茶樹(shù)種子貯藏及提高活力方法研究

林瑾 鄭鵬 陳玉春 劉少群 孫彬妹

摘要：茶樹(shù)種子播種對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有重大意義，而茶樹(shù)種子保存對(duì)播種具有重要作用。茶樹(shù)種子在通過(guò)品質(zhì)檢驗(yàn)、活性檢測(cè)后，結(jié)合合理的貯藏方法可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期保存且仍具有較高的活力遺傳性和發(fā)芽率。文章總結(jié)了有關(guān)茶樹(shù)種子活力鑒定、貯藏特性、發(fā)芽率及其影響因素等方面的問(wèn)題，探討茶樹(shù)種子品質(zhì)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)、貯藏條件和貯藏方法，以期為今后茶樹(shù)種子保存、繁育等有關(guān)研究工作提供理論參考。

關(guān)鍵詞：茶樹(shù);種子;保存;活力;成活率

Study on Methods of Storage and Vigor

Enhancement of Tea Seeds

LIN Jin1， ZHENG Peng1， CHEN Yuchun2， LIU Shaoqun1， SUN Binmei1*

1. South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China;

2. Chaozhou Tianxia Tea Industry Co.， Ltd.， Chaozhou 521000， China

Abstract： Tea seed sowing is of great significance to agricultural production， while tea seed preservation plays an important role in sowing. After passing the quality test and activity detection， tea seeds combined with reasonable storage method can achieve long-term preservation and still have high vitality heritability and germination rate. This paper included the vitality identification， storage characteristics， germination rate and influencing factors of tea seeds， and discussed the quality inspection standards， storage conditions and storage methods of tea seeds， in order to provide a theoretical reference for the related research work of tea seed preservation and breeding in the future.

Keywords： tea plant， seed， storage， vigor， survival percent

茶樹(shù)種子對(duì)干燥脫水極為敏感，屬于典型的頑拗型種子[1]。茶樹(shù)種子含水率高達(dá)20%～60%，成熟茶樹(shù)種子長(zhǎng)時(shí)間干燥脫水時(shí)，其生命活力會(huì)迅速下降。目前，對(duì)茶樹(shù)種子脫水方面的研究主要集中在生理生化和細(xì)胞學(xué)等領(lǐng)域[2]。Chen等[3]研究表明，對(duì)茶樹(shù)種子進(jìn)行材料的脫水處理，增強(qiáng)低溫耐性后，仍能在接近0 ℃的低溫下保存數(shù)月，也能在液氮中保存下來(lái)。但是茶樹(shù)種子不耐脫水且易受低溫影響，一般在未達(dá)到低溫保存的理想狀態(tài)時(shí)就因?qū)Φ蜏氐拿舾行远Щ?。因此，降低茶?shù)種子對(duì)低溫的敏感性是當(dāng)前研究長(zhǎng)期保存茶樹(shù)種子的重要工作之一。在超低溫下，細(xì)胞物質(zhì)代謝和生命活動(dòng)幾乎停止，在這個(gè)機(jī)制中，Normah等[4]曾采用液氮方法保存頑拗型種子，郭長(zhǎng)根等[5]也在液氮中保存頑拗型茶樹(shù)種子獲得成功。這些試驗(yàn)證明液氮保存技術(shù)具有“無(wú)限期”保存頑拗型種子的可能，初步實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)期保存茶樹(shù)種子的預(yù)想。試驗(yàn)證明，在不同成熟階段中，成熟中期的茶樹(shù)種子最耐脫水，更易保存[6]。因此，在貯藏種子前，應(yīng)選成熟中期的茶樹(shù)種子，并進(jìn)行品質(zhì)檢驗(yàn)。在貯藏茶樹(shù)種子期間，應(yīng)適時(shí)檢測(cè)其活力以獲取保存過(guò)程種子活力變化趨勢(shì)。

1 ?茶樹(shù)種子品質(zhì)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)

茶樹(shù)種子采收后，應(yīng)先根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行品質(zhì)檢驗(yàn)，挑選優(yōu)質(zhì)種子進(jìn)行保存，亦可節(jié)省貯藏空間。茶樹(shù)種子的品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)為：夾雜物不超過(guò)2%、直徑不小于12 mm、千粒質(zhì)量不低于1 000 g、含水率在22%～38%之間、發(fā)芽率不低于75%[7]。

2 ?茶樹(shù)種子活力檢測(cè)方法

在貯藏之前，可采用茚三酮溶液顯色法或TTc定量法（表1）測(cè)定茶樹(shù)種子活力，通過(guò)檢測(cè)活力來(lái)及時(shí)反映茶樹(shù)種子在長(zhǎng)期保存下遇到的問(wèn)題，并做出合理改進(jìn)。

