互花米草入侵對鹽城濱海濕地nirS型反硝化細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)的影響

劉志君 ，崔麗娟 *，李偉 ，李晶 ，雷茵茹 ，朱怡諾 ，王汝苗 ，竇志國

1.中國林業(yè)科學(xué)研究院濕地研究所，北京 100091；2.濕地生態(tài)功能與恢復(fù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 ?100091

濱海灘涂濕地位于海陸交錯地帶，受海陸環(huán)境雙重影響和制約，是最為脆弱的濕地生態(tài)系統(tǒng)類型之一（崔麗娟等，2006；李晶等，2018）。氮是生態(tài)系統(tǒng)植物生長重要的限制性資源，對維持生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要意義（Dai et al.，2021）。濱海濕地中的氮素去除主要有微生物脫氮、植物吸收和沉積物儲存3種主要途徑（Deegan et al.，2012；Ledford et al.，2021）。除微生物脫氮外，其他脫氮過程都只是對氮素的短暫截留，吸收的氮素可以很快再次進(jìn)入濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)中（Hes et al.，2014）。微生物脫氮主要通過反硝化和厭氧氨氧化兩個(gè)過程將活性氮轉(zhuǎn)化為氮?dú)饣蜓趸瘉喌?，進(jìn)而把氮從生態(tài)系統(tǒng)中永久性的去除（Eriksson et al.，2015）。土壤微生物主導(dǎo)的反硝化作用是 N2O排放的主要來源之一（Jia et al.，2020），也是從濕地生態(tài)系統(tǒng)中永久去除氮的主要途徑，約有90%以上的微生物脫氮是由反硝化過程完成的（Li et al.，2020）。反硝化過程需要多種酶的參與，其中包括硝酸鹽還原酶（Nar）、亞硝酸鹽還原酶（Nir）、一氧化氮還原酶（Nor）、一氧化二氮還原酶（Nos）等（Zumft，1997）。其中Nir催化的亞硝酸鹽還原過程是反硝化過程的關(guān)鍵限速步驟，該酶是由nirS或nirK基因編碼（Braker et al.，2001）。但有研究指出，nirS型反硝化細(xì)菌比nirK型在自然環(huán)境中的分布更為普遍，其豐富度、微生物活性及多樣性也更高（Mosier et al.，2010；Zhao et al.，2020），而且nirK基因在硝化作用相關(guān)功能微生物中也存在，因此目前研究主要以nirS基因作為研究環(huán)境中反硝化過程的分子標(biāo)記。

