蕓薹根腫菌活細胞PMAxx-qPCR快速定量檢測方法的建立與應(yīng)用

李曉菁，張思雨，劉迪，袁曉偉，李興盛，石延霞，謝學(xué)文，李磊，范騰飛，李寶聚，柴阿麗

蕓薹根腫菌活細胞PMAxx-qPCR快速定量檢測方法的建立與應(yīng)用

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2山東省華盛農(nóng)業(yè)集團股份有限公司，山東青州 262500

【目的】由蕓薹根腫菌（）侵染引起的十字花科根腫病是一種世界性土傳病害，病原菌長期存在于土壤中，對十字花科作物造成嚴重威脅。改良疊氮溴化丙錠（propidium monoazide xx，PMAxx）可選擇性地穿透受損的死細胞膜，并抑制死細胞DNA的實時熒光定量PCR（qPCR）擴增。本文將PMAxx與qPCR技術(shù)相結(jié)合，建立一種快速檢測蕓薹根腫菌活菌的方法，為根腫病的早期診斷及制定科學(xué)的防控措施提供依據(jù)?！痉椒ā颗渲脻舛确謩e為0、5、10、20、40、60 μmol·L-1的疊氮溴化丙錠PMA和改良疊氮溴化丙錠PMAxx，比較兩種核酸染料對蕓薹根腫菌死細胞DNA擴增的抑制效果，確定最佳核酸染料及工作濃度；設(shè)置光照時間分別為0、2、5、10、15和20 min，進行最佳光照時間的優(yōu)化，建立蕓薹根腫菌活細胞PMAxx-qPCR快速檢測體系。設(shè)置蕓薹根腫菌活孢子百分比為0、0.01%、0.1%、1%、10%、25%、50%、75%和100%的混合體系，驗證PMAxx-qPCR體系的準確性，并應(yīng)用于田間土壤樣本中蕓薹根腫菌活孢子的定量檢測?！窘Y(jié)果】PMAxx對蕓薹根腫菌死細胞DNA的擴增抑制效果更好，當蕓薹根腫菌濃度為1×108個孢子/mL，PMAxx預(yù)處理的最適終濃度為4 μmol·L-1，最佳光照時間為10 min時，可有效地抑制死孢子DNA的擴增，僅以有活力孢子DNA為靶標選擇性地擴增。利用PMAxx-qPCR技術(shù)檢測已知不同活孢子比例的菌懸液樣品，各樣品實測孢子存活率和理論存活率之間呈正相關(guān)（2=0.992）。對田間采集的25份土壤樣本，采用PMAxx-qPCR方法檢測到11份樣本中攜帶蕓薹根腫菌，活細胞DNA濃度為32.35—6.97×103fg·g-1?！窘Y(jié)論】建立了基于PMAxx-qPCR的蕓薹根腫菌活細胞定量檢測技術(shù)，該技術(shù)具有快速、準確、靈敏的特點，解決了qPCR不能僅對活體病原菌進行準確鑒別和定量分析的問題，為制定有效的根腫病防控策略提供了依據(jù)。

