高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定尿液中12種鄰苯二甲酸酯類代謝物的含量

石飛云,徐夢媛,靳 藝,唐宏兵,歐陽運富,黎俊宏

(常州市疾病預(yù)防控制中心,常州 213022)

增塑劑鄰苯二甲酸酯類化合物(PAEs)是工業(yè)上被廣泛使用的高分子材料助劑,在玩具、壁紙、食品包裝材料、地板、化妝品、醫(yī)療器具以及膠黏劑等行業(yè)中應(yīng)用廣泛[1],在塑料加工中添加PAEs可以增強塑料的柔韌性、容易加工。在塑料制品中,PAEs一旦遇到所包裝物質(zhì)如水、油脂等時很容易溶出,而且經(jīng)過長時間作用,會從塑料中溢出,對周圍環(huán)境如食品、土壤、空氣、水等造成污染。PAEs在環(huán)境中很難被降解,已經(jīng)成為一種常見的環(huán)境污染物[2-4]。有研究資料表明,PAEs在人體內(nèi)停留一段時間才會排出,長期會造成免疫力及生殖力下降。因此,很多國家將PAEs 列為優(yōu)先監(jiān)測的污染物[5-9]。

PAEs進入人體后迅速代謝為相應(yīng)的單酯,如短鏈的PAEs經(jīng)酯水解為單酯排泄到尿液;長鏈的PAEs被簡單地水解后,經(jīng)烷基側(cè)鏈氧化形成單酯的氧化產(chǎn)物。單酯和單酯的氧化產(chǎn)物可經(jīng)生物轉(zhuǎn)化與葡萄糖醛酸結(jié)合,大部分結(jié)合的和未結(jié)合的代謝物從尿中排出。因此,尿中代謝產(chǎn)物的含量能夠間接反映個體PAEs的攝入量[10-12]。目前,國內(nèi)外關(guān)于PAEs的檢測研究比較多,而對于PAEs代謝物的分析研究相對較少。國內(nèi)外人體尿液中PAEs代謝物基本都是采用固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測[11]。

本工作在尿液酶解后直接用乙腈定容,冷凍除去雜質(zhì)后過膜上樣,省去了固相萃取的繁瑣操作,采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定鄰苯二甲酸單甲酯(MMP)、鄰苯二甲酸單乙酯(MEP)、鄰苯二甲酸單異丁酯(MIBP)、鄰苯二甲酸單(2-乙基-5-羥己基)酯(MEHHP)、鄰苯二甲酸單正丁酯(MNBP)、鄰苯二甲酸單(2-乙基-5-氧己基)酯(MEOHP)、鄰苯二甲酸單芐酯(MBZP)、鄰苯二甲酸單環(huán)己酯(MCHP)、鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯(MEHP)、鄰苯二甲酸單正辛酯(MOP)、鄰苯二甲酸單異壬酯(MNP)、鄰苯二甲酸單異癸酯(MDP)等12種PAEs代謝物的含量,并進行了方法學(xué)驗證,其精密度和回收率均符合要求。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

島津LCMS-8060型高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀;Multi Reax多點渦旋振蕩器。

單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:100 mg·L－1,準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品0.001 0 g,分別用甲醇溶解并定容至10 mL,配制成100 mg·L－1的單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,于4 ℃保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別移取MMP、MEP、MCHP、MBZP、MEOHP、MEHHP、MEHP、MOP、MNP、MDP標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1.0 mL,MIBP 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液2.0 mL,MNBP標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液3.0 mL,用甲醇定容至100 mL,配制成MMP、MEP、MCHP、MBZP、MEOHP、MEHHP、MEHP、MOP、MNP、MDP 的質(zhì)量濃度均為1 mg·L－1,MIBP 的質(zhì)量濃度為2 mg·L－1,MNBP的質(zhì)量濃度為3 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于4 ℃保存待用[13]。

單內(nèi)標(biāo)儲備溶液:100 mg·L－1,稱取各內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品0.001 0 g,分別用甲醇溶解并定容至10 mL,配制成質(zhì)量濃度為100 mg·L－1的單內(nèi)標(biāo)儲備溶液。