濱海濕地植被可以通過改變土壤理化性質(zhì)從而影響反硝化過程速率，進(jìn)而影響濱海濕地脫氮過程（Zhang et al.，2016）。不同植物的功能性狀不同，對反硝化過程的影響也是不同的。外來入侵植物具有更高的初級生產(chǎn)力，發(fā)達(dá)的根系可以向根際輸送更多的氧氣等等這些方面使環(huán)境因子發(fā)生變化，進(jìn)一步影響反硝化的反應(yīng)速率?；セ撞荩⊿partina alterniflora）1979年被引入我國濱海濕地，目前已經(jīng)成為最有我國沿海主要入侵物種之一（Li et al.，2009），互花米草的入侵成功的關(guān)鍵是該物種對環(huán)境的適應(yīng)能力（左雪燕等，2021），其入侵后改變原生生態(tài)系統(tǒng)的養(yǎng)分循環(huán)從而對原生生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響（Cui et al.，2019）。先前研究表明，互花米草群落和本地物種群落相比，表層和深層土壤的理化性質(zhì)存在一定差異，例如有研究表明在0—100 cm的土壤剖面中，互花米草的根系生物量高于本地物種（Liao et al.，2007），這不僅會導(dǎo)致表層和深層土壤中的碳含量增加，還會導(dǎo)致土壤中氧的輸送量增加；外來入侵植物會通過植物根系分泌物、脫落物等釋放化感物質(zhì)（Gao et al.，2019）。以上都會改變原生環(huán)境中土壤的理化性質(zhì)，使土壤中反硝化微生物的活性發(fā)生變化，從而影響到土壤反硝化過程。而當(dāng)前有關(guān)濱海濕地土壤nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的研究多集中于表層土壤，且在入侵植物時(shí)間序列上的變化尚不清楚。因此，探究濱海濕地互花米草入侵時(shí)間序列上nirS型反硝化細(xì)菌群落多樣性具有非常重要的科學(xué)意義。本研究選擇江蘇鹽城濕地珍禽國家級自然保護(hù)區(qū)為研究地，采用空間代替時(shí)間的方法，對比分析不同入侵年限互花米草及本土植物蘆葦群落土壤nirS型反硝化細(xì)菌組成及結(jié)構(gòu)變化，并進(jìn)一步探究其與土壤理化因子的相互關(guān)系，為評估互花米草入侵過程中濱海濕地土壤氮循環(huán)提供科學(xué)支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于江蘇鹽城濕地珍禽國家級自然保護(hù)區(qū)（32°36′51″—34°28′32″N，119°51′25″—121°5′47″E）?；セ撞萦?1983 年被引種于該濕地內(nèi)，在 30年的時(shí)間里依靠其強(qiáng)大的競爭力和繁殖能力迅速擴(kuò)展成為大面積的互花米草沼澤。且該物種已經(jīng)取代鹽地堿蓬在鹽城濱海濕地上先鋒植物群落的地位并迅速擴(kuò)散，逐漸在引種地形成了單一的優(yōu)勢植被群落（劉春悅等，2009）?；セ撞莸目焖贁U(kuò)張對鹽城濱海濕地生物多樣性及其生態(tài)系統(tǒng)的功能和價(jià)值影響的研究亟待加強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置于保護(hù)區(qū)核心區(qū)，位于斗龍港和新洋港之間，屬于弱潮區(qū)，潮汐類型為不規(guī)則的半日潮（王靖雯等，2017），屬于暖溫帶氣候，季風(fēng)盛行，降水充沛。冬季盛行來自高緯度陸地的偏北風(fēng)，夏季盛行來自太平洋的偏南風(fēng)，年平均氣溫約為13.8 ℃，年平均降水量約為1000 mm。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和樣品采集

采樣于2020年10月開展，根據(jù)不同時(shí)期遙感圖像疊加和往年研究設(shè)立的人工標(biāo)志物確定入侵時(shí)間，分別設(shè)置了江蘇鹽城濕地珍禽國家級自然保護(hù)區(qū)核心區(qū)的4個(gè)樣地：本土植物蘆葦、1989年互花米草入侵群落、2003互花米草入侵群落、2017年互花米草入侵群落，入侵時(shí)間分別為31年、17年、3年，用PA、SA31、SA17、SA3表示（圖1）。沿海潮間帶采樣點(diǎn)海拔相同，受潮汐影響較為一致。每個(gè)樣地隨機(jī)設(shè)置6個(gè)1 m×1 m的樣方，樣方之間距離不少于100 m，每個(gè)樣方內(nèi)采用五點(diǎn)取樣法使用土鉆一式三份取樣按0—20、20—40 cm的土壤。采集的樣品剝離表層凋落物后，將每個(gè)樣點(diǎn)中的同一層的土壤充分混合，形成復(fù)合土壤樣品，裝入無菌自封袋中，并用冰盒保存帶回實(shí)驗(yàn)室。將樣品分為2部分，1份置于?80 ℃超低溫冰箱保存，用于后續(xù)微生物實(shí)驗(yàn)的測定；1份放置于4 ℃冰箱，用于后續(xù)理化指標(biāo)的測定（風(fēng)干，研磨粉碎，過2 mm篩，上機(jī)測試等操作步驟）。

1.3 數(shù)據(jù)測定

土壤含水率（Soil Water Content，SWC）采用烘干稱量法（105 ℃，6—8 h至恒定質(zhì)量）；土壤全氮全碳（Total Nitrogen，TN；Total Carbon，TC），采用 Vario PYRO cube（Elemental，Germany）元素分析儀測定；土壤總有機(jī)碳（Total Organic Carbon，TOC）采用重鉻酸鉀外加熱滴定器滴定；土壤氨氮（NH4+-N）、硝氮（NO3?-N）用氯化鉀浸提后用流動分析儀測定；土壤pH使用pH計(jì)測定（水土質(zhì)量比1?2.5）；土壤鹽度（Salinity）采用電導(dǎo)率法測定，以5?1的水土比通過離心法制備水浸提液，使用便攜式電導(dǎo)率儀（DDS-307A，中國上海）測定，以此作為土壤鹽度，單位為 mS·cm?1。