蕓薹根腫菌；根腫?。桓牧集B氮溴化丙錠；實時熒光定量PCR；活性孢子

0 引言

【研究意義】十字花科根腫病是由蕓薹根腫菌（）侵染引起的一種世界范圍內(nèi)的土傳病害[1-2]，大白菜、甘藍、青花菜、花椰菜、油菜等十字花科作物均可受害，引起產(chǎn)量下降，甚至造成絕產(chǎn)絕收，嚴重影響十字花科產(chǎn)業(yè)發(fā)展[3-5]。近年來，隨著十字花科作物在我國廣泛種植，根腫病的影響越來越大，并缺乏有效的防治手段[6]。病原菌可以在土壤中長期存活，最長可達20年，一旦土壤中帶有根腫菌，將不適宜種植十字花科作物[7-8]。因此，建立高效、靈敏的蕓薹根腫菌活細胞定量檢測方法，對于病害的早期診斷以及制定科學(xué)有效的防控措施防止該病菌傳播十分重要?！厩叭搜芯窟M展】目前，針對蕓薹根腫菌的檢測大多采用分子生物學(xué)技術(shù)，如普通PCR[9-12]、巢式PCR[13-14]、實時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，qPCR）[15-20]等。然而，普通PCR和巢氏PCR都只能進行定性檢測[9-14]，不能進行定量檢測。qPCR技術(shù)的發(fā)展為從基因水平上定量監(jiān)測各種微生物提供了十分有效的手段。Wallenhammar等分別利用特異性引物建立了土壤中蕓薹根腫菌的qPCR檢測體系，檢出下限為103—104個孢子/g土壤[16-17]。然而，qPCR方法檢測的是土壤中病原菌的總量，不僅能擴增有活性蕓薹根腫菌孢子DNA，也會擴增死孢子DNA以及游離狀態(tài)的病原菌DNA，因此不能區(qū)分樣品中蕓薹根腫菌的存活狀態(tài)，造成蕓薹根腫菌活菌含量的高估[21]。疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）是一種特異的活性染料，可以穿透死細胞不完整的細胞膜，與其DNA進行不可逆的共價結(jié)合，被這種活性染料結(jié)合的DNA不能進行PCR擴增，從而阻止死細胞DNA的擴增，達到檢測活性細胞的目的[22]。PMA-qPCR已經(jīng)應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品等方面病原真菌、細菌和病毒活性的定量檢測[23-27]，在植物病原菌檢測方面，該技術(shù)已經(jīng)用于西瓜細菌性果斑病菌（）、黃瓜細菌性角斑病菌（pv.）、番茄細菌性斑點病菌（pv.）、番茄潰瘍病菌（subsp.）等病原細菌活細胞的定量檢測[28-32]。PMAxx是PMA的改良結(jié)構(gòu)，同樣可以穿透死菌或者受損菌的細胞膜并與其DNA進行結(jié)合，在強光條件下使DNA構(gòu)象發(fā)生改變，從而抑制PCR擴增；與PMA相比，PMAxx能更高效抑制死菌DNA的擴增，從而具有更高效區(qū)分有活性與無活性病原菌的能力[31]?！颈狙芯壳腥朦c】為解決現(xiàn)有qPCR技術(shù)無法判斷病原菌活性，不能實現(xiàn)土壤中有活性病原菌準確檢測和病害預(yù)警的問題，本文將PMAxx與qPCR技術(shù)相結(jié)合，建立一種快速、準確的定量檢測蕓薹根腫菌活細胞的方法?！緮M解決的關(guān)鍵問題】優(yōu)化PMAxx預(yù)處理最佳濃度和光照時間，建立基于PMAxx-qPCR的蕓薹根腫菌活細胞定量檢測體系，解決qPCR不能區(qū)分病原菌活性的問題。

1 材料與方法

試驗于2019年1月至2021年5月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所完成。

1.1 供試菌株和種子

供試蕓薹根腫菌采自云南昆明的大白菜發(fā)病腫根，保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所蔬菜病害綜合防治課題組，保存條件為-20℃冰箱。大白菜‘中白60’由中蔬種業(yè)科技（北京）有限公司提供。

1.2 主要試劑和設(shè)備

PMA和PMAxx（美國，Biotum公司）購自北京博晟思源生物科技有限公司；ABI 7500實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；Bio-Rad S1000 PCR儀購自美國伯樂公司。

1.3 基因組DNA提取和引物特異性檢測

采用改良CTAB法，提取腫根組織中蕓薹根腫菌DNA和11種非靶標病原菌（表1）基因組DNA。使用課題組前期篩選的蕓薹根腫菌特異性引物PBF3（5′-TCTTGCGTGTCGCTGTATTC-3′）和PBR3（5′-ATAGGTTGGGGTAACTTGGC-3′）[18]，對靶標和非靶標菌的基因組DNA進行qPCR擴增，以健康白菜根組織DNA和ddH2O為陰性對照。qPCR反應(yīng)體系（20 μL）：SYBR qPCR Master Mix（博邁德，北京）10 μL，上、下游引物各0.4 μL，DNA模板2 μL。qPCR擴增程序：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 34 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后分析擴增曲線及熔解曲線，引物序列由北京博邁德科技有限公司合成。

