干擾物對食品檢驗定性影響的風險實證和控制分析

黃璐瑤 ,余曉琴 ,魏宇濤 ,閔宇航 ,貌 達

(1.四川省食品檢驗研究院,成都 610097;2.國家市場監(jiān)管重點實驗室(白酒監(jiān)管技術(shù)),成都 610097;3.中國計量科學研究院,北京 100013)

化學分析領(lǐng)域工作中,方法優(yōu)化及過程質(zhì)量控制都是為了得到準確可靠的檢驗結(jié)果。檢驗結(jié)果的正確性、準確性和可靠性一直是人們關(guān)注的重點。2020年底,媒體爆出日本藥企小林化工株式會社發(fā)生嚴重混藥事故,導致服用該藥物的患者2人死亡、上百人健康受損。據(jù)報道,該批次藥物在出廠前曾采用液相色譜進行成分分析,出現(xiàn)了一個未知色譜峰,表明其主要成分可能不同,有異物混入,但并未引起公司重視,最終造成事故發(fā)生。由此可見,忽略任何一個微小或異常的因素都可能嚴重影響檢驗結(jié)果。

筆者所在實驗室開展食品檢驗多年,常遇到各種影響定性和定量準確性的事件。及時排查干擾,可有效避免烏龍事件發(fā)生,防止錯判、誤判,保證檢驗結(jié)果與結(jié)論的正確性,這對整個食品安全監(jiān)管工作具有至關(guān)重要的作用。目前,食品理化檢驗的質(zhì)量控制研究多數(shù)集中在檢驗技術(shù)的研發(fā)與應用,以及檢驗過程中人、機、物、料、法、環(huán)、測等方面存在的風險因子上[1-6],而關(guān)于檢驗過程中發(fā)生干擾的原因分析及其解決措施的研究較少。本工作對食品檢驗過程中發(fā)生的真實干擾案例進行了分析歸納,可為解決干擾問題的控制措施的制定提供參考。

1 干擾案例分類

1.1 高效液相色譜法干擾案例

食品基質(zhì)復雜,采用高效液相色譜法測定時,若僅通過保留時間定性,可能存在干擾,造成結(jié)果偏高甚至假陽性的發(fā)生[7-10]。

1.1.1 蜜餞中山梨酸干擾案例

在初始條件下,山梨酸標準品與樣品中疑似物的保留時間分別為12.445 min和12.492 min,在線提取光譜,二者分別在波長253 nm 和283 nm 處具有最大吸收,如圖1所示。通過改變流動相酸度和洗脫梯度可將二者分離,樣品中疑似物的保留時間為13.515 min,山梨酸的保留時間延長至29.868 min,如圖2所示。通過標準品比對驗證,該干擾物為5-羥甲基糠醛,如圖3所示。

圖1 初始條件下山梨酸和樣品的色譜圖及山梨酸和樣品中疑似物的紫外-可見吸收光譜圖Fig.1 Chromatograms of sorbic acid and the sample,and UV-Vis absorption spectra of sorbic acid and the suspect in the sample under initial conditions

圖2 改變分析條件后樣品的色譜圖及其中疑似物和山梨酸的紫外-可見吸收光譜圖Fig.2 Chromatogram of the sample and UV-Vis absorption specta of the suspect and sorbic acid in the sample after changing analytical conditions

圖3 改變分析條件后5-羥甲基糠醛的色譜圖及紫外-可見吸收光譜圖Fig.3 Chromatogram and UV-Vis absorption spectrum of 5-hydroxymethylfurfural after changing analytical conditions

5-羥甲基糠醛主要是由含糖量高的食品在加工和儲藏過程中發(fā)生美拉德反應和焦糖化反應而產(chǎn)生的,是一種內(nèi)源性污染物[11-12]。研究表明,山楂、蘋果及其制品中展青霉素的測定也存在5-羥甲基糠醛干擾[13-14]。因為這些基質(zhì)易受曲霉屬、青霉屬、絲衣霉屬等真菌污染[15-17],5-羥甲基糖醛與其次級代謝產(chǎn)物展青霉素具有相似結(jié)構(gòu),簡單的提取和凈化步驟很難使二者分離。

1.1.2 奶茶中糖精鈉干擾案例

在初始條件下,糖精鈉和樣品中疑似物的保留時間分別為12.730 min和13.157 min。在線提取光譜,發(fā)現(xiàn)二者在205 nm 處均有最大吸收,且紫外-可見吸收光譜圖接近,如圖4所示。流動相酸度對糖精鈉的色譜行為影響很小,通過調(diào)整流動相比例成功使二者分離,保留時間分別延長至15.887 min和17.776 min。向樣品中加入糖精鈉標準品可進一步驗證該結(jié)論,如圖5所示。

