丹參多酚酸介導(dǎo)PIDD通路改善大鼠缺血性腦損傷的機制研究

李 蒙，何地芹，曹自為，管葉明，黃海麗，汪青松

0 引 言

腦梗死作為神經(jīng)系統(tǒng)的常見疾病，發(fā)病率高和致死、致殘率高以及復(fù)發(fā)頻率高是它的主要特點[1]，而神經(jīng)細胞凋亡是腦缺血再灌注損傷的主要形式。目前，溶栓治療是有效治療手段，但其存在嚴格的治療時間窗限制以及再灌注后出血等并發(fā)癥[2]。丹參多酚酸 (salvianolate,SA) 是丹參的提取物，SA主要包括丹酚酸B、丹酚酸E、紫精酸和迷迭香酸。已報道SA具有微循環(huán)、抗炎、抗氧化、清除氧自由基等作用[3-4]。我們課題組的既往研究表明：SA可以通過促進沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)轉(zhuǎn)錄、抑制高遷移率族蛋白B1(HMGB1)遷移和表達，減少下游的炎癥因子p53、核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)的釋放，與此同時抑制神經(jīng)細胞凋亡，進而減輕大鼠腦缺血損傷[5]。

p53誘導(dǎo)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(p53-induced protein with a death domain,PIDD)是Lin等[6]和 Telliez等[7]首次在其研究課題中描述的一種蛋白質(zhì)，作為p53蛋白的靶基因，PIDD能調(diào)節(jié)細胞周期與細胞凋亡，決定p53基因能否響應(yīng)下游的應(yīng)激反應(yīng)。既往多項研究表明，caspase-2、caspase-3等細胞蛋白與PIDD相互作用可以調(diào)節(jié)細胞的凋亡與存活。PIDD的研究大多數(shù)關(guān)注于腫瘤的治療,PIDD與腦缺血性損傷中神經(jīng)細胞凋亡的關(guān)系較少報道。因此，我們推測SA可以通過介導(dǎo)PIDD途徑改善大鼠腦缺血損傷。

本實驗采用建立大鼠大腦中動脈栓塞模型的方式進行研究，通過大鼠尾靜脈注入SA及PIDD抑制劑BubR1(Bub-ralated1，即紡錘體檢測點spindle assembly checkpoin的重要組成成分)，觀察缺血再灌注大鼠腦組織中PIDD表達變化及其與caspase-2、caspase-3等下游靶標(biāo)分子的關(guān)系，以及SA能否通過介導(dǎo)PIDD表達而發(fā)揮抗凋亡作用，從而減輕腦缺血神經(jīng)功能損傷，為缺血性腦損傷的臨床治療提供有力的探索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組所有動物協(xié)議均經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院動物護理和使用機構(gòu)委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號:LLSC20180149)。40只SPF級SD雄性大鼠，7～8周齡,體重在250～280 g之間,購于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(實驗動物許可證號:34072922010002554)。將大鼠置于自然光照環(huán)境下，給予自由飲水及進食1周。隨機將所有大鼠分為4組: 假手術(shù)組、缺血模型組、丹參多酚酸組、PIDD抑制劑組，每組10只。

1.2 動物模型制備及干預(yù)腦缺血模型按照Miao等[8]的方法建立。通過腹側(cè)、中線切口暴露出右側(cè)頸總動脈 (CCA)、頸外動脈 (ECA) 和頸內(nèi)動脈 (ICA)。將具有圓形尖端(頭端直徑0.53 mm)的尼龍單絲縫合線引入 CCA 管腔并輕輕推進到 ICA 中，直到它阻塞大腦中動脈(MCA)的分叉起點。閉塞后2 h，通過撤回縫合線直到其尖端清除CCA的管腔，對動物進行重新麻醉和再灌注。所有的實驗都是隨機的。在缺血期間，死亡、昏迷或抽搐的大鼠被排除在實驗之外。將SA(天津天士力子嬌藥業(yè)有限公司)和PIDD抑制劑(BubR1)分別溶于5%二甲基亞砜(DMSO)中，丹參多酚酸組和抑制劑組于術(shù)前1 h 100 mg/kg腹腔注射。在同樣的時間點給假手術(shù)組和缺血模型組大鼠腹腔注射等量的等滲鹽水。