根 據(jù) DNrasy PowerSoil Kit（Product of Germany）試劑盒說明書進(jìn)行土壤樣品總 DNA抽提，土壤反硝化菌群多樣性及群落組成采用第二代高通量測序平臺（Illumina Miseq）進(jìn)行測序分析；對每份土壤樣品采用nirS型反硝化細(xì)菌引物對cd3aF （ 5′-GTSAACGTSAAGGARACSGG-3′） 和R3cdR（5′-GASTTCGGRTGSGTCTTGA-3′），長度約為400 bp。對V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，接著進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，包括95 ℃變形30 sec，57 ℃退火30 min，72 ℃延伸45 sec；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min，10 ℃延伸 5 min。擴(kuò)增體系為 20 μL，5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mM dNTPs 2 μL，F(xiàn)orward Primer（5 μM）0.8 μL，Reverse Primer（5 μM）0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，Template DNA 10 ng，補(bǔ)超純水（ddH2O）至20 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

土壤微生物反硝化基因測定和測序：采用Illumina平臺對群落 DNA片段進(jìn)行雙端（Pairedend）測序，使用基于OTU聚類的Vsearch（Edgar et al.，2011）軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，在97%相似度水平對高質(zhì)量序列聚類，并分別輸出代表序列和OTU表；使用FrameBot（v1.2）對功能基因進(jìn)行校正，F(xiàn)rameBot分析之后，可獲得矯正的核酸序列和蛋白序列，而非目的片段將被去去除，后續(xù)將使用矯正的核算序列及進(jìn)行分析；使用 QIIME2（2019.4）進(jìn)行物種分類學(xué)注釋，采用nt（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋；利用 QIIME2（2019.4）計(jì)算土壤樣品的細(xì)菌 α多樣性：物種數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao 1指數(shù)、inverse Simpson指數(shù)和覆蓋度（Good’s coverage），使用未抽平的 OTU表，調(diào)用“qiime diversity alphararefaction”命令，設(shè)置參數(shù)“- -p-steps 10- -p-mindepth 10 - -p-iterations 10”，即最小抽平深度為10，參數(shù)“- -p-max-depth”設(shè)為全體樣本最低測序深度樣本序列量的95%，再在這一深度與最小深度之間均勻選取10個(gè)深度值，每個(gè)深度值抽平10次，計(jì)算所選的alpha多樣性指數(shù)。選取最大抽平深度時(shí)的得分平均值作為alpha多樣性指數(shù)。

數(shù)據(jù)分析：使用Excel整理數(shù)據(jù)，在分析前進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，使用SPSS 26軟件對文中數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行方差分析（ANOVA）；使用R軟件（Version 2.15.3）基于Bray-Curtis distance對土壤反硝化細(xì)菌群落進(jìn)行非度量多維尺度（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）分析，并對結(jié)果進(jìn)行Adonis檢驗(yàn)；使用R軟件（Version 2.15.3）將數(shù)據(jù)Hellinger標(biāo)準(zhǔn)化處理，以環(huán)境因子為解釋變量對土壤反硝化細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行 RDA分析，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽城濱海濕地土壤 nirS型反硝化細(xì)菌 alpha多樣性