表1 引物特異性檢測所用菌株

1.4 質(zhì)粒標準品制備

將引物PBF3/PBR3普通PCR擴增到的片段，采用離心柱型瓊脂糖凝膠回收試劑盒（全式金，北京）進行回收純化。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：上、下游引物各1 μL，2×Taq Master Mix 25 μL，模板DNA 2 μL。PCR擴增程序：94℃3 min；94℃1 min，60℃1 min，72℃1 min，共38個循環(huán)；72℃10 min。將目標DNA與pEASY?-T1克隆載體（全式金，北京）連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細胞（全式金，北京）。取200 μL菌液涂布在含有100 μg·mL-1氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)室倒置培養(yǎng)24 h。隨機挑取一定數(shù)量的白色單菌落，在含100 μg·mL-1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。PCR鑒定為陽性克隆后，隨機選取10個陽性克隆，送北京博邁德生物公司測序。

1.5 蕓薹根腫菌qPCR檢測體系建立

使用Thermo Scientific NanoDrop 2000c紫外分光光度計，測定蕓薹根腫菌質(zhì)粒DNA濃度，將初始濃度16.12 ng·μL-1做10倍梯度稀釋16.12—1.612×10-6ng·μL-1，建立qPCR標準曲線。以qPCR擴增時所得循環(huán)數(shù)Ct值為縱坐標軸，以起始質(zhì)粒DNA濃度的對數(shù)為橫坐標軸，繪制蕓薹根腫菌qPCR標準曲線，并計算回歸方程。

1.6 蕓薹根腫菌活孢子和死孢子懸浮液制備

取新鮮發(fā)病腫根，加入適量無菌水，用組織搗碎機打碎至勻漿狀，8層紗布過濾。用血球計數(shù)板調(diào)節(jié)孢子懸浮液濃度，制備成1×108個休眠孢子/mL的活孢子菌懸液備用。取活孢子懸浮液，100℃沸水浴中處理30 min高溫致死，振蕩5 min使致死成團的休眠孢子均勻分散，制備成1×108個休眠孢子/mL的死孢子菌懸液備用。

1.7 PMA和PMAxx的效果比較

PMA和PMAxx母液制備和儲存：將1 mg PMA溶于98 μL的20%二甲基亞砜（DMSO）溶液，制成濃度為20 mmol·L-1的母液，-20℃黑暗儲存。訂購20 mmol·L-1的PMAxx，-20℃黑暗儲存。

PMA和PMAxx的抑制效果比較：取2 mL離心管，將不同體積PMA和PMAxx分別加入1 mL濃度為108個孢子/mL的活孢子和死孢子懸浮液中，使PMA和PMAxx終濃度分別為0、5、10、20、40和60 μmol·L-1，充分混勻。錫紙包裹離心管，置于28℃、180 r/min避光振蕩處理30 min，使PMA和PMAxx與死孢子充分接觸。之后拿掉錫紙，置于冰上，在距離50 W鹵鎢燈20 cm處光照冰浴20 min，激活PMA和PMAxx，使其與死菌DNA充分結(jié)合。處理后的菌懸液，離心棄上清，使用法醫(yī)樣品DNA提取試劑盒（Omega公司）提取蕓薹根腫菌沉淀DNA，進行qPCR擴增。以未經(jīng)PMA或PMAxx處理的菌懸液DNA為陽性對照，ddH2O為陰性對照。每個處理設(shè)置4個平行樣，每個DNA模板qPCR反應(yīng)進行3次重復(fù)。通過計算dCt值和ddCt值，篩選光敏染料。dCt值為光敏染料處理樣品的Ct值減去未經(jīng)染料處理樣品的Ct值，而ddCt值為死孢子的dCt值減去活孢子的dCt值[31]。

1.8 最適PMAxx終濃度篩選

將PMAxx加入含有1 mL濃度108個孢子/mL的活孢子懸浮液和高溫致死菌懸液的2 mL離心管中，使PMAxx終濃度分別達到0、0.2、0.5、1、1.5、2、4、6、8和10 μmol·L-1，避光振蕩處理30 min后，光照冰浴20 min。之后按照1.7方法提取DNA，進行qPCR擴增。每個處理設(shè)置4個平行樣，每個qPCR反應(yīng)進行3次重復(fù)。

