基于生物信息技術(shù)分析人參皂苷防治乳腺癌的作用機(jī)制

吳勤研,藍(lán)曉紅,吳 波,魏 瑋,李薛梅,初曉玲,高 茗

0 引 言

乳腺癌是女性患者最常見的一種惡性腫瘤，國際的發(fā)病率在11%左右，而我國的乳腺癌發(fā)病率占女性患者的16%左右，在女性患者惡性腫瘤發(fā)病率占第一位，其發(fā)病率、致死率高，嚴(yán)重威脅女性健康[1-2]。乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險是隨著年齡增大而升高，但隨著生活環(huán)境、作息習(xí)慣的改變，生活壓力聚增，乳腺癌的發(fā)病年齡逐漸呈年輕化的趨勢?，F(xiàn)階段治療乳腺癌的方法有手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療、靶向藥物治療和抗體藥物偶聯(lián)劑治療等，但伴隨惡心、嘔吐、骨髓抑制、心血管系統(tǒng)障礙和耐藥性增加等諸多不良反應(yīng)[3]。中藥屬于天然藥物，相比合成藥物而言，刺激性和毒副作用小，不少研究學(xué)者提出中醫(yī)藥充當(dāng)輔助用藥[4]。人參是我國古老的中藥材之一，具有補(bǔ)氣生津、扶正祛邪、補(bǔ)脾益肺和安神益智等功效[5-6]?，F(xiàn)代藥理研究表明人參可以增強(qiáng)記憶力[7],提高免疫力[8]，抗衰老[9]和抗腫瘤[10-11]等藥理作用。人參皂苷是人參的主要藥效成分，由糖和苷元連接而成，常見的單體皂苷有Rg1、Rb1、Rc、Re、Rd、Rf和Rg1等等?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道了單一皂苷抗腫瘤效果，尚不能反映整體效果和毒副作用。筆者依托生物信息技術(shù)，比較人參皂苷組與空白對照組，獲取差異表達(dá)基因，分析基因功能與代謝通路的作用機(jī)制，闡釋人參皂苷防治乳腺癌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料所用平臺：基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫STRING(https://string-db.org/)，用于注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫DAVID 6.8(http//david-d.ncifcrf. gov/tools. jsp)；軟件：生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)分析盒子SangerBox(http://vip. sangerbox.com/home.html)，可視化分析軟件Cytoscape 3.7(https://cytoscape.org/)，圖像處理軟件GraphPad Prism 8(https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/)。

1.2 方法

1.2.1 基因芯片獲取與差異基因的篩選在GEO數(shù)據(jù)庫輸入GS85871，得到關(guān)于人乳腺癌細(xì)胞MCF7的芯片信息(分析平臺為GPL571)。先將樣本進(jìn)行分組：“Treatment”為人參皂苷(Rg1、Rb1、Rb3、Rc、Rb2、Re和Rd)干預(yù)組，“Control”為空白對照組。然后運(yùn)用在線分析工具GEO2R對20個樣本進(jìn)行分析(其中人參皂苷干預(yù)組有14個樣本，空白對照組有6個樣本)，并設(shè)置篩選條件(P<0.05,∣log2FC∣≥1)[12-14]。

1.2.2 蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)分析將篩選后的差異基因?qū)氲絊TRING平臺，設(shè)置種族為“Homo sapiens”，最低工作閾值為0.4，其他參數(shù)默認(rèn)[15]，提交。將所得結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7軟件，用“Network analyzer”工具對結(jié)果進(jìn)行分析，按度值(Degree)進(jìn)行排序，得到核心基因(篩選條件Degree≥5)。

1.2.3 基因本體(GO)和京都基因百科全書KEGG通路富集將差異基因?qū)隓AVID 6.8平臺，種族設(shè)置為“Homo sapiens”，選擇標(biāo)識符設(shè)置為“Offical gene symbol”，得到基因本體(GO)功能富集和KEGG信號通路富集分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 差異基因的篩選與分析將人參皂苷干預(yù)組與空白對照組組進(jìn)行比較，得到182個差異基因，其中上調(diào)有110個，下調(diào)有72個。運(yùn)用SangerBox繪制火山圖，見圖1；利用GraphPad Prism 8軟件繪制前30個上調(diào)基因或下調(diào)基因的熱圖，見圖2。

綠色點(diǎn)表示下調(diào)基因，紅色點(diǎn)表示上調(diào)基因，點(diǎn)距離中線越遠(yuǎn)，差異倍數(shù)越大

藍(lán)色方塊表示下調(diào)，黃色方塊表示上調(diào)