對互花米草入侵不同年限群落以及本地物種蘆葦土壤nirS型反硝化細(xì)菌的alpha多樣性進(jìn)行分析，由表1可得，不同土層的各樣點(diǎn)覆蓋率均在97%以上，表明測序數(shù)據(jù)量合理，測序結(jié)果可以反應(yīng)樣地的真實(shí)情況。從豐富度來看，不同土壤深度中均表現(xiàn)為PA樣點(diǎn)和SA3樣點(diǎn)的豐富度最高，且顯著高于另外兩個(gè)樣地（P<0.05）。香農(nóng)-維納指數(shù)（Shannon）以及逆辛普森指數(shù)（Inverse Simpson）最高值均出現(xiàn)在本土植物蘆葦群落中，其中香農(nóng)-維納指數(shù)在兩個(gè)土壤深度中均有顯著性差異，而逆辛普森指數(shù)僅在20—40 cm土層中與互花米草群落存在顯著性差異（P<0.05），表明互花米草的入侵會降低土壤中細(xì)菌的alpha多樣性。通過圖2可以看出，隨著入侵時(shí)間的增加，互花米草不同入侵年限的alpha多樣性指數(shù)均表現(xiàn)為先降低后上升的趨勢，但在 0—20 cm土壤中多樣性指數(shù)變化的差異并不顯著，而在20—40 cm土壤中存在顯著性差異。

表1 各樣點(diǎn)反硝化細(xì)菌豐度與alpha多樣性Table 1 The abundance and alpha diversity of denitrifying microorganisms at each sample point

由表2可知，江蘇鹽城濱海濕地互花米草不同入侵年限對土壤nirS型反硝化細(xì)菌的影響達(dá)到顯著水平（P<0.05），土壤深度對nirS型反硝化細(xì)菌的多樣性特征未產(chǎn)生顯著影響（P<0.05），且入侵年限和土壤深度變化的交互效應(yīng)也未對土壤nirS型反硝化細(xì)菌多樣性產(chǎn)生顯著影響（P<0.05）。

表2 入侵時(shí)間和土層深度對濱海濕地土壤反硝化細(xì)菌Shannon指數(shù)影響的雙因素方差分析Table 2 Two-factor variance analysis of the impact of invasion time and soil depth on the Shannon index of soil denitrifying microorganisms in coastal wetlands

2.2 鹽城濱海濕地土壤反硝化細(xì)菌beta多樣性分析

圖3為NMDS的分析結(jié)果，設(shè)定的排序軸數(shù)量為2，0—20 cm土壤深度和20—40 cm土壤深度應(yīng)力值（Stress）分別為0.127、0.095，表明分析結(jié)果具有解釋意義。基于Bray-Curtis距離的Adonis分析（非參數(shù)多元方差分析）表明，0—20 cm土壤深度各樣點(diǎn)之間具有顯著性差異（P=0.001），對群落變異的貢獻(xiàn)為46.4%（R2=0.464）；20—40 cm土壤深度各樣點(diǎn)之間具有顯著性差異（P=0.001），對群落變異的貢獻(xiàn)為57.9%（R2=0.579）。由圖3可得，反硝化細(xì)菌群落組成差異可以明顯將4種植物群落區(qū)分開，說明4種植物土壤反硝化細(xì)菌群落組成存在明顯差異，且 0—20 cm土壤中各樣點(diǎn)反硝化細(xì)菌群落組成差異要小于20—40 cm土壤中各樣點(diǎn)反硝化細(xì)菌群落組成差異。此外，不同土層深度中均表現(xiàn)為SA17和SA31樣點(diǎn)土壤反硝化細(xì)菌群落組成差異最小，而PA樣點(diǎn)和SA3樣點(diǎn)土壤反硝化細(xì)菌群落組成差異最大，這從某種程度上說明互花米草入侵剛發(fā)生時(shí)會使土壤中反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大變化，隨著入侵時(shí)間的增加群落組成差異逐漸降低，但仍與本地物種蘆葦土壤反硝化細(xì)菌群落組成存在較大差異。

圖3 濱海濕地土壤nirS型反硝化細(xì)菌群落的NMDS分析Figure 3 NMDS analysis of nirS-type denitrifying microbial community in coastal wetland soil

2.3 鹽城濱海土壤反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成

對鹽城濱海濕地nirS型反硝化細(xì)菌屬水平進(jìn)行分析，由圖4可得，大部分細(xì)菌屬于變形菌門（Proteobacteria）中的 γ-變形菌綱（γ-Proteobacteria，30.84%—51.73%）。兩個(gè)土壤深度均存在特有的反硝化菌屬，但相對豐度不高。0—20 cm中土壤深度中，Ideonella、副球菌屬（Paracoccus）在20—40 cm土壤深度中并未檢測到；20—40 cm土壤深度中，BacteriumO、Ruegeria等在0—20 cm土壤深度中并未檢測到。