圖4 初始條件下糖精鈉和樣品的色譜圖及糖精鈉和樣品中疑似物的紫外-可見吸收光譜圖Fig.4 Chromatograms of saccharin and the sample,and UV-Vis absorption spectra of saccharin and the suspect in the sample under initial conditions

圖5 改變條件后糖精鈉、樣品和加標樣品的色譜圖Fig.5 Chromatograms of saccharin,the sample and the spiked sample after changing analytical conditions

1.1.3 食品、保健食品中其他干擾案例

除上述案例,食品和保健食品檢驗中還存在其他干擾案例。

調(diào)味品中蘇丹紅Ⅳ,花椒油中丁基羥基茴香醚(BHA),三、四級食用植物油中叔丁基對羥基苯二酚(TBHQ),測定時都易存在干擾,即在目標化合物保留時間附近出現(xiàn)紫外吸收光譜不一致的色譜峰。文獻[18]報道,前處理使用的中性氧化鋁凈化柱活性不好,可導致蘇丹紅干擾峰形成。文獻[19]報道在檢測TBHQ 時,發(fā)現(xiàn)三、四級菜籽油在HP-5色譜柱上存在干擾。通過加標驗證與質(zhì)譜確證確認干擾存在,更換色譜柱后成功排除假陽性結(jié)果。

三氯蔗糖和D-鹽酸氨基葡萄糖同屬于末端吸收,無法根據(jù)紫外吸收光譜定性判定,遇到干擾只能采取質(zhì)譜確證方法。經(jīng)驗證,三氯蔗糖易受阿斯巴甜干擾,尤其在醬油、豆制品、醬腌菜中時常發(fā)生。Cl－則會干擾D-鹽酸氨基葡萄糖的測定[20]。

1.2 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法干擾案例

相比高效液相色譜法,高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有更高的靈敏度和更強大的分析能力,但使用過程中,仍可能遇到干擾情況。

1.2.1 蝦中呋喃唑酮代謝物干擾案例

在初始條件下,呋喃唑酮代謝物(AOZ)標準品和樣品中疑似物的保留時間均為5.37 min,但標準品色譜峰的相對豐度比值為0.41,樣品中疑似物色譜峰的相對豐度比值為2.10,相對豐度比不匹配。同時,通過測定其他蝦樣品發(fā)現(xiàn),AOZ 其中一對定性離子對[質(zhì)荷比(m/z)236.0/104.1]的離子通道存在干擾。通過更換色譜柱和梯度洗脫程序,可將疑似物與AOZ 成功分離。向蝦樣品中加標,進一步確證該分離結(jié)果,如圖6所示。

圖6 改變分析條件后蝦加標樣品的色譜圖Fig.6 Chromatogram of shrimp spiked sample after changing analytical conditions

1.2.2 再制蛋中地美硝唑干擾案例

在初始條件下,地美硝唑標準品和樣品中疑似物的保留時間分別為5.58 min和5.63 min,且相對豐度比匹配,疑似檢出地美硝唑。更換色譜柱后,二者保留時間變?yōu)?.14 min和5.98 min,分離度得到提升,向再制蛋樣品中加入地美硝唑標準品,確證該結(jié)論,如圖7所示。

圖7 更換色譜柱后再制蛋加標樣品的色譜圖Fig.7 Chromatogram of reproductive egg spiked sample after changing chromatographic column

1.2.3 雞肉中利巴韋林干擾案例

相關(guān)試驗表明,測定利巴韋林時動物源性基質(zhì)中常存在一個雜質(zhì)干擾峰(尿苷,uridine)[21-22]。利巴韋林在普通C18柱上不能保留,文獻[22]在優(yōu)化利巴韋林測定條件時,重點比較了利巴韋林在C8及不同固定相(酰胺基、醇羥基和兩性離子)的HILIC柱上的保留效果。筆者實驗室遇到干擾問題后,采用不同粒徑和長度的色譜柱進行優(yōu)化,成功將利巴韋林與干擾物分開,見圖8。

圖8 利巴韋林及干擾物在不同色譜柱的分離Fig.8 Separation of ribavirin and interferent on different chromatographic columns

由圖8可看出,利巴韋林在Hypercarb色譜柱上有較好保留。材質(zhì)相同的情況下,粒徑越小,長度越長,分離效果越好。

1.2.4 其他干擾案例

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法中存在的干擾物還可能是目標化合物的同分異構(gòu)體。如測定1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑時,三者具有相同母離子和子離子,必須選擇合適色譜柱使之完全分離。文獻[23]對食用植物油進行檢測時發(fā)現(xiàn),乙基麥芽酚的同分異構(gòu)體與其保留時間相近、特征離子相對豐度比一致,也會產(chǎn)生干擾。