2.2 基因本體(GO)功能富集分析分別將上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)基因?qū)氲紻AVID 6.8平臺，進(jìn)行GO富集分析。上調(diào)基因富集在細(xì)胞外間隙、軸突、突觸后膜和質(zhì)膜外側(cè)，主要參與細(xì)胞黏附、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控、軸突導(dǎo)向、對缺氧的反應(yīng)和膠質(zhì)細(xì)胞遷移等生物過程，見表1。下調(diào)基因顯著富集在胞外區(qū)、蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外間隙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔和質(zhì)膜，主要參與對 cAMP 的反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞遷移的正調(diào)控、血小板脫粒、細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏附、細(xì)胞表面受體信號通路和血管生成的負(fù)調(diào)控等生物過程，見表2。

表1 上調(diào)基因的GO功能注釋(涉及生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組成)

表2 下調(diào)基因的GO功能注釋(涉及生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組成)

2.3 京都基因百科全書KEGG通路富集上調(diào)基因富集主要在甲狀旁腺激素合成、分泌和作用(hsa04928)、GnRH 分泌(hsa04929)、阿米巴病(hsa05146)和多巴胺能突觸(hsa04728)。下調(diào)基因富集主要在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(hsa04060)、PI3K-Akt 信號通路(hsa04151)和ECM-受體相互作用(hsa04512)等。差異表達(dá)基因富集主要在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(hsa04060)、阿米巴病(hsa05146)、弓形體病(hsa05145)、癌癥中的微小RNA(hsa05206)、ECM-受體相互作用(hsa04512)、2型糖尿病(hsa04930)和瘧疾(hsa05144)。見圖3。

a:上調(diào)基因通路富集;b:下調(diào)基因通路富集;c:差異表達(dá)基因通路富集

2.4 差異表達(dá)基因蛋白互作PPI分析將差異表達(dá)基因?qū)隨TRING平臺，設(shè)置相應(yīng)參數(shù)，得到蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖4，圖中有169個節(jié)點(diǎn)(無效基因有13個)，184條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值為2.18，PPI富集校正值為2.56×10-8；然后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7軟件，計(jì)算拓?fù)渚W(wǎng)路的度值，并按度值進(jìn)行排序，設(shè)置篩選條件，得到9個核心基因，分別是VEGFA,BMP4,SPARC,PLG,ITGB2,TEK,SERP,INA1,SERPINB5和IGFBP7,對核心基因進(jìn)行蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖5，圖中有9個節(jié)點(diǎn)，19條邊，平均度值4.22，PPI富集校正值為2.59×10-11。

圖4 差異基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 核心基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