1.9 最適PMAxx光照時間篩選

將PMAxx加入含有1 mL濃度108個孢子/mL的活孢子懸浮液和高溫致死菌懸液的2 mL離心管中，使PMAxx終濃度為4 μmol·L-1。避光振蕩處理30 min后，在距離50 W鹵鎢燈20 cm處光照冰浴孵育，光照時間分別為0、2、5、10、15和20 min，進行PMAxx最佳光照時間的優(yōu)化。之后按照1.7方法提取DNA，進行qPCR擴增。每個處理設(shè)置4個平行樣，每個qPCR反應(yīng)進行3次重復(fù)。

1.10 PMAxx-qPCR檢測體系準確性驗證

取濃度108個孢子/mL蕓薹根腫菌活孢子懸浮液和死孢子懸浮液，按不同體積比混合，分別配制成活孢子比例為0、0.01%、0.1%、1%、10%、25%、50%、75%和100%的死/活菌混合體系。每個處理總體積10 mL，分別進行qPCR和PMAxx-qPCR檢測。每個比例設(shè)置4個平行樣，每個qPCR反應(yīng)進行3次重復(fù)。qPCR檢測：不使用PMAxx預(yù)處理，按照1.7方法提取DNA，進行qPCR擴增。PMAxx-qPCR檢測：首先對不同活孢子比例的菌懸浮液進行PMAxx預(yù)處理，PMAxx處理濃度為4 μmol·L-1，光照時間為10 min，然后進行qPCR擴增。根據(jù)檢測獲得的Ct值，計算菌懸液濃度，分析比較實際活孢子率和理論活孢子率的差異及其相關(guān)性，驗證PMAxx-qPCR檢測體系的準確性。

1.11 PMAxx-qPCR檢測體系應(yīng)用

2019—2020年，從湖北恩施、山東青島、江蘇無錫、遼寧沈陽、河南南陽、四川綿陽和廣元等十字花科蔬菜主產(chǎn)區(qū)采集田間土壤樣本25份。每份樣品各取5 g，加入20 mL無菌水，旋渦振蕩器振蕩混勻，8層紗布過濾去除土壤顆粒及雜質(zhì)，獲得的土壤菌懸液分別進行qPCR和PMAxx-qPCR檢測，分析土樣中根腫菌總量和有活力根腫菌量。同時，將采集的土樣裝入6 cm×6 cm育苗缽中，種植大白菜，45 d后調(diào)查根腫病發(fā)病情況。根腫病調(diào)查及分級標準：0級為根部無腫大；1級腫根只附著在側(cè)根上，占全部根系1%—25%；2級主根上有腫根附著，側(cè)根上腫根占26%—50%；3級主根上有腫根附著，腫根占根系51%—75%；4級主根上有根腫附著，腫根占根系75%以上[16]。病情指數(shù)＝∑（各級病株數(shù)×該級代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×4）×100。

2 結(jié)果

2.1 引物特異性分析

以健康白菜根組織DNA和ddH2O為陰性對照，利用引物對PBF3/PBR3對靶標蕓薹根腫菌和11種非靶標病原菌基因組DNA進行qPCR擴增。在qPCR檢測中，只有Ct介于11—29，同時具有單一熔解曲線峰值，才被認為是有效結(jié)果。蕓薹根腫菌Ct平均值為12.32（圖1），熔解曲線獲得單一峰值，Tm值為84.75℃（圖2）；而非靶標菌株、健康白菜根組織DNA和ddH2O的Ct值均大于32，同時也沒有獲得熔解曲線或出現(xiàn)不同的Tm值。說明引物對PBF3/PBR3在qPCR檢測中具有較高的特異性。

1：蕓薹根腫菌P. brassicae；2：尖鐮孢F. oxysporum；3：茄鐮孢F. solani；4：半裸鐮孢F. incarnatum；5：立枯絲核菌R. solani；6：核盤菌S. sclerotiorum；7：蕓薹鏈格孢A. brassicae；8：長孢輪枝菌V. longisporum；9：瓜果腐霉P. aphanidermatum；10：灰葡萄孢B. cinerea；11：胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種P. carotovorun subsp. carotovorum；12：野油菜黃單胞菌野油菜致病變種X. campestris pv. campestris；13：健康大白菜根組織Root tissue of healthy Chinese cabbage；14：ddH2O