茚三酮溶液顯色法可定量檢測(cè)種子浸提液的氨基酸含量[8]，徐祥美[9]通過(guò)測(cè)定氨基酸茚三酮溶液的吸收峰以及測(cè)試氨基酸與茚三酮形成的藍(lán)紫色復(fù)合物的穩(wěn)定性，來(lái)說(shuō)明種子的氨基酸外滲量可反映出種子的品質(zhì)及衰老程度。沈永等[10]也設(shè)計(jì)出價(jià)廉、快速、重現(xiàn)性好的茚三酮試紙法，該方法能夠反映種子播種價(jià)值，并半定量檢測(cè)種子活力。TTc定量法是測(cè)定種子脫氫酶活性快速而簡(jiǎn)便的方法，脫氫酶活性與種子活力密切相關(guān)，脫氫酶活性高則種子活力高[8]。胡晉[11]通過(guò)改進(jìn)TTc定量法省去了研磨、定容、離心等過(guò)程，大大簡(jiǎn)化了操作步驟，并減少了三苯基甲臜（TTcH）的損失和氧化，提高了種子活力檢測(cè)的精確度。

3 ?茶樹(shù)種子貯藏特性

3.1 ?易受干燥損傷，對(duì)低溫敏感、易發(fā)生冷害

干燥脫水會(huì)降低茶樹(shù)種子細(xì)胞中水介質(zhì)的流動(dòng)性，產(chǎn)生代謝脅迫，細(xì)胞失去膨脹甚至發(fā)生萎縮，引起機(jī)械應(yīng)力，阻礙細(xì)胞膜相對(duì)流動(dòng)，進(jìn)而降低脂肪酸的不飽和度。當(dāng)茶樹(shù)種子在-25 ℃及以下的環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間保存，極易造成細(xì)胞因產(chǎn)生冰晶而對(duì)其結(jié)構(gòu)造成破壞性損害[6]。40337452-CF39-4E08-A258-AE78B6224B83

3.2 ?微生物生長(zhǎng)旺盛，呼吸作用強(qiáng)

頑拗型種子的臨界水分大多在30%以上，為微生物的生長(zhǎng)提供了充足的水分。當(dāng)種子含水率增加、貯藏溫度升高時(shí)，其代謝能力增強(qiáng)，呼吸作用也進(jìn)而加強(qiáng)。

3.3 ?貯藏期間易發(fā)芽

在貯藏期間，種子在水分充足的情況下，易發(fā)芽。

4 ?茶樹(shù)種子發(fā)芽率及其影響因素

4.1 ?茶樹(shù)種子發(fā)芽率

種子在無(wú)任何貯藏措施的情況下，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，半年后發(fā)芽率會(huì)迅速下降到20%左右[12]。郭長(zhǎng)根等[5]采用鋁箔-薄膜復(fù)合袋密封包裝，將含水率為13.8%的種子直接投入液氮中貯藏，經(jīng)118 d貯存后發(fā)芽率仍高達(dá)93.3%[13]，證明在適宜的貯藏條件下，種子長(zhǎng)時(shí)間貯藏仍有較高發(fā)芽率。

茶樹(shù)種子發(fā)芽率可使用溫砂法測(cè)定，任取茶樹(shù)種子100粒，溫水浸泡3～4 h后，放入鋪有細(xì)沙的發(fā)芽盤(pán)中，上覆1層細(xì)沙，加少量水將沙濕潤(rùn)，在25～30 ℃溫度下處理1～7 d，觀察發(fā)芽茶樹(shù)種子數(shù)量，計(jì)算發(fā)芽率。

4.2 ?形成茶樹(shù)種子活力的內(nèi)因

夏春華等[14]對(duì)茶樹(shù)種子活力的研究結(jié)果表明，新鮮收獲的茶樹(shù)種子含有大量水分（約40%），茶樹(shù)種子的貯藏物質(zhì)主要有脂肪、蛋白質(zhì)和淀粉（脂肪和淀粉為種子生命活動(dòng)提供能量，而蛋白質(zhì)決定新陳代謝類(lèi)型和個(gè)體發(fā)育方向）。這些貯藏材料是保持種子活力的必要條件，也是保持種子活力的基礎(chǔ)。種子活力是由多個(gè)基因控制的數(shù)量性狀，近年來(lái)，種子活力相關(guān)基因的QTL定位及其遺傳機(jī)制方面的研究取得較大進(jìn)展，如已實(shí)現(xiàn)相關(guān)基因的克隆，馬娟等[15]研究表明種子活力具有高遺傳性等。在貯藏過(guò)程中，隨著呼吸作用的加強(qiáng)，茶樹(shù)種子貯藏物質(zhì)逐漸消耗，造成種子活力降低，因此貯藏的前提便是抑制呼吸作用，保持種子的高活力。

