種叢枝菌根真菌能顯著降低土壤N2O排放通量、累積排放量和排放強(qiáng)度，且不同氮肥用量條件下AMF對(duì)N2O排放的影響程度不同，N1處理AMF降低N2O排放量的能力小于N2，但降低N2O排放強(qiáng)度的能力高于N2。

2.3 氮肥用量和叢枝菌根真菌對(duì)土壤細(xì)菌群落組成的影響

2016年每個(gè)土壤樣品的所有序列被聚類為操作分類單位（OTU），具有超過97%的同一性（表2）。Chao 1用于反映細(xì)菌群落的豐富度，但M0、M1和M2處理之間OTU數(shù)和Chao 1差異均不顯著，說明玉米接種AMF后不會(huì)改變土壤細(xì)菌的豐富度。Shannon和Simpson指數(shù)用于評(píng)價(jià)細(xì)菌群落多樣性，細(xì)菌群落多樣性受豐富度和均勻度的影響，更好的多樣性對(duì)應(yīng)于更高的Shannon和更低的Simpson指數(shù)，與M0相比，N1條件下M1和M2處理的Shannon指數(shù)分別提高8%和6%，N2條件下分別提高2%和1%，說明低氮（N1）和高氮（N2）條件下接種叢枝菌根真菌均表現(xiàn)出相對(duì)較高的多樣性，但降低了均勻度，其中低氮條件下細(xì)菌多樣性較高。

圖2 不同處理之間土壤氧化亞氮排放通量、累積排放量和排放強(qiáng)度的比較

表2 2016年不同處理間細(xì)菌觀測(cè)物種、OTU數(shù)、估計(jì)指數(shù)（Chao 1、Shannon和Simpson）和覆蓋度的比較

各處理細(xì)菌群落相對(duì)豐度超過1%、位列前10的細(xì)菌門分別為變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、奇古菌門（Thaumarchaeota）和疣微菌門（Verrucomicrobia）（圖3-A）。與N1均值相比，N2水平Proteobacteria、Gemmatimonadetes和 Bacteroidetes相對(duì)豐度分別降低6%、15%和22%，Actinobacteria增加32%。與M0處理相比，N1條件下M1和M2處理Proteobacteria豐度分別降低15%和10%，Bacteroidetes降低24%和4%，Actinobacteria分別增加54%和68%，Gemmatimonadetes豐度增加99%和89%；N2條件下Proteobacteria降低0.5%和4%，Bacteroidetes降低13%和20%，Actinobacteria分別增加3%和26%，Gemmatimonadetes增加21%和51%。

各處理相對(duì)豐度位列前10的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌綱為α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、unidentified_Acidobacteria、芽孢桿菌綱（Bacilli）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria），嗜熱油菌綱（Thermoleophilia）、unidentified_ Actinobacteria、δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria）、unidentified_ Gemmatimonadetes和全噬菌綱（Holophagae）（圖3-B）。與N1均值相比，N2水平Gammaproteobacteria和Betaproteobacteria相對(duì)豐度降低25%和4%；Thermoleophilia和unidentified_ Actinobacteria分別增加49%和38%。與M0相比，N1條件下M1和M2處理Gammaproteobacteria豐度分別降低45%和40%，Betaproteobacteria降低26%和14%，而Thermoleophilia分別增加20%和31%，unidentified_Actinobacteria增加62%和92%；N2條件下Gammaproteobacteria相對(duì)豐度降低2%和23%，而Betaproteobacteria分別增加1%和7%，unidentified_Actinobacteria增加6%和46%。

各處理優(yōu)勢(shì)細(xì)菌目為芽孢桿菌目（Bacillales）、酸桿菌目（Acidobacteriales）、鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales）、根瘤菌目（Rhizobiales）、芽單胞菌目（Gemmatimonadales）、紅螺菌目（Rhodospirillales）、蓋勒氏菌目（Gaiellales）和黃色單胞菌目（Xanthomonadales）（圖3-C）。與N1均值相比，N2水平Acidobacteriales和Gemmatimonadales豐度分別降低20%和16%。與M0相比，N1條件下M1和M2處理Acidobacteriales豐度分別降低35%和32%，Gemmatimonadales分別增加93%和88%；N2條件下Acidobacteriales分別降低16%和19%，而Gemmatimonadales分別增加19%和53%。