圖4 各樣點(diǎn)土壤反硝化細(xì)菌（屬水平）Figure 4 Soil denitrifying microorganisms at each sample point (Genus level)

從入侵時(shí)間來看，兩個(gè)土壤深度中反硝化細(xì)菌相對豐度變化并不一致。在0—20 cm土壤深度固氮弧菌屬（Azoarcus）、嗜氫菌屬（Hydrogenophilus）、海桿菌屬（Marinobacter）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）等隨著入侵時(shí)間的增加相對豐度不斷增加，而色假高炳根氏菌屬（Pseudogulbenkiania）、伯克氏菌屬（Cupriavidus）等隨著入侵時(shí)間的增加相對豐度不斷減??；在20—40 cm土壤深度中，羅河桿菌屬（Rhodanobacter）、嗜氫菌屬（Hydrogenophilus）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、色鹽桿菌屬（Chromohalobacter）隨著入侵時(shí)間的增加相對豐度不斷增加，而固氮螺菌屬（Azospirillum）、Sulfuritalea等隨著入侵時(shí)間的增加相對豐度不斷減小。在不同土壤深度中變化一致的反硝化細(xì)菌有假單胞菌屬（Pseudomonas）、嗜氫菌屬（Hydrogenophilus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、磁螺菌屬（Magnetospirillum）等。與本地物種蘆葦土壤nirS型反硝化細(xì)菌相比，互花米草入侵后相對豐度明顯增多的有羅河桿菌屬（Rhodanobacter）、固氮弧菌屬（Azoarcus）、嗜氫菌屬（Hydrogenophilus）等，而假單胞菌屬（Pseudomonas）在互花米草入侵后相對豐度減少。

2.4 鹽城濱海濕地土壤環(huán)境因子對反硝化細(xì)菌的影響

本地物種蘆葦（PA）以及互花米草不同入侵年限（SA3、SA17、SA31）采樣點(diǎn)土壤理化性質(zhì)如表3所示，由表可得，蘆葦群落與互花米草群落之間以及入侵不同年限的互花米草群落之間土壤理化性質(zhì)存在顯著性差異（P<0.05）。從不同土壤深度來看，除C/N之外其余土壤理化指標(biāo)在不同土壤深度中變化基本一致；從入侵年限來看，土壤含水率（SWC）、總碳（TC）、pH、總氮（TN）等指標(biāo)含量隨著入侵年限的增加而增加，而 C/N、總有機(jī)碳（TOC）、硝態(tài)氮（NO3?-N）等指標(biāo)含量隨著入侵年限的增加而減小。此外，鹽度（Salinity）、銨態(tài)氮（NH4+-N）含量呈現(xiàn)出隨著入侵年限增加先顯著減小后逐漸增加的趨勢?；セ撞輼狱c(diǎn)土壤中鹽度、硝態(tài)氮、總有機(jī)碳、總碳等指標(biāo)含量顯著高于本地物種蘆葦樣地（P<0.05），而含水率、銨態(tài)氮、pH等指標(biāo)含量蘆葦樣地顯著高于互花米草樣地（P<0.05）。

表3 不同采樣點(diǎn)土壤理化性質(zhì)特征Table 3 Characteristics of soil physical and chemical properties at different sampling points

圖5為濱海濕地反硝化細(xì)菌各屬相對豐度與環(huán)境因子相關(guān)性熱圖，由圖可得，在0—20 cm土壤深度中，大部分細(xì)菌各屬相對豐度均同時(shí)受到多種環(huán)境因子的影響，而嗜氫菌屬（Hydrogenophilus）、伯克氏菌屬（Cupriavidus）相對豐度僅與總碳和總氮含量存在顯著相關(guān)性，且總碳的相關(guān)性要高于總氮。在20—40 cm土壤深度，基本所有細(xì)菌屬相對豐度都同時(shí)受到多種環(huán)境因子的影響，其中含水量、pH、鹽度、總有機(jī)碳、硝態(tài)氮與各屬相對豐度相關(guān)性較強(qiáng)，含水率和pH相關(guān)性的正負(fù)變化一致，而鹽度、總有機(jī)碳以及硝態(tài)氮的變化一致，且與含水率和pH的相關(guān)性變化相反。