具有單一熔解曲線峰值的菌株為蕓薹根腫菌，單一Tm值84.75℃；而非靶標菌株、健康白菜根組織DNA和ddH2O均沒有明顯峰值出現(xiàn)The melting curve of P. brassicae had single peak with Tm 84.75℃. The melting curve of non-target strains, root tissue of healthy Chinese cabbage and ddH2O had no peak or slightly peaks with different Tm values

2.2 蕓薹根腫菌qPCR檢測體系標準曲線建立

將蕓薹根腫菌質(zhì)粒DNA進行10倍梯度稀釋16.12—1.612×10-6ng·μL-1，以不同稀釋倍數(shù)的質(zhì)粒DNA作為模板，構(gòu)建qPCR標準曲線。以質(zhì)粒DNA濃度對數(shù)值為X軸，循環(huán)數(shù)Ct值為Y軸，繪制標準曲線，并計算回歸方程。擴增反應(yīng)循環(huán)數(shù)Ct值與質(zhì)粒DNA濃度的對數(shù)值之間有良好的線性關(guān)系：=-3.6012+34.314，相關(guān)系數(shù)2=0.9974（圖3）。

2.3 PMA和PMAxx檢測效果比較

當PMA和PMAxx濃度為0 μmol·L-1時，蕓薹根腫菌活孢子和死孢子懸浮液qPCR檢測Ct值分別為14.53和14.86，差異不顯著。隨著PMA和PMAxx濃度增加，活孢子懸浮液Ct值輕微增大，而死孢子懸浮液Ct值顯著增大，說明PMA及PMAxx均對死孢子DNA產(chǎn)生抑制擴增的效果。當PMA和PMAxx濃度達到60 μmol·L-1時，活孢子Ct值分別為18.52和18.58，差異不顯著；而PMAxx處理死孢子的Ct值32.61顯著高于PMA處理的Ct值29.84。在各濃度下，PMAxx處理的ddCt值均高于PMA處理（表2），說明PMAxx對死孢子基因組DNA擴增的抑制效果強于PMA。因此，選擇PMAxx作為核酸染料，構(gòu)建PMAxx-qPCR蕓薹根腫菌活孢子定量檢測體系。

圖3 蕓薹根腫菌熒光定量PCR標準曲線

2.4 最適PMAxx終濃度

采用終濃度0、0.2、0.5、1、1.5、2、4、6、8和10 μmol·L-1的PMAxx，對108個孢子/mL的蕓薹根腫菌活孢子和死孢子懸浮液進行處理。當PMAxx濃度低于4 μmol·L-1時，死孢子檢測的Ct值隨PMAxx處理濃度的升高而逐漸增大。而當PMAxx濃度大于4 μmol·L-1時，隨著PMAxx濃度增大，死孢子DNA的擴增受到了顯著抑制，qPCR檢測的Ct值無顯著變化，說明PMAxx濃度為4 μmol·L-1可最大限度地抑制死孢子DNA擴增。同時，不同濃度PMAxx處理活孢子懸浮液，當PMAxx濃度低于4 μmol·L-1時，PMAxx濃度對其qPCR擴增無顯著抑制作用；但當PMAxx濃度高于4 μmol·L-1，其Ct值略有增加，說明高濃度PMAxx影響了活孢子的檢測。因此，PMAxx的最適終濃度為4 μmol·L-1，該濃度的PMAxx既可以顯著抑制死孢子的擴增，又對活孢子擴增沒有顯著影響（圖4-A）。

表2 PMA和PMAxx預(yù)處理蕓薹根腫菌qPCR檢測的Ct值

ddCt = dCt（死孢子Dead spores）-dCt（活孢子Viable spores）；dCt（死孢子Dead spores）= Ct（光敏染料處理死孢子Dead spores with dye）-Ct（無染料處理死孢子Dead spores without dye）；dCt（活孢子Viable spores）= Ct（光敏染料處理活孢子Viable spores with dye）-Ct（無染料處理活孢子Viable spores without dye）