各處理優(yōu)勢(shì)細(xì)菌科為Acidobacteriaceae_. Subgroup_1、鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）、芽單胞菌科（Gemmatimonadaceae）、芽孢桿菌科（Bacillaceae）、ABS-19和unidentified_Acidobacteria（圖3-D）。與N1均值相比，N2水平Acidobacteriaceae_. Subgroup_1和Gemmatimonadaceae豐度分別降低20%和16%。與M0相比，N1條件下M1和M2處理Acidobacteriaceae_.Subgroup_1豐度分別降低35%和32%；Gemmatimonadaceae增加93%和88%；N2條件下，Acidobacteriaceae_.Subgroup_1豐度分別降低36%和19%；Gemmatimonadaceae增加19%和53%。

圖3 不同處理之間門（A）、綱（B）、目（C）、科（D）、屬（E）分類水平下土壤細(xì)菌群落相對(duì)豐度

各處理優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為鞘脂單胞菌屬（）、芽孢桿菌屬（）、_屬和芽單胞菌屬（）（圖3-E）。與N1均值相比，N2水平鏈霉菌（）相對(duì)豐度增加27%，和分別降低13%和8%。與M0相比，N1條件下M1和M2處理豐度分別增加64%和205%，增加31%和53%，降低39%和37%；N2條件下M1和M2處理豐度分別增加10%和93%，M1處理的降低2%，M2處理增加56%。

低氮肥土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與高氮肥處理差異顯著（圖4）。而低氮肥和高氮肥條件下M0、M1和M2處理之間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)之間分離明顯, 說明叢枝菌根真菌對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化影響顯著。

相關(guān)分析結(jié)果表明（圖5），細(xì)菌門水平的Gemmatimonadetes以及屬水平的和的相對(duì)豐度與土壤N2O的排放量呈顯著負(fù)相關(guān)；而屬水平的和的相對(duì)豐度與玉米產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)低氮（180 kg N·hm-2）和高氮（360 kg N·hm-2）條件下玉米接種叢枝菌根真菌均顯著降低了土壤N2O排放通量和排放量（圖1和2）。STORER等[25]采用分室裝置研究發(fā)現(xiàn)，玉米寄主接種叢枝菌根真菌后，共生菌絲比生長(zhǎng)緩慢的硝化細(xì)菌具有較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)銨的優(yōu)勢(shì)，減少了通過硝化作用形成N2O的底物——銨的含量，降低了N2O的排放量。叢枝菌根真菌降低土壤N2O排放，一方面可能是因?yàn)榧闹鞲H形成一個(gè)相對(duì)較大的外胚根菌絲網(wǎng)絡(luò)，而且每克土壤的菌絲密度高達(dá)10 m，這種廣泛的吸收網(wǎng)絡(luò)可以延伸到距離根表面10 cm以上的區(qū)域，到達(dá)根系周圍形成的根際養(yǎng)分消耗區(qū)之外，使AMF定殖的根系獲得更大體積的土壤，擴(kuò)大了土壤中的養(yǎng)分吸收范圍[26-28]，增加了植株氮素積累量，減少了轉(zhuǎn)化形成N2O的底物?土壤可利用性氮素的含量。叢枝菌根真菌能夠直接吸收土壤中的 NH4+和NO3-以及小分子有機(jī)氮，如甘氨酸及難降解的有機(jī)質(zhì)殼聚糖等[29-30]，并迅速傳遞給植物；叢枝菌根真菌對(duì)NH4+的吸收利用限制了硝化作用，對(duì)土壤 NO3-的吸收限制了反硝化作用[31-32]，從而降低N2O的排放。另一方面，叢枝菌根還能夠通過調(diào)節(jié)土壤團(tuán)聚體，促進(jìn)土壤聚合，調(diào)節(jié)土壤的通氣狀況，進(jìn)而影響硝化和反硝化作用之間的平衡[33]。叢枝菌根對(duì)硝化作用的影響還可能與叢枝菌根真菌的分泌物有關(guān)，叢枝菌根真菌的分泌物可降低土壤 pH，使硝化作用減弱，導(dǎo)致土壤中NO3-含量減少[32]。本試驗(yàn)中玉米植株氮素積累量顯著增加和菌絲室內(nèi)土壤無機(jī)氮含量顯著降低（表1），表明叢枝菌根真菌從土壤中吸收了氮素并轉(zhuǎn)運(yùn)給玉米植株，是降低N2O排放的主要原因[29]。

橢圓代表特定處理中OTU分布的95%置信區(qū)間。N1M0：紅色圓點(diǎn)；N1M1：紅色三角；N1M2：紅色長(zhǎng)方形；N2M0：綠色圓點(diǎn)；N2M1：綠色三角；N2M2：綠色長(zhǎng)方形

