陰溝腸桿菌DJ鹽堿適應性研究

李宇興，王海嬌，薛思明，范亞軍

(長春師范大學生命科學學院，吉林 長春 130032)

多胺是小分子聚陽離子天然化合物，存在于除一些古生代以外的所有生物體中[1]，其正電荷與碳骨架相連，可以與生物多陰離子(主要是核酸)產生相互作用[2]。在植物中，腐胺、亞精胺和精胺不僅參與細胞的增殖、分化和程序性死亡等基本細胞過程，而且還參與對環(huán)境脅迫的適應性反應[3]。細菌主要只合成兩種多胺，腐胺和亞精胺[4]。對細菌中多胺功能的研究表明，多胺參與了許多生長以外的功能，包括結合到細胞壁和鐵載體的生物合成。它們在耐酸性方面也很重要，可以起到自由基離子清除劑的作用[5]。已有研究表明，多胺(PA)代謝與一些與應激相關的關鍵信號分子的形成有關的代謝途徑是相互聯(lián)系的。例如，PA的生物合成需要前體，這些前體也用于合成其他重要的應激相關代謝物，如S-腺苷蛋氨酸(SAM，參與乙烯代謝)、鳥氨酸(參與合成脯氨酸)和精氨酸(一氧化氮的前體)[6-8]。幾乎所有的真核生物都是在鳥氨酸脫羧酶(ODC)的催化下直接從鳥氨酸合成腐胺(Put)的。然而，植物還有另一條合成Put的途徑，該途徑是由精氨酸脫羧酶(ADC)作用，然后在胍丁胺亞氨基水解酶(AIH)和N-氨基甲酰-Put酰胺水解酶(CPA)的催化下連續(xù)兩步合成Put[9]。

在許多生物體中，PA還在基本的細胞過程中發(fā)揮調節(jié)分子的作用，包括細胞分裂、分化、基因表達、DNA和蛋白質合成以及細胞凋亡[10-12]。近年來大量研究表明外源多胺能夠增加植物抗逆性，保護植物免受不同類型非生物脅迫的傷害[13]。在植物中，PA參與了器官發(fā)生、胚胎發(fā)生、花的起始和發(fā)育、葉片衰老、花粉管生長、果實發(fā)育和成熟、對非生物和生物脅迫的響應等生理過程[14-23]。高等植物中最常見的PA有二胺腐胺、三胺亞精胺和四胺精胺[24]，可能以游離形式存在，在這種形式下，它們與小分子(如酚類化合物)共價結合，或者以不溶性結合形式存在，以不溶性結合形式存在的多胺與核酸和蛋白質等大分子共價結合[25]。大量研究表明，游離多胺(主要是腐胺、亞精胺、精胺及其異構體熱敏胺)以及多胺氧化產物(過氧化氫和γ-氨基丁酸)在植物發(fā)育的不同過程中都是必需的，并參與非生物和生物脅迫反應[26]。

在前期從吉林省西部草原地區(qū)羊草根際分離出產多胺菌DJ，利用16S rDNA法對其菌種進行鑒定，鑒定結果為陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)。本實驗旨在對 DJ菌在鹽堿條件下適應性進行初步研究，進而為進一步開發(fā)及推廣植物促生菌的應用提供理論及實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗菌株為羊草根際土壤菌DJ，前期已進行篩選和保存。

實驗試劑為ADF培養(yǎng)基1 L：KH2PO44 g，Na2HPO46 g, MgSO4·7H2O 0.2 g，葡萄糖2 g，葡萄糖酸2 g, 檸檬酸2 g，精氨酸/鳥氨酸 2 g，調節(jié)pH值至7，定容至1 L，121℃條件下高溫滅菌30 min備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 DJ菌在不同底物培養(yǎng)基中生長狀況分析

分別配制pH值為7以精氨酸和鳥氨酸為底物的培養(yǎng)基，1∶100接種等量DJ菌(每組重復3 次)，搖床培養(yǎng)2、4、8、12、24 h，在波長600 nm處測量DJ菌在不同時間段吸光度(OD值)變化并分析結果。