2.5 最適PMAxx光照時間

使用PMAxx預(yù)處理蕓薹根腫菌活孢子和死孢子懸浮液，當PMAxx預(yù)處理0 min時，PMAxx沒有發(fā)生光化反應(yīng)，無法抑制死孢子DNA的擴增，活孢子qPCR反應(yīng)的Ct值與死孢子Ct值差異不顯著。當PMAxx預(yù)處理2、5和10 min時，PMAxx產(chǎn)生光化學(xué)反應(yīng)，抑制死孢子DNA擴增，隨著光處理時間延長，死孢子qPCR反應(yīng)的Ct值增加，而活孢子Ct值無顯著差異；當光處理10、15和20 min時，死孢子Ct值qPCR反應(yīng)差異不顯著。因此，PMAxx最適光照時間為10 min，PMAxx能夠完全與死孢子DNA共價聯(lián)結(jié)（圖4-B）。

2.6 蕓薹根腫菌PMAxx-qPCR檢測體系準確性驗證

為了驗證PMAxx-qPCR體系的可靠性，對不同比例濃度為108個孢子/mL的蕓薹根腫菌活孢子和死孢子混合懸浮液（0.01%、0.1%、1%、10%、25%、50%、75%和100%活孢子）分別采用qPCR和PMAxx-qPCR進行檢測。

使用qPCR檢測，無論活孢子比例是否變化，Ct值始終維持在穩(wěn)定水平，無顯著差異（＞0.05）。當活孢子比例從100%降至0.01%時，qPCR的Ct值介于10.04—10.81，對應(yīng)DNA濃度對數(shù)值在6.57—6.74。對于PMAxx-qPCR法，隨著活孢子比例下降，Ct值也逐漸増加。當活孢子比例由100%逐漸降至0.01%時，Ct值由10.34升至23.59，對應(yīng)DNA濃度對數(shù)值由6.66降至2.98（表3）。PMAxx-qPCR檢測的蕓薹根腫菌基因組DNA濃度的對數(shù)值與理論活孢子濃度的對數(shù)值之間存在良好的線性關(guān)系：=0.8981-0.7148，2=0.992（圖5）。結(jié)果表明，PMAxx-qPCR可以有效區(qū)分菌懸液中的活孢子和死孢子，選擇性地對活孢子DNA進行qPCR擴増，而qPCR法無法區(qū)分活孢子和死孢子，其檢測結(jié)果會對活孢子濃度造成高估。

圖4 PMAxx濃度（A）和光照時間（B）對蕓薹根腫菌活孢子和死孢子DNA擴增的影響

表3 不同比例蕓薹根腫菌活孢子懸浮液qPCR和PMAxx-qPCR檢測結(jié)果

數(shù)據(jù)為平均值±標準差，不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著

Data were presented as mean±SD, data with different lowercase letters indicated significant differences at 0.05 level

圖5 不同比例蕓薹根腫菌活孢子懸浮液PMAxx-qPCR檢測準確性驗證

2.7 PMAxx-qPCR檢測體系應(yīng)用

使用qPCR和PMAxx-qPCR方法對采集的25份田間腫根土壤樣本進行檢測，其中11份樣本檢測到蕓薹根腫菌。qPCR檢測Ct值介于17.00—25.21，對應(yīng)土壤中蕓薹根腫菌DNA濃度為3.37×102—6.44×104fg·g-1；而PMAxx-qPCR檢測Ct值高于qPCR檢測的Ct值，介于20.47—28.88，對應(yīng)有活性蕓薹根腫菌DNA濃度為32.35—6.97×103fg·g-1。除采自山東青島的土壤外，其余10份田間土壤樣本種植大白菜后，均發(fā)生根腫病。不同土壤樣本中檢測到的蕓薹根腫菌活孢子量不同，其中，采自湖北恩施的土壤樣本中含有的活孢子帶菌量最多，為6.97×103fg·g-1，種植大白菜后，根腫病的病情指數(shù)最高為50.48；采自山東青島的土壤樣本中含有的活孢子帶菌量最少，為32.35 fg·g-1，種植大白菜后未發(fā)生根腫?。ū?）。