1.3 神經(jīng)功能缺損評分模型制備成功后分別在缺血再灌注后1 d、3 d、7 d對3組大鼠進行評分，采用改良的神經(jīng)功能缺損評分(modified neurological severity scores, mNSS)[9]，共 18分,其中輕度：1～6分; 中度：7～12分;重度：13～18分。

1.4 Western blot法檢測梗死灶腦組織PIDD、caspase-2、t-BID、細胞色素-c、caspase-3的蛋白表達在腦梗死區(qū)域取腦組織標(biāo)本。第一步：提取組織勻漿及蛋白。剪取組織并稱重，每個樣品重量控制在100 mg左右，加入1 mL RIPA細胞裂解液(內(nèi)含1 mM PMSF)進行裂解，采取11 280×g,保持4 ℃離心15 min，收集含有組織總蛋白的上清液。第二步：電泳。配制10%SDS-PAGE凝膠備用，在收集的上清液中按照1∶4加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，經(jīng)上樣后進行垂直電泳；分離后采用濕法轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜上，漂洗5 min后加入4%牛血清白蛋白(BSA)，在搖床上緩慢搖動,室溫封閉2 h；分別加入一抗維持4 ℃孵育過夜，洗滌后加入二抗室溫再孵育2 h，并再次洗滌；最后使用化學(xué)發(fā)光試劑盒來檢測蛋白。

1.5 熒光定量實驗檢測梗死灶腦組織中PIDD mRNA 表達取標(biāo)本于梗死灶腦組織，按試劑盒說明書提取總RNA。第一步：RT反應(yīng)。在0.2 mL 離心管中，加入總RNA(質(zhì)量為1 μg)、10 μM低聚核苷酸(Oligo)(dT)1 μL、焦碳酸二乙酯水補足至12 μL，混勻、點動離心，PCR儀上65 ℃加熱5 min，立即冰浴3 min，在上述EP管中加入各種試劑，置于42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，最后取出上述反應(yīng)液，即為cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?。第二步：熒光定量PCR反應(yīng)。取出cDNA作為熒光定量的模板，反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min、95 ℃5 s、60 ℃30 s、40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參物，2-ΔΔCT計算所得結(jié)果。

1.6 TUNEL法檢測各組梗死灶腦組織神經(jīng)細胞凋亡情況為了研究 SA 是否可以改善腦缺血引起的神經(jīng)細胞凋亡，使用大鼠局灶性腦缺血模型計算梗死灶腦組織神經(jīng)細胞凋亡指數(shù) (AI)。4組分別取10只大鼠于缺血再灌注7 d后取缺血腦組織，制成石蠟切片，根據(jù)操作說明使用ApopTag 熒光素原位凋亡檢測試劑盒 (Roche) 進行TUNEL法檢測，顯微鏡下觀察細胞核中含有棕褐色顆粒者為凋亡細胞，計算4組神經(jīng)細胞凋亡率進行比較，細胞凋亡指數(shù)(AI)為視野內(nèi)凋亡細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比。

2 結(jié) 果

2.1 各組在不同時間點神經(jīng)功能損傷評分結(jié)果假手術(shù)組在各時間點評分均為0分。其余3組在缺血再灌注后1 d的評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與缺血模型組比較,丹參多酚酸組神經(jīng)功能缺損評分在3 d、7 d明顯降低(P<0.01)。與抑制劑組比較，丹參多酚酸組的神經(jīng)功能缺損評分在3 d、7 d明顯增加(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠缺血再灌注后不同時間神經(jīng)功能缺損評分比較分)

2.2 SA對梗死灶腦組織PIDD mRNA表達的影響與假手術(shù)組比較，缺血模型組缺血再灌注后1 d、3 d和7 d的PIDD mRNA水平顯著升高(P<0.01)。與缺血模型組比較，丹參多酚酸組缺血再灌注后1 d、3 d和7 d的PIDD mRNA水平顯著降低(P<0.01)，并且抑制劑組PIDD mRNA水平降低得更多(P<0.01)，表明SA可以顯著抑制缺血模型大鼠PIDD mRNA表達。見表2。