圖5 濱海濕地土壤反硝化細(xì)菌群落與環(huán)境因子的關(guān)系Figure 5 Relationship between soil denitrifying microbial community and environmental factors in coastal wetlands

通過冗余分析（Redundancy Analysis，RDA）進(jìn)一步確定影響鹽城濱海濕地反硝化細(xì)菌群落的主導(dǎo)環(huán)境因子。在0—20 cm土壤深度，RDA分析結(jié)果前兩個(gè)典范軸能解釋的方差分別為 22.92%和12.25%，從圖6a中可以看出，總碳、總氮對于樣本沿著第一軸分布起到關(guān)鍵作用，鹽度、pH、總有機(jī)碳、含水率對樣本沿著第二軸分布起到關(guān)鍵作用；在20—40 cm土壤深度，RDA分析結(jié)果前兩個(gè)典范軸能夠解釋的方差分別為29.21%和21.47%，從圖6b中可以看出，總氮、總碳對于樣本沿著第一軸分布起到關(guān)鍵作用，鹽度、含水率、總有機(jī)碳對于樣本沿著第二軸分布起到關(guān)鍵作用。綜合來看，鹽度、pH、總碳含量對鹽城濱海濕地不同土壤深度反硝化細(xì)菌組成變化均具有主導(dǎo)作用。

圖6 濱海濕地反硝化細(xì)菌群落與環(huán)境因子的RDA分析Figure 6 RDA analysis of denitrifying microbial communities and environmental factors in coastal wetlands

3 討論

3.1 鹽城濱海濕地互花米草群落土壤反硝化細(xì)菌多樣性特征

生態(tài)系統(tǒng)維持其生態(tài)功能所必需的各種地球化學(xué)循環(huán)過程是由土壤微生物介導(dǎo)的（O’Brien et al.，2016），入侵植物通過改變地上植被的演替來改變土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)從而影響土壤微生物的多樣性（鄭潔等，2017）。目前已有許多關(guān)于入侵植物引起的土壤微生物群落以及生態(tài)系統(tǒng)功能變化的研究（Elgersma et al.，2011；Arthur et al.，2013），例如，Hawkes et al.（2015）發(fā)現(xiàn)外來入侵植物可以改變土壤氨氧化細(xì)菌的數(shù)量和組成，從而影響了土壤總硝化速率。本研究發(fā)現(xiàn)，與本地物種蘆葦相比，互花米草群落土壤反硝化細(xì)菌的香農(nóng)-維納以及逆辛普森指數(shù)均有不同程度的下降，這表明互花米草的入侵可能會導(dǎo)致原生濕地土壤反硝化細(xì)菌的多樣性降低，這與 Zhang et al.（2013）的研究結(jié)果一致。但目前有研究表明，互花米草入侵紅樹林濕地后會增加根際土壤中的細(xì)菌多樣性（Hong et al.，2015；Zheng et al.，2018）。這可能是由于原生生態(tài)系統(tǒng)植被類型的不同導(dǎo)致的，如尹曉雷（2020）的研究表明互花米草入侵不同植被，其土壤微生物多樣性變化不同。蘆葦相比與其他的濕地植物有著較為發(fā)達(dá)的根系，且其土壤有機(jī)質(zhì)含量較多，土壤微生物的變化會和地表植物相互影響（Goh et al.，2013）。因此原生植物蘆葦群落土壤細(xì)菌豐富度較高，在互花米草入侵后會導(dǎo)致土壤反硝化細(xì)菌多樣性下降。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)在不同入侵年限的互花米草群落中，土壤nirS型反硝化細(xì)菌多樣性指數(shù)（Shannon和Inverse Simpson）在0—20 cm土壤深度中沒有顯著性變化，但在20—40 cm土壤深度中存在顯著性差異（P<0.05）。這可能是由于與nirK型反硝化細(xì)菌相比，含nirS基因的反硝化細(xì)菌多為兼性厭氧菌，它們更容易適應(yīng)更深層的土壤環(huán)境（Beller et al.，2006），所以在20—40 cm土壤中nirS型反硝化細(xì)菌表現(xiàn)出更為顯著的差異性。在入侵時(shí)間與土壤深度對土壤反硝化細(xì)菌Shannon指數(shù)影響的雙因素方差分析中發(fā)現(xiàn)土壤深度并未對nirS型反硝化細(xì)菌產(chǎn)生顯著影響（P<0.05），這可能是由于本研究中選擇的土層較薄（20 cm）。在本研究中確定的3個(gè)不同入侵年限的互花米草群落，其土壤反硝化細(xì)菌多樣性表現(xiàn)為隨著入侵年限的增加先降低后增加的趨勢，即SA3>SA31>SA17。但根據(jù)Zhang et al.（2020）的研究，在互花米草10年的入侵年限中，土壤細(xì)菌多樣性也呈現(xiàn)出先降低后增加的趨勢，即入侵至少2年的互花米草群落>入侵至少10年的互花米草群落>入侵至少5年的互花米草群落。所以可能在互花米草入侵的時(shí)間序列上土壤細(xì)菌多樣性并不是簡單的線性變化，而是不規(guī)則的波浪曲線變化并最終趨于穩(wěn)定，這還需要劃分更為精細(xì)的入侵年限以及大量室內(nèi)實(shí)驗(yàn)和長期野外觀測來驗(yàn)證。

