加酶回流法提取廣西凌云縣特產(chǎn)川木瓜總黃酮的工藝優(yōu)化

＊李振中 夏小燕 莫斯銳 李容 黃鎖義

（右江民族醫(yī)學院藥學院，右江民族醫(yī)學院廣西高校右江流域特色民族藥研究重點實驗室 廣西 533000）

川木瓜也稱皺皮木瓜，別名有貼梗海棠、貼梗木瓜、鐵腳海棠、鐵桿海棠、鐵腳梨、川木瓜、宣木瓜?？茖俜诸悶樗N薇科木瓜屬，是我國特有的珍稀水果之一，有很高的藥用價值和食用價值。川木瓜的功效作用為健脾消食、抗疫殺蟲、抗痙攣，具有防治高血壓、腎炎、便秘和助消化、治胃病，對人體有促進新陳代謝和抗衰老的作用，還有美容護膚養(yǎng)顏的功效[1]。本試驗以凌云縣特產(chǎn)川木瓜為原料探究川木瓜中總黃酮的提取工藝優(yōu)化。

1.材料與方法

(1)材料

①供試原料。薔薇科川木瓜，產(chǎn)地為廣西百色市凌云縣，使用前晾干，粉碎備用。

②主要試劑。乙醇；纖維素酶，北京索萊寶科技有限公司；亞硝酸鈉，西隴化工有限股份公司；硝酸鋁，天津市光復精細化工研究所；氫氧化鈉，西隴化工有限股份公司；蘆丁，上海源葉生物科技有限公司。

③主要儀器。冷凝管；500mL圓底燒瓶；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6，國華電器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-3000，上海亞榮生化儀器廠；FA1104型電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；SHZ-Ⅲ A循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

(2)試驗方法

①蘆丁標準溶液配制[2]。精密稱定蘆丁0.2000g，加蒸餾水并定容至100.00mL容量瓶中，稀釋得0.20mg/mL蘆丁標準溶液，于0℃條件下冷藏備用。

②樣品溶液制備。稱取廣西凌云川木瓜干粉10g和纖維素酶50mg于200mL燒杯中，再加入醋酸-醋酸鈉溶液（pH=4.5）40mL浸潤，于50℃恒溫下攪拌45min，移入500mL圓底燒瓶中。在80℃恒溫條件下加入70%乙醇200mL回流提取90min，趁熱抽濾，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，濃縮液用水飽和正丁醇萃取，取上層液于500mL燒杯，置通風環(huán)境下將正丁醇揮發(fā)完全，得總黃酮浸膏。取少量70%乙醇將總黃酮浸膏溶解，移到25ml容量瓶中，再用70%乙醇定容到刻度線，于0℃環(huán)境下冷藏備用。取300μl樣品溶液測定其中總黃酮化合物含量。

③確定測量波長[3-4]。在兩支10.00mL容量瓶中，分別加入300μl蘆丁標準溶液和樣品溶液，再加入0.30mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置10min；加入0.30mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置10min；再加入1.00mL 5%氫氧化鈉溶液，加水至刻度，搖勻，放置30min。以試劑空白為參比溶液。紫外可見分光光度計在200～800nm波長范圍內(nèi)進行波長掃描，結(jié)果二者均在510nm處有最大吸收，因此選擇510nm為含量測定波長。

④蘆丁標準曲線的建立[5]。精密量取0.00mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL、3.00mL 0.20mg/mL的蘆丁標準溶液分別于10mL容量瓶中，加入0.30mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置10min；加入0.30mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置10min；再加入1.00mL 5%氫氧化鈉溶液，加水至刻度，搖勻，放置30min。于510nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，得圖1，得到回歸方程A=22.009c+0.0216，R=0.994，在試驗測定范圍內(nèi)有良好的線性關系。

圖1 蘆丁標準曲線

⑤總黃酮的含量檢測[6-7]。精密吸取樣品液0.30mL，置10.00mL容量瓶中，按“1.2.4”測定方法測其吸光度值，根據(jù)回歸方程計算樣品中總黃酮的含量，并計算其提取率。川木瓜中總黃酮提取率的計算公式：

⑥正交試驗設計[6-8]。根據(jù)單因素試驗結(jié)果設計L9（3^4）探索乙醇溶液體積分數(shù)、料液比、回流時間、加酶量四個因素對川木瓜總黃酮類化合物提取率的影響。相關設計見表1。

表1 正交試驗因素水平設計

2.結(jié)果與分析

(1)單因素提取試驗

①乙醇體積份數(shù)對凌云縣特產(chǎn)川木瓜總黃酮提取率的影響。在回流提取中，選擇不同體積分數(shù)的乙醇作為溶劑，所得不同的提取率見圖2。根據(jù)相似相溶的原理，極性相似的情況下，川木瓜中的總黃酮類化合物與70%乙醇的極性最為接近，所以提取率最高。