表4 十字花科根腫病田間發(fā)病土壤帶菌量qPCR及PMAxx-qPCR檢測結(jié)果

3 討論

3.1 土壤中蕓薹根腫菌活細胞PMAxx-qPCR定量檢測方法

我國十字花科蔬菜種類多、分布廣、種植面積大，根腫病常年危害面積高達320—400萬公頃，占十字花科作物種植面積的1/3以上，嚴重制約著十字花科產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[6,10,15]。根腫病的主要侵染來源[7-8]，為有效預(yù)防根腫病的發(fā)生蔓延，對病原菌的早期、快速檢測尤為重要。

本研究將PMAxx預(yù)處理與qPCR相結(jié)合，建立了PMAxx-qPCR檢測蕓薹根腫菌活細胞的方法，并用于田間土壤中根腫菌活細胞的定量檢測，解決了qPCR技術(shù)不能判斷土壤中病原菌活性，容易造成目標病菌初侵染量高估的問題[21]，檢測時間由傳統(tǒng)生物測定方法的30—45 d[17]縮短至1—3 h，解決了傳統(tǒng)方法檢測周期長、準確性差、檢出率低等難題，為根腫病的早期預(yù)防和精準治療提供了技術(shù)支持。

3.2 PMAxx預(yù)處理條件優(yōu)化

對于不同的病原菌及濃度，區(qū)分細胞活性的最適PMAxx預(yù)處理條件不同。本研究對蕓薹根腫菌PMAxx預(yù)處理的最適終濃度和光照時間進行了優(yōu)化。PMAxx預(yù)處理濃度是影響區(qū)分活孢子和死孢子水平的重要因子。理想的PMAxx濃度應(yīng)該既保證與死孢子DNA充分共價結(jié)合，又不影響活孢子DNA的PCR擴增。使用不同濃度的PMAxx對1×108個孢子/mL蕓薹根腫菌菌懸液進行處理，并對處理后的菌懸液進行qPCR檢測。當PMAxx濃度低于4 μmol·L-1時，低濃度的PMAxx不能完全與死菌體DNA結(jié)合，無法充分抑制死孢子DNA的擴增，檢測的Ct值隨PMAxx濃度升高而逐漸增大，而當PMAxx濃度大于4 μmol·L-1時，死孢子DNA的擴增受到了顯著抑制，因此，抑制死細胞擴增的PMAxx最適終濃度為4 μmol·L-1。

PMAxx處理分為暗反應(yīng)和光反應(yīng)兩個階段，在暗反應(yīng)階段，PMAxx滲透進入死孢子，與死孢子DNA充分接觸；在光反應(yīng)階段，PMAxx與死孢子DNA發(fā)生不可逆的共價聯(lián)結(jié)，后續(xù)PCR擴增過程中抑制死孢子DNA的擴增。暗反應(yīng)階段處理時間越長，PMAxx滲透越充分，本試驗避光處理時間設(shè)置為30 min，以便PMAxx與死孢子DNA充分結(jié)合。光反應(yīng)階段，PMAxx光照預(yù)處理10 min后，PMAxx可以與DNA進行完全的共價結(jié)合，從而抑制死細胞DNA的擴增，而多余的PMAxx在光照處理10 min后，其光化學(xué)活性也會完全消失，不會影響qPCR過程，僅以有活力孢子DNA為靶標選擇性地擴增活菌。

3.3 PMAxx-qPCR檢測技術(shù)的應(yīng)用

對已知活孢子比例的蕓薹根腫菌混合體系進行檢測，無論活孢子比例是否變化，qPCR檢測的Ct值始終維持在穩(wěn)定水平。然而，隨著活孢子比例下降，PMAxx-qPCR測得的DNA濃度對數(shù)值也逐漸降低，并且與理論活孢子濃度對數(shù)值之間存在良好的線性關(guān)系。說明本研究建立的PMAxx-qPCR方法可以有效區(qū)分蕓薹根腫菌活孢子和死孢子。對田間收集的土壤樣本進行檢測，在25份樣本中有11份采自發(fā)病地塊的土壤樣本檢測到攜帶蕓薹根腫菌，根腫菌活細胞DNA濃度為32.35—6.97×103fg·g-1，而采自健康田塊的14份土壤樣本未檢測到根腫菌。盆栽試驗結(jié)果表明，當PMAxx-qPCR檢測土壤中根腫菌活細胞DNA濃度大于1.29×102fg·g-1時，有導(dǎo)致根腫病暴發(fā)的潛在危險。因此，PMAxx-qPCR檢測技術(shù)可以作為一種有效的工具用于十字花科蔬菜病害的早期診斷和預(yù)警。