3.2 鹽城濱海濕地互花米草群落土壤反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征

入侵植物的影響會隨著時(shí)間的推移而變化（Dostál et al.，2013），且目前已有研究表明，土壤理化性質(zhì)、植物類型和植物根系分泌物對細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)變化具有顯著影響（Jiang et al.，2013）。從本研究結(jié)果來看，在鹽城濱海濕地互花米草31年的入侵時(shí)間序列上，土壤反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有規(guī)律的發(fā)生變化。不同入侵年限互花米草群落之間土壤反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著，且與本地物種蘆葦群落明顯分開。大體表現(xiàn)為入侵3年互花米草群落與本地物種蘆葦群落土壤反硝化細(xì)菌結(jié)構(gòu)差異最大，隨著入侵時(shí)間的增加，互花米草群落與蘆葦群落土壤反硝化細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)差異逐漸減小。從屬水平來看，互花米草入侵鹽城濱海濕地后，假單胞菌屬、羅河桿菌屬、色假高炳根氏菌屬的相對豐度發(fā)生較大變化。其中，本地物種蘆葦群落優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬，入侵發(fā)生后，假單胞菌屬相對豐度降低，羅河桿菌屬成為優(yōu)勢菌屬。假單胞菌屬能夠利用有機(jī)污染物如多環(huán)芳烴（PAHs）作為碳源（廖丹等，2018），這可能是其成為優(yōu)勢菌屬的原因?；セ撞萑肭趾笥袡C(jī)碳等土壤有機(jī)物顯著增加（表3），且當(dāng)前核心區(qū)內(nèi)多環(huán)芳烴（PAHs）等有機(jī)污染物污染較輕（蔡楊等，2021），從而導(dǎo)致羅河桿菌屬相對豐度增加，改變了鹽城濱海濕地土壤中所含優(yōu)勢菌群。此外，Cupriavidus菌群在互花米草入侵后相對豐度顯著減少，這可能與土壤中 N素含量有關(guān)。Cupriavidus基因組測序顯示該基因位于參與反硝化途徑的硝酸還原酶、亞硝酸鹽還原酶和氧化亞氮還原酶的編碼基因上（Kutralam-Muniasamy et al.，2019），特別是作用于硝態(tài)氮的去除過程（Su et al.，2020）。反硝化細(xì)菌與環(huán)境因子相關(guān)性（圖5）也表明，該菌群與硝態(tài)氮含量呈負(fù)相關(guān)，而與銨態(tài)氮含量呈正相關(guān)。

