沉默IL-37 表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制研究

陳海堡 宋毅昌 彭磊 曾統(tǒng) 張迪 靳松

骨肉瘤是世界上最常見的兒童骨惡性腫瘤，也是兒童惡性腫瘤死亡的第八大原因。隨著治療理念及技術(shù)的改進(jìn)，骨肉瘤患者的5 年總體生存率明顯提高，但治愈率未有提高，而且出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)患者的預(yù)后較差。分子靶向治療是骨肉瘤的治療新策略，識別新的靶點(diǎn)和驅(qū)動骨肉瘤發(fā)病的潛在分子機(jī)制至關(guān)重要。IL-37 是近年被發(fā)現(xiàn)的IL-1 家族成員，具有天然的炎癥和免疫抑制作用，與調(diào)控腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)。然而IL-37 在骨肉瘤中的生物學(xué)功能尚未被闡明。B 淋巴細(xì)胞瘤（BCL）家族蛋白是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控因子，其通過調(diào)節(jié)線粒體通透性來調(diào)節(jié)凋亡激活物如細(xì)胞色素C 的釋放來影響細(xì)胞的狀態(tài)，BCL-2 家族包括促凋亡蛋白BCL 關(guān)聯(lián)X 蛋白（BAX）和抗凋亡蛋白BCL-2。Wnt/β-catenin 通路是骨肉瘤中常見的信號通路，在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用。在正常的體細(xì)胞中，β-catenin僅作為一種細(xì)胞骨架蛋白在胞膜處與鈣黏蛋白形成復(fù)合體,在維持同型細(xì)胞的黏附、防止細(xì)胞的移動中發(fā)揮作用。當(dāng)細(xì)胞外Wnt 信號分子與細(xì)胞膜上特異性受體Frizzled 蛋白結(jié)合后，激活胞內(nèi)蛋白Dvl。Dvl 通過抑制糖原合成酶激酶3β（GSK3β）等蛋白形成的β-catenin 降解復(fù)合物的降解活性，穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)中游離狀態(tài)的β-catenin 蛋白。胞漿中穩(wěn)定積累的β-catenin 進(jìn)入細(xì)胞核后結(jié)合淋巴增強(qiáng)因子/ T 細(xì)胞因子（LEF/TCF）轉(zhuǎn)錄因子家族，啟動下游靶基因如轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子1（TEF1）、c-Myc、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）和基質(zhì)金屬蛋白酶-7（MMP-7）等的轉(zhuǎn)錄。為此，本研究中通過定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-qPCR）檢測IL-37 在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)，并且進(jìn)一步探討IL-37 對骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及與Wnt/β-catenin 信號通路關(guān)系，為骨肉瘤的靶向治療提供新的證據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

一、主要材料

本實(shí)驗(yàn)所用的人類正常成骨細(xì)胞系（hFOB1.19）和骨肉瘤細(xì)胞系（U2OS、MG63、Saos-2）均購于中國科學(xué)院；10%胎牛血清（FBS）購自美國HyClone 公司；高糖型DMEM 培養(yǎng)基、谷氨酰胺購自美國Gibco 公司；胰酶、0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）、青霉素-鏈霉素混合液（雙抗）、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑盒（CCK-8 法）購自美國Sigma 公司；逆轉(zhuǎn)錄（RT）試劑盒及qPCR 試劑盒、TRIzol RNA 抽提試劑、Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國Invitrogen 公司；Transwell 孔板購自美國Corning 公司；IL-37（ab93959，兔抗人）購自美國Abcam 公司；β-actin 抗 體（AA128，鼠 抗 人）、BAX 抗 體﹑BCL-2 抗體﹑TEF1 抗體﹑c-Myc 抗體、Cyclin D1抗體﹑MMP-7 抗體購自美國CST 公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Matrigel 基質(zhì)膠購自美國BD 公司。