表2 各組大鼠缺血再灌注不同時間PIDD mRNA表達水平比較

2.3 SA對梗死灶腦組織PIDD、caspase-2、t-BID、細胞色素-c和caspase-3蛋白表達缺血模型組、丹參多酚酸組和抑制劑組缺血再灌注后PIDD表達明顯高于假手術(shù)組(F=663.398、231.584、182.711，P<0.01)，丹參多酚酸組缺血再灌注后PIDD 蛋白表達低于缺血模型組，高于抑制劑組(F=67.700、141.168、871.009，P<0.01)，見圖1。丹參多酚酸組、缺血模型組和抑制劑組缺血再灌注后7d的caspase-2、t-BID、細胞色素-c和caspase-3的表達均顯著高于假手術(shù)組(F=2019.980、304.864、299.969、699.548，P<0.01)，丹參多酚酸組再灌注后7d的caspase-2、t-BID、細胞色素-c和caspase-3 蛋白的表達顯著低于缺血模型組但略高于抑制劑組(F=210.997、1027.480、613.917、612.462，P<0.01)，見圖2。

與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與丹參多酚酸組比較，#P<0.01

與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與缺血模型組及抑制劑組比較，#P<0.01

2.4 SA對梗死灶腦組織神經(jīng)細胞凋亡的影響假手術(shù)組、缺血模型組、丹參多酚酸組和抑制劑組大鼠腦缺血再灌注后7 d神經(jīng)細胞AI分別為(5.02±1.32)%、(53.25±4.16)%、(35.13±4.23)%、(24.5±5.14)%。400倍光鏡下可見假手術(shù)組皮質(zhì)區(qū)僅有少數(shù)或無凋亡細胞，細胞結(jié)構(gòu)完整。缺血模型組可見大量凋亡神經(jīng)細胞，細胞的胞核明顯固縮，胞漿可見濃縮深染，核仁模糊不清，細胞漿及細胞核內(nèi)呈棕褐色，與假手術(shù)組比較凋亡指數(shù)明顯增高(P<0.05)。抑制劑組神經(jīng)細胞凋亡情況最輕，凋亡指數(shù)明顯低于缺血模型組和丹參多酚酸組(P<0.05)，丹參多酚酸組細胞凋亡情況介于抑制劑組和缺血模型組之間，凋亡指數(shù)明顯低于缺血模型組(P<0.05)。見圖3。

a:假手術(shù)組；b:缺血模型組；c:丹參多酚酸組；d:抑制劑組

3 討 論

PIDD即p53誘導(dǎo)的死亡結(jié)構(gòu)域蛋白，DNA損傷后可產(chǎn)生含有富含亮氨酸重復(fù)序列的48 kDa N-末端片段(LRRs，PIDD-N)和含有死亡結(jié)構(gòu)域(DD，PIDD-C)的51kDa C端片段，后者進一步裂解產(chǎn)生37 kDa片段(PIDD-CC)[10]?？煞謩e介導(dǎo)兩種信號傳導(dǎo)途徑，其中一種是觸發(fā)caspase-2活化，可形成稱為PIDDosome的復(fù)合物，從而造成細胞凋亡[11]。

Niizuma等[12]在短暫性全腦缺血(tGCI)模型中利用小干擾RNA(siRNA)處理來測試對PIDD表達的抑制，siRNA的施用對PIDD的抑制作用不僅減少了PIDD-CC的表達，還降低了procaspase-2和Bid的活性，導(dǎo)致tGCI后海馬CA1亞區(qū)的組織學(xué)神經(jīng)元損傷和DNA斷裂減少。研究者提出PIDD是tGCI后神經(jīng)元死亡的假設(shè)分子靶點。研究結(jié)果顯示PIDD在procaspase-2激活和延遲tGCI(短暫性全腦缺血)后CA1神經(jīng)元死亡中起重要作用。Jang等[13]研究中發(fā)現(xiàn)，新型TAT融合肽，RDH3和PDH3，它們對PIDDosome的形成產(chǎn)生強烈的負面影響，并能夠拯救魚藤酮處理的神經(jīng)元細胞死亡，提示PIDDosome是神經(jīng)細胞凋亡過程的重要角色。Wan等[14]研究顯示，PIDD在損傷后的腦組織中表達明顯上升,損傷后3 d左右表達達到頂峰，之后表達下降，在約 14 d左右回到正常水平，并且主要定位于神經(jīng)元之中，推測PIDD可能是決定腦損傷神經(jīng)元命運的重要調(diào)節(jié)因子。