4.3 ?茶樹(shù)種子發(fā)芽條件

茶樹(shù)種子發(fā)芽條件包括適宜的溫度、充足的水分和氧氣等。種子中有機(jī)和無(wú)機(jī)物質(zhì)的分解需要酶的催化，酶需要在一定溫度下進(jìn)行催化;當(dāng)種子的水分充足，種皮會(huì)軟化和膨脹，進(jìn)而氧氣進(jìn)入并加強(qiáng)呼吸;氧氣充足時(shí)細(xì)胞的呼吸才會(huì)加強(qiáng)，酶的活動(dòng)才會(huì)旺盛。

5 ?茶樹(shù)種子貯藏條件

5.1 ?控制水分

控制水分有兩種方式，一是使種子的含水率高于致死臨界含水率，如短期貯藏方法——將去果皮的茶樹(shù)種子用濕沙法貯藏2個(gè)多月[16]、吸脹貯藏、水浸貯藏;二是降低種子臨界含水率，如超低溫保存中快速脫水法——使茶樹(shù)種子短時(shí)間內(nèi)降低含水率，減少因水分脅迫造成的細(xì)胞損害。

5.2 ?適宜低溫

短期貯藏：在-196 ℃液氮中保存。

一般貯藏溫度：對(duì)種子進(jìn)行材料處理后（干燥至水分含量10%以下）可在0～5 ℃條件下密封貯藏。

6 ?茶樹(shù)種子貯藏方法

在短時(shí)間內(nèi)播種或運(yùn)輸?shù)牟铇?shù)種子，可將其放置于陰涼干燥的室內(nèi)，厚度不應(yīng)超過(guò)15 cm，上方覆蓋少許草料，每7～8 d翻動(dòng)1次，使種子失水均勻。如需次年春季種植，應(yīng)合理貯藏，以免影響發(fā)芽率[17]。有以下4種簡(jiǎn)單實(shí)用的茶樹(shù)種子貯藏方法。

6.1 ?沙藏法

沙藏法適合小規(guī)模貯藏，屬室內(nèi)貯藏法。低溫（5～7 ℃）沙藏，一定的含水率和含氧量維持正常生命活動(dòng)的條件下，種子進(jìn)入被迫休眠狀態(tài)，但種皮的通透性增加，可提高種子的發(fā)芽率。

選通風(fēng)干燥的室內(nèi)，在地面鋪1層5～10 cm厚含水率50%的細(xì)沙，上面鋪10 cm厚的茶樹(shù)種子，再鋪5～10 cm厚含水率為50%的細(xì)沙，以此類(lèi)推，堆高至30 cm即可。貯藏期間及時(shí)抽檢與適量灑水，若茶樹(shù)種子發(fā)生霉變應(yīng)及時(shí)攤晾干燥。

6.2 ?溝藏法

溝藏法適合大規(guī)模茶樹(shù)種子的貯藏，工程量大，屬室外貯藏法。溝藏法在維持茶樹(shù)種子所需的貯藏溫度下，保證一定的濕度和二氧化碳濃度，以此減少自然損耗、抑制呼吸代謝、延長(zhǎng)種子貯藏壽命。

在室外緩坡地，挖寬1 m、深30 cm的儲(chǔ)藏溝，先在底部鋪5～10 cm厚的蒲草或者細(xì)沙，倒入茶樹(shù)種子，上面蓋1層5～10 cm厚的蒲草，最后用泥土制作70 cm高屋脊形，間隔插入通氣竹筒。其間需要及時(shí)檢查種子是否發(fā)生霉變。

6.3 ?畦藏法

畦藏法適合大規(guī)模茶樹(shù)種子的貯藏。

選擇地勢(shì)平坦、土壤干燥且排水條件好的地塊做高畦，寬2 m、高18 cm，長(zhǎng)度根據(jù)茶樹(shù)種子的多少和地形的長(zhǎng)短來(lái)確定。畦面做好后，鋪1層2～3 cm厚的細(xì)沙，細(xì)沙上鋪1層6～7 cm厚的茶樹(shù)種子，茶樹(shù)種子上再鋪1薄層細(xì)沙，以茶樹(shù)種子不露出沙面為度，如此相間重復(fù)鋪完2～3層茶樹(shù)種子后，再鋪1層細(xì)沙，最后覆蓋干土密封成龜背形[18]。

6.4 ?超低溫保存

超低溫-196 ℃液氮保存是將茶樹(shù)種子自然干燥至含水率8%～10%，再以低溫使其代謝降低，細(xì)胞、組織和器官在低溫保存過(guò)程中不會(huì)發(fā)生遺傳變異和性狀變化。

每處理20粒種子后，用鋁箔復(fù)合袋密封，直接放入液氮罐冷藏。2個(gè)月后取出，在38～40 ℃溫水中迅速解凍恢復(fù)，然后用溫沙法測(cè)定發(fā)芽率。