二、方 法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)與小干擾RNA（siRNA）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

hFOB1.19 細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基，骨肉瘤細(xì)胞系（U2OS、MG63和Saos-2）使用含有10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO、95%濕度下培養(yǎng)，24 h 后更換新鮮的培養(yǎng)基，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的密度分布及其生長狀態(tài)，以后每3 d 換液1 次。將生長狀態(tài)良好的骨肉瘤細(xì)胞按照上述步驟消化后接種在需要進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)孔板上，待細(xì)胞生長匯合度為80%，棄除培養(yǎng)基加入適量的無血清培養(yǎng)基。干擾序列siIL-37（5′-ACAAAACUCCCCUUUAGAG AC-3′）及轉(zhuǎn)染無意義的陰性對照序列（5′-CUCUAA AGGGGAGUUUUGUCU-3′）由上海吉瑪基因股份有限公司設(shè)計(jì)合成。嚴(yán)格按照LipofectamineRNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書制備轉(zhuǎn)染混合物。將上述的siRNA 轉(zhuǎn)染混合物加入相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)板孔，置于37 ℃、5% CO、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，用RT-qPCR 檢測轉(zhuǎn)染效率并進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。其中轉(zhuǎn)染干擾序列siIL-37 沉默IL-37 表達(dá)的細(xì)胞作為siIL-37 組，轉(zhuǎn)染陰性對照序列作為陰性對照組（siNC 組）。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2. RT-qPCR

根據(jù)TRIzol 試劑盒使用說明書提取細(xì)胞中的總RNA。取100 ng 的總RNA 為模板，通過RT 試劑盒合成模板DNA（cDNA），取cDNA 和引物，嚴(yán)格按照TaKaRa 公司SYBRPremix Ex TaqⅡ試劑盒說明書配制PCR反應(yīng)液。RT-qPCR反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，PCR 擴(kuò)增儀自動分析并得出Ct 值，采用2法計(jì)算IL-37 mRNA 相對表達(dá)量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成，具體序列見表1。

表1 引物序列

3. CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖

選擇生長狀態(tài)良好的hFOB1.19 細(xì)胞常規(guī)消化后按1000 個(gè)/孔的密度接種于96 孔板，均勻鋪板置于37 ℃、5% CO、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。按上述的步驟轉(zhuǎn)染siRNA 干擾序列，沉默IL-37 的表達(dá)，設(shè)置陰性對照的siNC 組。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)72 h 后棄除培養(yǎng)基，加入含有10 μL CCK-8 試劑的完全培養(yǎng)基110 μL，置于37 ℃、5%CO、95%濕度的培養(yǎng)箱中孵育2 h。在全自動酶標(biāo)儀上測定每孔在450 nm 處的吸光度（A）值并分析結(jié)果。細(xì)胞 增 殖 比 例=（A-A） /（ A-A），其 中A為 實(shí) 驗(yàn)孔A 值（含培養(yǎng)基、CCK-8 溶液、分別予siIL-37或siNC 轉(zhuǎn)染細(xì)胞），A為對照孔A 值（含培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，未使用siRNA 處理的細(xì)胞），A為空白孔A 值（含培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，不含細(xì)胞）。

4. 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

按照Transwell 染色試劑盒說明書用無血清培養(yǎng)基將其稀釋至250 μg/mL 的工作濃度，取100 μL稀釋的基質(zhì)膠加入Transwell 上層小室，置于37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育4 h。選擇瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h 后的骨肉瘤細(xì)胞，常規(guī)消化后用含1% FBS 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至約1.25×10/mL。24 孔板中每孔加入含20% FBS 培養(yǎng)基作為下層小室，取200 μL 細(xì)胞懸液加入Transwell 遷移和侵襲上層小室，小心地將上層小室置入24 孔板中，置于37 ℃、5% CO、95%濕度的培養(yǎng)箱中孵育24 h。取出遷移及侵襲小室，用4%多聚甲醛穿過小室的細(xì)胞固定30 min，再用結(jié)晶紫將其染色15 min。然后用棉簽輕柔拭去小室里面未遷移穿膜的細(xì)胞。靜置干燥后在顯微鏡下通過計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞的數(shù)量反映細(xì)胞侵襲能力，用Image J 計(jì)數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