圖2 乙醇體積分數(shù)(%)對川木瓜總黃酮提取率的影響

②料液比對凌云縣特產(chǎn)川木瓜總黃酮提取率的影響。由圖3可以看出，在取樣原料質(zhì)量不變的前提下，提取過程中加入不同體積的乙醇對黃酮提取率也有不一樣的影響。提取率首先從1:10g/mL到1:20g/mL緩慢上升，然后從1:20g/mL到1:40g/mL逐漸下降。造成這個現(xiàn)象的原因推測是因為乙醇的用量會影響川木瓜中提取出來的總黃酮在溶劑中的溶解，從而影響提取率。

圖3 料液比(g/mL)對凌云縣特產(chǎn)川木瓜總黃酮提取率的影響

③回流時間對凌云縣特產(chǎn)川木瓜總黃酮提取率的影響?；亓鲿r間長短，對黃酮的提取也有一定的影響，隨著回流時間的變化，提取率先是上升后下降。如圖4所示，在90min前提取率緩慢上升，90min后，提取率驟降。90min前提取率低可能是因為原料還未反應完全，原料結(jié)構(gòu)還沒壞完全。90min后提取率低的原因可為溶解出來的總黃酮被持續(xù)的反應破壞了。

圖4 回流時間(min)對凌云縣特產(chǎn)川木瓜總黃酮提取率的影響

④加酶量對凌云縣特產(chǎn)川木瓜總黃酮提取率的影響。在回流之前需要對原料進行酶處理。加的酶多少，對提取率存在較大影響。由圖5可知，隨著加酶量的增加，提取率先升后降，其中加酶50mg為最佳。少于50mg，一定量的原料的細胞壁未被破壞完全，所以總黃酮溶出得少。多于50mg，加的酶過多，酶的濃度對酶的作用產(chǎn)生自身抑制，從而導致提取率下降。

圖5 加酶量(mg)對凌云縣特產(chǎn)川木瓜總黃酮提取率的影響

⑤提取溫度對凌云縣特產(chǎn)川木瓜總黃酮提取率的影響。從圖6看出80℃以下，總黃酮類化合物提取率一直為上升趨勢，到80℃以上的溫度提取率才緩慢下降。高溫會影響原料中分子結(jié)構(gòu)，隨著溫度升高，分子運動越劇烈，越容易脫離原有結(jié)構(gòu)，進入到溶劑分子中去。溫度高于90℃時，可能由于總黃酮結(jié)構(gòu)受到高溫破壞以致提取率下降。

圖6 提取溫度(℃)對凌云縣特產(chǎn)川木瓜總黃酮提取率的影響

(2)正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表2。從表2可以看出，各因素對川木瓜總黃酮類化合物提取率影響大小依次為乙醇體積分數(shù)、料液比、回流時間、加酶量，最佳提取組合為A2B1C2D3，此條件下總黃酮提取率為0.2158%，高于正交試驗其他組合。

表2 正交試驗結(jié)果

(3)分析方法的評價

①精密度試驗[9-10]。精密吸取樣品溶液0.30mL置于5個10mL容量瓶中，平行5份，按“1.2.3”的方法測定。結(jié)果RSD值為1.26%，重現(xiàn)性試驗符合要求。

表3 精密度實驗結(jié)果

②穩(wěn)定性試驗。精密吸取樣品溶液0.30mL于5個10mL容量瓶中，平行5份，按照上述方法于0min、30min、60min、90min、120min后測定吸光度，RSD為1.25%，結(jié)果表明在120min以內(nèi)基本穩(wěn)定。

表4 穩(wěn)定性實驗結(jié)果

③回收率試驗。精密吸取配置的蘆丁標準溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分別置10mL的容量瓶中，再分別加入“1.2.2”配制的樣品待測溶液0.30mL，分別測定其總黃酮含量，計算加樣回收率，RSD為1.38%。

表5 加標回收率實驗結(jié)果

3.結(jié)論

采用廣西凌云縣特產(chǎn)的川木瓜作為原料進行總黃酮提取工藝優(yōu)化探究，通過進行單因素試驗和正交試驗探索了乙醇體積分數(shù)、料液比、回流時間、加酶量、提取溫度對總黃酮提取率的影響。最終得出的結(jié)論是在以乙醇體積分數(shù)為70%，料液比為1:10g/mL，回流時間90min，加酶量為70mg，提取溫度為80℃等的五個因素水平為最佳提取條件，提取率高，為0.2158%。本試驗方法操作簡單，重現(xiàn)性、穩(wěn)定性良好，可為廣西凌云縣特產(chǎn)川木瓜的開發(fā)提取提供優(yōu)化依據(jù)。