本研究中大鼠腦缺血模型制備成功后，缺血模型組、丹參多酚酸組和抑制劑組1 d、3 d、7 d PIDD mRNA表達高于假手術(shù)組，說明急性腦缺血后可誘導(dǎo)腦組織中PIDD mRNA表達上調(diào)，介導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡過程。丹參多酚酸組1 d、3 d、7 d PIDDmRNA表達明顯低于缺血模型組，但稍高于抑制劑組。抑制劑BubR1，一種有絲分裂監(jiān)視蛋白，是一種直接的PIDDosome抑制劑，可以結(jié)合PIDD DD，與RAIDD募集競爭,在PIDD對接站點上超越了RAIDD,抑制PIDDosome介導(dǎo)的細胞凋亡[15]。本研究實驗結(jié)果顯示丹參多酚酸也能抑制PIDD表達從而發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用，它是否也如BubR1一樣，通過與RAIDD競爭招募來抑制PIDDosome的形成而產(chǎn)生作用有待進一步研究。但仍可說明注射用丹參多酚酸可通過抑制PIDD的表達，從而發(fā)揮改善神經(jīng)功能的作用，雖然未能達到和PIDD的抑制劑BubR1同等水平的作用，但作用效果是一致的。

PIDD誘導(dǎo)細胞凋亡可通過PIDD/caspase-2/t-BID/細胞色素-c/caspase-3信號通路進行[15-17]，caspase-3是凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中關(guān)鍵的蛋白酶，受上游蛋白酶的活化，活化的caspase-3又參與激活下游底物，誘發(fā)細胞凋亡，而細胞色素c(cyt-c)從線粒體釋放到細胞質(zhì)中，可誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡[18]。Ray等[15]在結(jié)直腸癌細胞凋亡機制研究中發(fā)現(xiàn)，PIDD表達激活caspase-2，后者繼而裂解BID以產(chǎn)生活性t-BID，進而引起MTP損失，細胞色素c從線粒體間隙釋放及下游caspase-3的激活。而Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)碘-131通過PIDD/caspase-2/t-BID/細胞色素-c /caspase-3信號通路誘導(dǎo)心肌細胞凋亡。Shi等[17]也發(fā)現(xiàn)PIDD的表達與肝細胞癌細胞增殖和凋亡有關(guān)。

本研究中丹參多酚酸組、缺血模型組、抑制劑組第7天caspase-2、t-BID、細胞色素-c、caspase-3 蛋白表達均明顯高于假手術(shù)組，顯示在腦缺血損傷后凋亡相關(guān)因子caspase-2、t-BID、細胞色素-c、caspase-3蛋白表達顯著升高，而丹參多酚酸組第7天PIDD、caspase-2、t-BID、細胞色素-c、caspase-3蛋白表達明顯低于缺血模型組，提示注射用丹參多酚酸改善大鼠神經(jīng)功能缺損，對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護機制可能與PIDD/caspase-2/t-BID/細胞色素-c/caspase-3信號通路有關(guān)。

綜上所述，本實驗研究結(jié)果表明：注射用丹參多酚酸可能通過介導(dǎo)PIDD/caspase-2/t-BID/細胞色素-c/caspase-3信號通路，下調(diào)PIDD及其下游凋亡相關(guān)因子caspase-2、t-BID、細胞色素-c、caspase-3的表達，發(fā)揮改善神經(jīng)功能缺損的作用。