5. 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染48 h 后的骨肉瘤細(xì)胞用不含EDTA 的胰酶消化，上清培養(yǎng)液終止消化，1000 轉(zhuǎn)/分離心5 min，收集細(xì)胞，使用500 μL 連接緩沖液重懸細(xì)胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 染液，避光，室溫孵育15 min。孵育染色后，然后往每管加入400 μL 連接緩沖液混勻，1 h 內(nèi)上機(jī)檢測。所得數(shù)據(jù)用相關(guān)配套軟件分析并繪制散點(diǎn)圖。

6. 蛋白免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

采用蛋白免疫印跡法檢測siIL-37 組和siNC 組細(xì)胞中的BAX、BCL-2 以及Wnt/β-catenin 信號通路相關(guān)蛋白β-catenin、c-Myc、Cyclin D1、MMP-7 TEF1 的表達(dá)，檢測步驟參照前期研究。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、正常成骨細(xì)胞系和骨肉瘤細(xì)胞系細(xì)胞中IL-37 mRNA 的表達(dá)情況比較

RT-qPCR 結(jié)果顯示，IL-37 mRNA 在3 種骨肉瘤細(xì)胞系（U2OS、MG63、Saos-2 細(xì)胞）中的相對表達(dá)量均高于其在正常成骨細(xì)胞系hFOB1.19 細(xì)胞中的相對表達(dá)量（F = 13.332，P ＜ 0.01；Dunnett-t檢驗(yàn)P 均＜ 0.05），見圖1。

圖1 正常成骨細(xì)胞系和骨肉瘤細(xì)胞系中IL-37 mRNA 的表達(dá)情況比較

二、沉默siIL-37 表達(dá)對3 種骨肉瘤細(xì)胞中IL-37 mRNA 表達(dá)的影響

3 種骨肉瘤細(xì)胞在siIL-37 組中的IL-37 mRNA相對表達(dá)量均低于其在siNC 組中的相對表達(dá)量（P 均＜ 0.05）， 其 中IL-37 mRNA 在U2OS（t =138.276，P ＜ 0.01） 和MG63（t = 151.863，P ＜0.001）細(xì)胞中的表達(dá)抑制率均＞ 80%，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇這2 種細(xì)胞作進(jìn)一步的研究分析，見圖2。

圖2 沉默siIL-37 表達(dá)對3 種骨肉瘤細(xì)胞中IL-37 mRNA表達(dá)的影響

三、沉默IL-37 表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響

CCK-8 法結(jié)果顯示，U2OS 細(xì)胞和MG63 細(xì)胞中siIL-37 組的細(xì)胞增殖比例均低于siNC 組（t 分別為78.521 和68.672，P 均＜ 0.001），見圖3。

四、沉默IL-37 表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，U2OS 細(xì)胞和MG63 細(xì)胞中siIL-37 組的細(xì)胞凋亡率均高于siNC 組（t 分別為4.257 和22.532，P 均＜ 0.05），見圖4。

圖4 沉默IL-37 表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響

五、沉默IL-37 表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲

注，與siNC 組比較，***P ＜ 0.001；每組n = 3。

的影響

Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，無論是在U2OS 細(xì)胞中還是在MG63 細(xì)胞中siIL-37 組的遷移細(xì)胞數(shù)量（t 分別為33.213 和24.427，P 均＜ 0.001）和侵襲細(xì)胞數(shù)量（t 分別為15.856 和45.123，P 均＜ 0.01）均多于siNC 組，見圖5。

圖5 沉默IL-37 表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響（結(jié)晶紫染色，×100）

六、沉默IL-37 表達(dá)對凋亡和Wnt/β-catenin信號通路各蛋白表達(dá)的影響

蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，與siNC 組比較，無論是在U2OS 細(xì)胞中還是在MG63 細(xì)胞中siIL-37組BAX 蛋白表達(dá)均上調(diào)（t 分別為6.371 和4.968，P 均＜ 0.05），而BCL-2 蛋白表達(dá)均下調(diào)（t 分別為14.576 和8.946，P 均＜ 0.01）， 且TEF1（t 分別為9.758 和7.968，P 均＜ 0.01）、c-Myc（t 分別為14.652 和10.572，P 均＜ 0.01）、Cyclin D1（t 分別為19.629 和17.384，P 均＜ 0.001）和MMP-7（t分別為21.728 和16.368，P 均＜ 0.001）蛋白表達(dá)均下調(diào)。進(jìn)一步檢測β-catenin 蛋白顯示，siIL-37組U2OS 和MG63 細(xì)胞中的β-catenin 蛋白相對表達(dá)量均低于siNC 組（t 分別為6.873 和8.173，P均＜ 0.01），見圖6。