2 食品檢驗中判斷和解決干擾問題的措施

2.1 人員培訓

在排除過程污染的情況下,食品檢驗中干擾來源可分為內(nèi)源性和外源性兩種。內(nèi)源性干擾包括自身存在的或在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的物質(zhì)等,如油炸食品中的丙烯酰胺、烤肉中的雜環(huán)胺、高糖食品中的5-羥甲基糠醛、牛奶中的苯甲酸等。外源性干擾可能是為了保持食品風味、增強口感、改善外觀或其他品質(zhì)等而人為添加的物質(zhì)。檢驗人員需熟悉食品生產(chǎn)工藝,掌握不同類型食品的營養(yǎng)物質(zhì)及有害物質(zhì)在生產(chǎn)中的變化,了解添加的或可能由生產(chǎn)帶入的物質(zhì),這將有助于更科學、更合理地進行綜合判定,防止錯判、誤判。

此外,食品檢驗過程涉及人員較多,有樣品受理和樣品預處理人員,也有直接參與試驗過程的人員。前者雖不會直接對樣品進行檢驗,也無法確認樣品中是否存在干擾,但這個環(huán)節(jié)如果處理不當可能會造成污染,影響最終測定結(jié)果。因此,培訓各環(huán)節(jié)人員掌握污染來源十分重要。

2.2 質(zhì)量控制

為取得準確可靠的測定結(jié)果,需進行過程質(zhì)量控制,包括空白試驗、加標回收或質(zhì)控樣品測定。全試劑空白試驗用以驗證試驗系統(tǒng)有無污染、試劑是否存在干擾,基質(zhì)空白試驗則有助于發(fā)現(xiàn)一類樣品中是否存在普遍干擾。加標回收和質(zhì)控樣品所選擇的基質(zhì)應盡量與待測樣品保持一致,客觀反映試驗操作過程的同時可通過數(shù)據(jù)判斷是否有干擾的存在。

2.3 進行典型樣品實證,建立系統(tǒng)分析方法

食品檢驗中,分析人員需熟悉儀器性能,積累多項目、多基質(zhì)的典型色譜圖,建立系統(tǒng)分析方法。方法建立時,建議起草單位除優(yōu)化基本的提取、檢測條件外,還應加大對不同類型樣品的實證,充分考慮不同基質(zhì)可能存在的干擾情況,達到優(yōu)化系統(tǒng)的目的。同時,為保證出具的檢驗數(shù)據(jù)和結(jié)論客觀、公正,分析人員應嚴格按照規(guī)定方法開展檢驗工作,梳理試驗流程,找準各環(huán)節(jié)可能存在的風險點,并在試驗過程中對可能存在的干擾情況進行分析判斷,提出解決方案。

對于有紫外或者可見光吸收的化合物,可利用光電二極管陣列檢測器進行光譜掃描,通過保留時間一致、光譜圖匹配同時進行定性,判斷待測化合物是否存在干擾。對于無紫外或弱紫外吸收的化合物,如糖類,使用紫外檢測器易受到其他溶劑干擾,影響測定結(jié)果,常使用示差折光檢測器或蒸發(fā)光散射檢測器。針對這類無法通過光譜比對的情況,可通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法確證結(jié)果。

在色譜分析中,根據(jù)目標化合物性質(zhì)盡量選擇合適的色譜柱、流動相及洗脫程序,在分離目標化合物與干擾物的同時,注意合適的保留時間,如保留時間太短,易有共流物或同分異構(gòu)體產(chǎn)生干擾。存在疑似干擾時,可優(yōu)化色譜條件使目標化合物與干擾物分離。優(yōu)化方式包括調(diào)節(jié)流動相比例或梯度,調(diào)整流動相酸度以及更換色譜柱等。必要時通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行確證。使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀時,需關(guān)注目標化合物保留時間、相對豐度比,甚至峰形。必要時,除上述提及的3種優(yōu)化方式外,還可通過更換儀器工作條件,如改變離子源參數(shù)或選擇不同離子對、多對離子對同時進行測定。條件允許的情況下,還可以采用高分辨質(zhì)譜進行進一步確認。

3 結(jié)語

食品檢驗是一項縝密的分析工作,需準確分析和判斷試驗中可能存在的干擾情況,才可能避免錯判、誤判,以提升食品安全分析實驗室排查干擾的能力,提高檢驗結(jié)果的準確度。