中醫(yī)理論認(rèn)為“正氣存內(nèi)，邪不可干”、“邪不能獨(dú)傷人”，正氣虛弱是腫瘤發(fā)病的主要因素，體內(nèi)正氣不足時出現(xiàn)外邪侵體，損傷人體臟腑氣血，長年累月則發(fā)病，因此扶正祛邪是中醫(yī)藥治療乳腺癌的關(guān)鍵所在[16]?，F(xiàn)代中醫(yī)運(yùn)用人參、熟地、白術(shù)、茯苓以益氣健脾，可通過增強(qiáng)淋巴細(xì)胞增殖、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，同時誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制腫瘤發(fā)展。大量研究報(bào)道人參皂苷抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，被廣泛運(yùn)用于抗乳腺癌的輔助用藥中，但其生物學(xué)作用機(jī)制尚不清楚[17-19]。生物信息技術(shù)作為現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)發(fā)展的產(chǎn)物，融合了基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、免疫組學(xué)、代謝組學(xué)等多組學(xué)的數(shù)據(jù)集，利用微陣列、高通量測序工具，從基因、蛋白質(zhì)序列出發(fā)，分析相關(guān)的生物信息，并通過大數(shù)據(jù)篩選出與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)的基因，通過對目標(biāo)基因的分析，可以預(yù)測藥物的作用機(jī)制及可能引起的不良反應(yīng)[20-21]。筆者采用生物信息學(xué)的技術(shù)方法從GEO數(shù)據(jù)庫中挖掘人參皂苷作用于乳腺癌的基因芯片(GSE85871)。通過比較人參皂苷干預(yù)組與乳腺癌細(xì)胞組(MCF3/Adr)，得到人參皂苷調(diào)控乳腺癌的差異表達(dá)基因有182個(其中上調(diào)有110個，下調(diào)有72個)。在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用STRING平臺構(gòu)建差異表達(dá)基因蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)，并運(yùn)用David6.8平臺進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析得到核心基因VEGFA,PLG,SPARC,BMP4,TEK,SERPINA1,SERPINB5,ITGB2和IGFBP7，其中VEGFA,PLG和SPARC在網(wǎng)絡(luò)中的分值較高，在疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。血管內(nèi)皮生長因子A(vascularendothelial growth factor A，VEGFA)屬于VEGF家族成員中的一員，在調(diào)控血管生成網(wǎng)絡(luò)中起重要著作用[22]。正常組織受到外界創(chuàng)傷以及女性生理月經(jīng)周期，血管生成通路將會被激活，進(jìn)而形成新血管[23]。腫瘤組織中VEGFA過度表達(dá)，形成新生血管量高于正常組織，影響周圍正常組織細(xì)胞生理代謝[24]。纖溶酶原(plsmingen, PLG)是血漿纖維蛋白水解酶的無活性前體，屬于絲氨酸蛋白酶，被組織激活物t-PA、尿激酶或凝血接觸階段多種酶激活，轉(zhuǎn)變成纖溶酶溶解纖維蛋白。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)纖溶酶能促進(jìn)細(xì)胞遷移，參與了乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[25-26]。富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白(cysteine-rich acidic secreted protein, SPARC)是一種小分子酸性糖蛋白，廣泛分布在生物體內(nèi)，參與組織重建、形態(tài)生成、細(xì)胞遷移和增殖，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[27-28]。與對照組比較，人參皂苷干預(yù)后乳腺癌細(xì)胞的VEGFA、PLG和SPARC表達(dá)降低，推測人參皂苷作用于上述靶點(diǎn)基因抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移。

GO生物過程涉及細(xì)胞黏附、發(fā)芽血管生成、細(xì)胞遷移與癌細(xì)胞的生長繁殖密切相關(guān)。KEGG結(jié)果發(fā)現(xiàn)12條信號通路，主要包括細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用信號通路、阿米巴病信號通路、弓形蟲病信號通路、癌癥中的微小RNA信號通路和ECM-受體相互作用信號通路等，其中細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、癌癥中的微小RNA和ECM-受體相互作用信號通路與癌細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移有著密切聯(lián)系。細(xì)胞因子是由免疫原或其他因子刺激細(xì)胞產(chǎn)生，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和分化、調(diào)節(jié)免疫、參與炎癥發(fā)生和創(chuàng)傷愈合等功能的小分子多肽的總稱。細(xì)胞因子通過結(jié)合細(xì)胞表面相應(yīng)的細(xì)胞因子受體而發(fā)揮生物學(xué)作用。細(xì)胞因子和其受體的結(jié)合是細(xì)胞因子介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的啟動刺激。大多數(shù)細(xì)胞因子對乳腺癌細(xì)胞具有抑制生長、促進(jìn)凋亡的負(fù)面作用，同時具有促進(jìn)生長繁殖、為侵襲轉(zhuǎn)移提供條件的作用。微小RNA(又稱miRNA)是一類小分子非編碼RNA，在乳腺癌中可扮演癌基因或抑癌基因，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移級聯(lián)反應(yīng)各個階段起到促進(jìn)或抑制作用，與腫瘤的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤干細(xì)胞的生存高度相關(guān)[29]，miRNA作為乳腺癌早期診斷的標(biāo)識物在臨床上被廣泛運(yùn)用。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM) 是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，由支持細(xì)胞和組織架構(gòu)的蛋白質(zhì)、糖蛋白和多糖組成的復(fù)雜混合物，與特定細(xì)胞表面受體結(jié)合，激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)等途徑促進(jìn)多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥性的形成。此外，ECM蛋白降解過程中釋放調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活性的肽類分子(統(tǒng)稱細(xì)胞外基質(zhì)活性素matrikine)，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞活性和血管生成，并參與腫瘤分化、浸潤和侵襲過程。以上研究表明人參皂苷主要通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、生長及血管形成途徑來防治乳腺癌。

綜上所述，人參皂苷通過對多個基因、多個靶點(diǎn)和多條信號通路來抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、分化和侵襲。本文選取的人參皂苷單體成分較為局限，不能完全反映人參抗癌物質(zhì)成分。此外，現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道人參多糖對癌細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用。因而，抗癌活性成分篩選及相關(guān)機(jī)制仍需深入研究。