4 結(jié)論

建立了基于PMAxx預(yù)處理結(jié)合qPCR的蕓薹根腫菌活細胞定量檢測技術(shù)，確定了PMAxx的最適終濃度和處理時間，該技術(shù)可以快速、準確、定量檢測菌懸液和土壤中的蕓薹根腫菌并區(qū)分病原菌的活性，準確反映實際樣本中帶活菌的情況，對于根腫病的預(yù)防和病原菌的早期診斷具有潛在的應(yīng)用價值。

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Establishment and Application of Rapid Quantitative Detection of Viableby PMAxx-qPCR Method

1Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;2Shandong Huasheng Agriculture Limited Company, Qingzhou 262500, Shandong

【Objective】is an obligate endoparasite that causes clubroot disease, which is the most devastating soil-borne disease in brassica crops. The propidium monoazide xx (PMAxx) could selectively bind to the chromosomal DNA of dead spores and therefore block DNA amplification by real-time fluorescent quantitative PCR (qPCR). In the present study, a strategy involving a PMAxx pre-treatment followed by the qPCR (PMAxx-qPCR) assay was developed for quantifying viable spores of,so as to provide a basis for early detection and prevention measurement of cloobroot disease. 【Method】PMA and PMAxx with concentrations of 0, 5, 10, 20, 40 and 60 μmol·L-1were prepared, respectively, and were used to pre-treatprior to DNA extraction, followed by qPCR. The inhibitory effects of PMA and PMAxx on DNA amplification ofdead spores were compared, and the optimal nucleic acid dye and concentration to distinguish between live and dead spores were determined. The illumination time was set as 0, 2, 5, 10, 15 and 20 min, respectively, and the optimal exposure time was optimized to establish a PMAxx-qPCR assay for selectively detection of viable spores of.The mixed suspensions with different ratios of dead and viable spores (0, 0.01%, 0.1%, 1%, 10%, 25%, 50%, 75% and 100% viable spores) were prepared to determine the suitability of PMAxx-qPCR assay for distinguishing viable and dead spores. The assay was also applied to quantitative detection of viable spores ofin 25 field soil samples. 【Result】PMAxx showed a better discrimination effect than PMA on the viable and dead spores of. When the concentration ofwas 1×108spores/mL, the optimal PMAxx concentration and light exposure time were 4 μmol·L-1and 10 min, respectively. The amplification of dead spores could be inhibited effectively, and only the DNA of living spores was targeted for selective amplification. For pre-defined ratio of viable spores, there was a good linear relationship between the lg of theDNA concentration assessed by PMAxx-qPCR and the theoretical viability (2=0.992). For soil samples, viablewas quantified in 11 of 25 samples, with infestation levels of approximately 32.35-6.97×103fg·g-1. 【Conclusion】The established method could quantitatively detect the viable spores of, with advantages of rapid, efficiency and sensitivity, which could be useful for avoiding the inability of qPCR method to distinguish between viable and nonviable spores. Application of the assay may potentially improvecontrol and disease management.

;clubroot disease; propidium monoazide xx (PMAxx); real-time fluorescent quantitative PCR (qPCR); viable spore

2021-11-18；

2021-12-20

國家重點研發(fā)計劃（2021YFD1600303）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-IVFCAAS）、國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-23）、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室開放課題（IVF2017）

李曉菁，E-mail：1041255425@qq.com。通信作者柴阿麗，E-mail：chaiali@caas.cn。通信作者李寶聚，E-mail：libaojuivf@163.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.10.005

（責(zé)任編輯 岳梅）