圖5 玉米籽粒產(chǎn)量、N2O排放通量等參數(shù)與門水平（A）和屬水平（B）細(xì)菌相對(duì)豐度的相關(guān)熱圖

細(xì)菌與叢枝菌根真菌之間的相互作用在土壤氮循環(huán)，尤其是N2O形成過程中起著非常關(guān)鍵的調(diào)控作用。叢枝菌根真菌通過調(diào)控土壤細(xì)菌群落組成，尤其是參與硝化、反硝化過程的微生物群落組成，影響N2O的排放[10, 12, 25]。CHEN等[34]和VERESOGLOU等[32]發(fā)現(xiàn)叢枝菌根真菌抑制氨氧化微生物對(duì)NH4+的利用，造成氨氧化古菌（AOA）與氨氧化細(xì)菌（AOB）豐度和土壤硝化速率降低，減少了硝化過程中產(chǎn)生的N2O。本研究發(fā)現(xiàn)玉米接種叢枝菌根真菌均增加了和相對(duì)豐度，且和細(xì)菌豐度均與N2O排放通量呈顯著負(fù)相關(guān)。其中屬具有較強(qiáng)的解磷能力，能夠提高植物的抗病性和抗逆性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)[35-36]；Gemmatimonadetes門是一類光養(yǎng)細(xì)菌，它利用有機(jī)碳進(jìn)行生長(zhǎng)和新陳代謝，將各種糖分子轉(zhuǎn)化為維生素，并且與土壤NH4+-N含量呈顯著負(fù)相關(guān)性[37-39]。因此，AMF增加Gemmatimonadetes的豐度，可能是通過減少形成N2O的底物——NH4+-N的供應(yīng)，從而降低N2O的排放。這表明玉米接種叢枝菌根真菌，主要是提高了有利于作物養(yǎng)分吸收的細(xì)菌相對(duì)豐度，降低了轉(zhuǎn)化形成N2O的底物含量，減少了溫室氣體的排放量。N2O也可能被反硝化細(xì)菌所消耗，導(dǎo)致排放量減少[40]。BENDER等[10-11]研究發(fā)現(xiàn)叢枝菌根真菌通過誘導(dǎo)土壤反硝化微生物群落變化來調(diào)控N2O的排放，其中叢枝菌根真菌豐度與N2O產(chǎn)生的關(guān)鍵基因（）豐度呈負(fù)相關(guān)，而與N2O消耗基因（）豐度呈正相關(guān)。

施肥直接為土壤硝化與反硝化作用提供氮源，是影響土壤N2O排放最重要的因素之一[41]。SHCHERBAK等[2]分析了78篇相關(guān)文獻(xiàn)，指出土壤N2O 排放隨著施氮量的增加呈指數(shù)增長(zhǎng)。另一方面，施肥促進(jìn)作物根系分泌物增加，改善土壤微生物種群組成，調(diào)控溫室氣體排放途徑[42]。有研究發(fā)現(xiàn)潮棕壤上長(zhǎng)期單施化肥顯著降低了細(xì)菌數(shù)量和多樣性[43-44]；而在砂姜黑土和灌溉土長(zhǎng)期平衡施用化肥會(huì)顯著增加土壤細(xì)菌數(shù)量以及提高細(xì)菌群落的多樣性和豐富度[42,44-45]。本研究發(fā)現(xiàn)增施氮肥主要是增加了屬的相對(duì)豐度，降低了屬細(xì)菌豐度，其中土壤中和屬與N2O的排放總量呈顯著負(fù)相關(guān)。說明氮肥用量通過改善細(xì)菌群落組成影響N2O排放。不同氮肥用量條件下，叢枝菌根真菌調(diào)控N2O排放的能力存在差異[46-47]。本研究發(fā)現(xiàn)，低氮（180 kg N·hm-2）條件下叢枝菌根真菌減少N2O的排放量相對(duì)較高，這可能是較低的土壤養(yǎng)分條件下有利于菌根定殖、孢子形成和菌絲的發(fā)育[48-49]。而叢枝菌根真菌在高氮（360 kg N·hm-2）條件下的作用也表明，即使是在相對(duì)較高的土壤養(yǎng)分條件下，叢枝菌根真菌也能夠與玉米根系建立良好的共生關(guān)系，促進(jìn)養(yǎng)分吸收，提高其產(chǎn)量，減少氮素流失。這為叢枝菌根真菌作為生物肥料不受土壤肥力高低的制約，充分發(fā)揮其提高養(yǎng)分吸收、減少氮素流失和溫室氣體排放的生態(tài)作用，實(shí)現(xiàn)其在養(yǎng)分管理方面的應(yīng)用拓寬了前景。