1.2.2 DJ菌最適生長條件的研究

分別配制pH值為4、5、7、8、9的ADF培養(yǎng)基，1∶100接種等量DJ菌(每個梯度重復3 次)，搖床培養(yǎng)2、4、8、12、24 h，在波長600 nm處測量DJ菌在不同時間段OD值變化，并對其生長狀況進行分析。

1.2.3 DJ菌在鹽堿條件下生長狀況分析

在ADF培養(yǎng)基中加入30 mmol/L NaCl并調節(jié)pH值至9,模擬鹽堿環(huán)境，以pH值7為對照組，配制ADF半固體培養(yǎng)基，瓊脂濃度為0.28%，在平板中心接入0.5 μL DJ菌液(每組重復3 次),在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并測量菌圈大小。

2 結果與分析

2.1 DJ菌在不同底物培養(yǎng)基中生長狀況分析

多胺在生物體內的合成主要以精氨酸或鳥氨酸為底物，分別以這兩種底物培養(yǎng)基對DJ菌進行培養(yǎng)，并檢測了在不同時間段DJ菌的生長狀況，結果如圖1所示，DJ菌在以精氨酸為底物的培養(yǎng)基中生物量更高，生長狀況更好(*表示P<0.05,**表示P<0.01)，所以在后續(xù)研究中選用以精氨酸為底物的培養(yǎng)基對其進行培養(yǎng)。

圖1 在不同底物培養(yǎng)基中DJ菌的生長狀況

2.2 DJ菌在不同pH條件下生長狀況分析

為了確定DJ菌的最適生長pH條件,配制不同pH值ADF培養(yǎng)基，在不同pH值條件下對DJ菌進行培養(yǎng)，測量其不同時間段OD值變化，結果如圖2所示，DJ菌在中性偏堿的條件下生長狀況更好，說明其最適生長條件為中性偏堿環(huán)境。

圖2 不同pH 值對DJ菌生物量的影響

2.3 DJ菌在鹽堿條件下生長狀況分析

為進一步分析DJ菌在鹽堿條件下的適應情況，在培養(yǎng)基中加入30 mmol/L NaCl并調節(jié)pH值至9，模擬鹽堿條件，以pH值7為對照組，培養(yǎng)24 h后觀察，結果如圖3所示，模擬鹽堿組菌圈直徑大小與對照組相比有顯著差異(**表示P<0.01)，在模擬鹽堿組平板中DJ菌菌圈明顯大于對照組，說明DJ菌在鹽堿條件下趨動性更強，比較適應在鹽堿環(huán)境中生長。

圖3 半固體流動平板實驗結果

3 結果與討論

土地鹽堿化會導致大面積土地荒漠化及土地資源流失，致使生態(tài)失衡，是當前農業(yè)發(fā)展面臨的主要問題[27]。目前植物根際微生物引起越來越多的重視，植物根際微生物可以改善土壤結構，增加土壤營養(yǎng)，有些促生菌類能夠增加植物非生物脅迫下的抗性，調節(jié)植物的生長發(fā)育，促進植物生長。近年來從土壤中分離出多株具有降解農藥等環(huán)境污染物、增加植物抗性促進植物生長作用的陰溝腸桿菌菌株，研究表明，不同植物結合使用陰溝腸桿菌后能加速對土壤中污染物的降解[28-31]。另外，在鹽脅迫條件下陰溝腸桿菌能夠調節(jié)自身基因表達，合成對植物有益的多肽或激素類物質，提高作物抗氧化能力及作物產量。本研究中對前期分離產多胺陰溝腸桿菌DJ在不同pH值條件下進行培養(yǎng)，結果表明其在中性偏堿條件下生長較好，由于多胺的合成主要以精氨酸或鳥氨酸為底物，我們測試了這兩種底物培養(yǎng)基中DJ菌生長狀況，結果表明，DJ菌在以精氨酸為底物的培養(yǎng)基中生長狀況更好，之后利用半固體流動平板模擬鹽堿環(huán)境對其進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其在鹽堿環(huán)境中DJ菌菌圈明顯大于對照組，說明DJ菌在鹽堿條件下趨動性更強，有更好的適應性。但其鹽堿條件下的適應機制目前尚不明確，需要后續(xù)進行進一步的深入研究。