圖6 沉默IL-37 表達(dá)對凋亡和Wnt/β-catenin 信號通路各蛋白表達(dá)的影響

討 論

骨肉瘤具有病死率高、治愈率低的特點(diǎn)?，F(xiàn)階段，新輔助化學(xué)治療、切除腫瘤和保肢重建手術(shù)是治療骨肉瘤的主要策略。經(jīng)過有效治療，高級別骨肉瘤患者的5 年生存率可達(dá)60%～70%，因此有必要尋找更精確的診斷生物標(biāo)志物及闡明骨肉瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為骨肉瘤的治療提供潛在治療靶點(diǎn)。本研究驗(yàn)證了IL-37 在人骨肉瘤細(xì)胞系有高表達(dá)。沉默IL-37 表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖并同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，證實(shí)IL-37 與骨肉瘤的發(fā)生有關(guān)。本研究還顯示，沉默IL-37 表達(dá)可抑制骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲，這也表明IL-37 可能與骨肉瘤的侵襲性生物行為有關(guān)。骨肉瘤的惡性生物學(xué)行為涉及復(fù)雜的分子機(jī)制和不同信號通路的激活。BCL-2 家族蛋白是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控因子，包括促凋亡蛋白BAX 和抗凋亡蛋白BCL-2。本研究蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，沉默IL-37 表達(dá)上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中BAX 表達(dá)，而下調(diào)BCL-2 的表達(dá)，研究結(jié)果表明IL-37 可能通過BAX/BCL-2 調(diào)控骨肉瘤增殖凋亡的惡性生物學(xué)行為。前期研究表明，Wnt/β-catenin 信號通路在人類骨肉瘤的發(fā)病和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，該途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞中β-catenin 表達(dá)水平，促進(jìn)腫瘤血管生成和逃避免疫監(jiān)測，對骨肉瘤侵襲性進(jìn)展起關(guān)鍵作用。Wnt/β-catenin通路中的下游靶標(biāo)TEF1、c-Myc、Cyclin D1 和MMP-7 在調(diào)控腫瘤增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。本研究中，沉默IL-37 表達(dá)后Wnt/β-catenin 通路的關(guān)鍵蛋白β-catenin 及其下游靶標(biāo)（TEF1、c-Myc、Cyclin D1 和MMP-7）均相應(yīng)下調(diào)。c-Myc 是人類常見的活化原癌基因之一，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。作為轉(zhuǎn)錄因子，早期研究發(fā)現(xiàn)c-Myc轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)參與了許多生物過程，如代謝、細(xì)胞生長、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡。Cyclin D1 充當(dāng)細(xì)胞周期進(jìn)程的中央調(diào)節(jié)器，該蛋白的異常表達(dá)促使細(xì)胞的周期發(fā)生改變是腫瘤發(fā)生的重要因素。MMP 家族組成一系列轉(zhuǎn)錄因子，它們能夠調(diào)節(jié)腫瘤的微環(huán)境，主要是通過細(xì)胞外基質(zhì)的降解來實(shí)現(xiàn)的，外基質(zhì)的降解為細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件。MMP-7 的表達(dá)和激活在幾乎所有類型的惡性腫瘤中都存在，尤其與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。研究結(jié)果表明，IL-37 可能通過BAX/BCL-2 和Wnt/β-catenin 信號通路調(diào)控骨肉瘤發(fā)生發(fā)展，因此有望成為骨肉瘤臨床早期診療的腫瘤標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。

綜上所述，IL-37 在骨肉瘤細(xì)胞中上調(diào)，沉默IL-37 可以抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制可能與BAX/BCL-2 表達(dá)和調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。研究結(jié)果為骨肉瘤發(fā)生機(jī)制的深入研究奠定了基礎(chǔ)，對骨肉瘤的預(yù)防及治療具有一定意義，但本研究僅在體外評估了IL-37 的生物學(xué)功能，下一步將用動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證。