4 結(jié)論

不同氮肥用量條件下，玉米接種叢枝菌根真菌均能夠降低土壤N2O的排放。玉米接種叢枝菌根真菌一方面通過擴(kuò)大菌絲養(yǎng)分吸收面積，提高玉米氮素積累量，降低溫室氣體排放量；另一方面通過改變土壤細(xì)菌群落組成，主要是降低Proteobacteria和Bacteroidetes門，增加了Actinobacteria和Gemmatimonadetes細(xì)菌門水平的相對(duì)豐度，尤其是增加了和細(xì)菌屬水平的豐度，降低N2O的排放量，其中180 kg N·hm-2施肥條件下接種叢枝菌根對(duì)降低N2O排放的貢獻(xiàn)相對(duì)較大。

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Effects of Arbuscular Mycorrhizal Fungi on Soil N2O Emissions During Maize Growth Periods

ZHANG XueLin, HE TangQing, ZHANG ChenXi, TIAN MingHui, LI XiaoLi, WU Mei, ZHOU YaNan, HAO XiaoFeng

AgronomyCollege, Henan Agricultural University/State Key Laboratory of Wheat and Maize Crop Science /Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops for 2011, Zhengzhou 450002

【Objective】The aim of this study was to understand the mechanism of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) on soil nitrous oxide (N2O) emissions, so as to provide the theoretical basis for increasing maize yield, improving nitrogen (N) use efficiency and reducing greenhouse gas emissions. 【Method】A 2-factorial greenhouse experiment was established during maize growth periods in 2016 and 2017. The factors were as follows: (1) N fertilizer rates (180 kg N·hm-2(N1) and 360 kg N·hm-2(N2)), and (2) three mycorrhizae treatments, including a control (M0, neither roots nor AMF could enter the hyphal chamber from the growth chamber), an AMF treatment (M1, only AMF can enter the hyphal chamber from the growth chamber), and a root treatment (M2, both roots and AMF can enter the hyphal chamber from the growth chamber). Maize grain yield, plant biomass and their N accumulation, and soil N2O flux were measured. Soil bacterial community structure and diversity at maize maturity stage was determined by using the high throughput sequencing technique on Hiseq 2500 PE250. 【Result】Both N fertilizer rates and mycorrhizae treatments significantly affected maize yield, plant N accumulation and soil N2O flux. Compared with M0, maize yield under M1 and M2 under the conditions of N1 input increased by 38% and 82%, by 30% and 52% for aboveground N accumulation, respectively, and reduced by 26% and 65% for soil inorganic N, respectively. However, under the conditions of N2 input, the maize yield under M1 and M2 increased by 16% and 48%, by 9% and 33% for aboveground N accumulation, and reduced by 34% and 55% for soil inorganic N, respectively. Compared with the M0, the total N2O emission of M1 and M2 treatments reduced by 17% and 40% under the conditions of N1 input, and by 41% and 67% for the N2O emission intensity, respectively; while under the conditions of N2 input, the total N2O emission reduced by 26% and 45%, and by 28% and 57% for the N2O emission intensity, respectively. Nonmetric multidimensional scaling analysis showed that both N fertilizer rates and mycorrhizae treatments had significant effects on bacterial communities’ composition. Compared with N1, the relative abundance of Proteobacteria and Gemmatimonadetes under N2 treatment on phyla level reduced by 6% and 15%, increased by 32% for Actinobacteria, while on genera level, theincreased by 27%, and reduced by 8% for. Compared with M0 under the conditions of N1 input, the relative abundance ofunder M1 and M2 increased by 64% and 205%, by 31% and 53% for; however, under the conditions of N2 input, the relative abundance ofunder M1 and M2 increased by 10% and 93%, respectively, thefor M1 reduced by 2%, and increased by 56% for M2. Moreover, the relative abundance of soilandwas negatively related with soil N2O emission, but positively related with maize yield. 【Conclusion】Arbuscular mycorrhizal fungi could reduce soil N2O emission under both higher and lower N fertilizer application rate by increasing the maize N uptake, and regulating the bacterial composition, especially increasing the relative abundance ofand.

nitrogen fertilizer; arbuscular mycorrhizal fungi; maize; soil N2O flux; soil bacteria

2021-03-19；

2021-06-10

河南省自然科學(xué)基金（182300410013）、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題（2018YFD0200605）

張學(xué)林，Tel：13643867669；E-mail：xuelinzhang1998@163.com；zxl1998@henau.edu.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.10.010

（責(zé)任編輯 李云霞）