但是，如果生物體細(xì)胞內(nèi)的水分在冷卻過(guò)程中結(jié)冰，就會(huì)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成損傷和破壞，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，在液氮中保存（-196 ℃）以快凍快解的方法可以基本阻止水在頑拗型種子細(xì)胞內(nèi)凍結(jié)，避免致命的冰凍傷害[19]，Song等[20]報(bào)道，快速降溫至-30～-15 ℃短時(shí)間內(nèi)保存可避免茶樹(shù)種子內(nèi)部細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到損壞，因此，超低溫保存中降溫的速度是保持茶樹(shù)種子活力的關(guān)鍵因素之一。

談及低溫冷凍保存，一般認(rèn)為胚是最好的冷凍保存材料，因?yàn)榕呤侵参锏碾r形，包含了大部分的遺傳信息。因此，大多數(shù)頑拗型種子都是在胚（或下胚軸）的成熟期時(shí)在超低溫下貯藏，而且材料越新鮮，效果越好。郭長(zhǎng)根等[5]用液氮保存茶樹(shù)種子，并獲得顯著的效果。此外，添加冷凍保護(hù)劑可防止冷凍和脫水過(guò)程中種子細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，減少脅迫相關(guān)的自由基調(diào)節(jié)的損害[21]。40337452-CF39-4E08-A258-AE78B6224B83

茶樹(shù)種子的超低溫長(zhǎng)期保存，材料的處理和選擇都至關(guān)重要，比如以降低冰晶損傷的玻璃化法，卻因茶樹(shù)種子個(gè)頭大，不利于玻璃化所需的脫水速率，所以不適用于茶樹(shù)種子保存。因此，在今后的科研工作中，應(yīng)對(duì)茶樹(shù)種子的最佳保存部位和保存方式進(jìn)行探索分析。

7 ?結(jié)論與展望

我國(guó)茶樹(shù)育種研究的重要內(nèi)容之一是利用優(yōu)異種質(zhì)資源培育新品種[22]，其中最經(jīng)濟(jì)、安全和高效的種質(zhì)資源保存方式是種子保存。種子的含水率和貯藏溫度對(duì)種質(zhì)資源保存的影響格外重要。目前生產(chǎn)上所采用的各種貯藏方式，還不是十分理想，未能達(dá)到最大限度保持種子生活力的目的，有不少茶樹(shù)種子都在貯藏中失去活力，從而造成損失[23]。

因此，即使不少研究表明超低溫貯藏即液氮貯藏法是有望長(zhǎng)期保存茶樹(shù)種子的方法，但也還需深度研究其他貯藏方法，比如氣調(diào)法、隔水浸泡法等，開(kāi)拓更多種子保存方法的研究，改善貯藏種子的條件，加強(qiáng)對(duì)保存種子的管理。

水分是種子萌發(fā)的關(guān)鍵觸發(fā)因素，但種子感知水分的機(jī)制仍未解決。Dorone等[24]發(fā)現(xiàn)了一個(gè)未鑒定的擬南芥朊蛋白，命名為FLOE1，該蛋白在水合過(guò)程中發(fā)生相分離，使胚能夠感知水分脅迫，可證明FLOE1縮合物的生物物理狀態(tài)調(diào)節(jié)了其在體內(nèi)抑制不利環(huán)境下種子萌發(fā)的生物學(xué)功能。因此，可以設(shè)想通過(guò)種子萌發(fā)試驗(yàn)，證明FLOE1在水分脅迫條件下可降低種子的萌發(fā)以長(zhǎng)期保存種子。

我國(guó)很早就開(kāi)始進(jìn)行了茶樹(shù)種質(zhì)的組織培養(yǎng)，上個(gè)世紀(jì)已成功應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)和醫(yī)學(xué)類(lèi)等相關(guān)領(lǐng)域，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。將不同的品種進(jìn)行誘導(dǎo)植株，不斷地培養(yǎng)，從而形成科學(xué)穩(wěn)定的系統(tǒng)，并能夠在一般環(huán)境下很好地遺傳，將這種方法應(yīng)用于茶樹(shù)種子的保護(hù)和儲(chǔ)存，是目前發(fā)展的趨勢(shì)[25]，該技術(shù)也在不斷地創(chuàng)新優(yōu)化中變得更加成熟。

茶樹(shù)種子的貯藏包裝方式方法，也是現(xiàn)如今應(yīng)積極研究解決的問(wèn)題。世界主要產(chǎn)茶國(guó)在茶樹(shù)種子方面做了大量工作，并取得了一些成果，科研工作者更應(yīng)汲取經(jīng)驗(yàn)，研究開(kāi)發(fā)茶樹(shù)種子長(zhǎng)期保存更有效的方法，提高我國(guó)農(nóng)業(yè)科技進(jìn)步水平。

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