3.3 互花米草入侵過程中土壤理化性質(zhì)變化對反硝化細(xì)菌的影響

互花米草入侵會導(dǎo)致濱海濕地土壤理化性質(zhì)發(fā)生變化，進(jìn)而對濕地微生物群落組成和多樣性產(chǎn)生顯著影響（霍玉珠等，2021）。先前研究表明，植物入侵對土壤理化性質(zhì)的影響隨入侵時(shí)間的增加發(fā)生變化（Liao et al.，2006；Souza-Alonso et al.，2015）。在本研究中，互花米草入侵濱海濕地后，土壤理化性質(zhì)呈現(xiàn)有序的變化。其中，土壤pH值與原生植被相比顯著降低，這與Yang et al.（2016）的研究結(jié)果相同。但也有研究表明，互花米草入侵后土壤pH值會增加（Gao et al.，2017），這可能是由于土壤類型、本地植物種類、入侵時(shí)間等的不同導(dǎo)致土壤 pH對互花米草入侵的反應(yīng)不同（Carey et al.，2015）。土壤鹽度是決定海濱植物分布的最重要環(huán)境因子之一（Wang et al.，2010），本研究結(jié)果表明土壤鹽度在互花米草群落中顯著增加，且隨著入侵時(shí)間的增加鹽度顯著降低后趨于穩(wěn)定。與蘆葦相比，互花米草具有更高的耐鹽能力，但高鹽脅迫也會影響互花米草的生長（肖燕等，2011）。這可能是導(dǎo)致互花米草群落土壤鹽度高于蘆葦群落的原因，同時(shí)也在一定程度上說明植物可以直接或間接的改變土壤環(huán)境。此外，在互花米草入侵后，土壤有機(jī)碳含量顯著增加。植物入侵可以改變土壤碳源并影響原生生態(tài)系統(tǒng)生物地球化學(xué)循環(huán)（Yang et al.，2017）。互花米草是C4植物，其光合作用效率高于C3植物蘆葦，因而有更高的生產(chǎn)力，積累更多的生物量（王卿等，2006），從而導(dǎo)致互花米草群落土壤有機(jī)碳含量顯著增加。

土壤細(xì)菌群落可能會受到植物物種和土壤特征之間相互作用的影響（Marschner et al.，2001），且環(huán)境因素在影響土壤細(xì)菌群落的組成和結(jié)構(gòu)方面起著核心作用（Freedman et al.，2015）。本研究中，RDA分析結(jié)果表明鹽度是影響鹽城濱海濕地土壤反硝化細(xì)菌結(jié)構(gòu)和組成最關(guān)鍵的因素。目前已有許多鹽度對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響的研究，但至今結(jié)果仍沒有定論。如Campbell l et al.（2013）研究發(fā)現(xiàn)鹽度的改變可以使細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，而Sun et al.（2015）發(fā)現(xiàn)高鹽度并不會顯著改變土壤微生物群落組成。本研究結(jié)果表明，慢生根瘤菌屬、色鹽桿菌屬和鹽單胞菌屬相對豐度在兩個(gè)土壤深度中均與土壤鹽度呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），互花米草入侵后土壤鹽度顯著升高，導(dǎo)致這3種菌群相對豐度減小。此外，在本研究中總碳和pH也是影響土壤反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要因素。其中，總碳與Cupriavidus、假單胞菌屬呈極顯著負(fù)相關(guān)，而與嗜氫菌屬呈極顯著正相關(guān)（P<0.05）；pH與慢生根瘤菌呈極顯著正相關(guān)，而與假單胞菌屬呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。這說明，不同的環(huán)境因子影響作用于特定菌群，共同作用相互交織影響了鹽城濱海濕地土壤反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和相對豐度。

4 結(jié)論

鹽城濱海濕地互花米草入侵過程中，植物種類和入侵時(shí)間的變化以及它們的交互作用，影響土壤理化性質(zhì)的時(shí)空異質(zhì)性，從而對鹽城濱海濕地土壤nirS型反硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)及多樣性產(chǎn)生影響。土壤nirS型反硝化細(xì)菌多樣性在0—20 cm和20—40 cm土壤深度中沒有顯著變化，但在互花米草和蘆葦群落之間以及不同入侵年限的互花米草之間呈現(xiàn)出有規(guī)律的變化。研究結(jié)果表明入侵植物對濱海濕地土壤反硝化細(xì)菌的形成具有重要影響，而入侵對原生生態(tài)系統(tǒng)生態(tài)功能的影響需要進(jìn)一步的探索。