混合內(nèi)標(biāo)溶液:4 mg·L－1,分別取單內(nèi)標(biāo)儲備溶液各1 mL,用甲醇定容至25 mL,配制成質(zhì)量濃度均為4 mg·L－1的混合內(nèi)標(biāo)溶液,于4 ℃保存待用。

12種PAEs代謝物及其內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)品純度均不小于95%;β-葡萄糖醛酸酶溶液,85 000 U·m L－1;甲醇、乙腈均為色譜純;試驗用水為高純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Waters 苯基色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm);流量0.3 mL·min－1;進樣量5μL;柱溫40 ℃;流動相A 為0.1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸溶液,B為乙腈;梯度洗脫程序:0～2.0 min 時,A 為95%;2.0～4.0 min時,A 由95%降至40%;4.0～6.0 min時,A 由40%降至10%,保持2.0 min;8.0～8.5 min時,A 由10%升至95%,保持1.5 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子(ESI)源,負(fù)離子模式;碰撞氣為氬氣;霧化氣流量3 L·min－1;加熱氣流量10 L·min－1;干燥氣流量10 L·min－1;接口溫度300℃;脫溶劑溫度526℃;脫溶劑管溫度250℃;加熱塊溫度400 ℃。

其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。其中“?”代表定量離子。

表1 (續(xù))

1.3 試驗方法

移取2 mL尿液,置于5 mL 聚乙烯管中,加入4 mg·L－1混合內(nèi)標(biāo)溶液0.01 mL、不低于850 U·m L－1的β-葡萄糖醛酸酶溶液和1 mol·L－1乙酸銨溶液0.5 mL,充分振蕩。于37 ℃水浴條件下水解2.0 h,取出降至室溫[14],用乙腈定容至5 mL,渦旋混勻,冷凍2 h,取出恢復(fù)至常溫后,過0.22μm 有機濾膜,濾液按照儀器工作條件測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按照儀器工作條件測定含100μg·L－112種PAEs代謝物和8μg·L－1內(nèi)標(biāo)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,所得色譜圖見圖1。

圖1 色譜圖Fig.1 Chromatogram

2.2 水解時間的選擇

以低、中濃度水平的陽性樣品為研究對象,固定水解溫度為37 ℃,試驗考察了水解時間對12 種PAEs代謝物(以MIBP 計)測定結(jié)果的影響,結(jié)果見表2。

表2 水解時間對MIBP測定結(jié)果的影響Tab.2 Effect of hydrolysis time on determination results of MIBP

結(jié)果表明:水解時間為1.0 h時,MIBP 測定值較低,說明水解不完全;水解時間為2.0,3.0,4.0 h時,雖MIBP測定值仍在增高,但變化不大,說明在2.0 h時基本水解完全?？紤]到試驗成本及分析效率,試驗選擇水解時間為2.0 h。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

在目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)中加入非生物基質(zhì)的空白溶液(甲醇),配制成低、中、高濃度水平的空白溶劑加標(biāo)溶液系列;按照試驗方法處理空白樣品基質(zhì),并加入目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo),配制成低、中、高濃度水平的空白基質(zhì)加標(biāo)溶液系列。按照儀器工作條件測定上述溶液系列,獲得12種PAEs代謝物和相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的信號強度,計算目標(biāo)物和相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)因子(MF＝空白基質(zhì)加標(biāo)溶液中的峰面積/空白溶劑加標(biāo)溶液中的峰面積),結(jié)果見表3。當(dāng)MF 小于0.85時,存在基質(zhì)抑制效應(yīng);當(dāng)MF 為0.85～1.15時,基質(zhì)效 應(yīng)不明顯;當(dāng)MF大于1.15時,存在基質(zhì)增強效應(yīng)。

表3 基質(zhì)效應(yīng)Tab.3 Matrix effect

由表3可知:MMP、MEP及其相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的MF為0.28～0.50,說明存在嚴(yán)重的基質(zhì)抑制效應(yīng);MDP、MOP、MNP、MEHP及其相應(yīng)內(nèi)標(biāo)在濃度水平較低和較高時都存在基質(zhì)增強效應(yīng);MEHHP在50.0μg·L－1濃度水平下的MF 為0.83,存在較弱的基質(zhì)抑制效應(yīng);其余目標(biāo)物及其相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的MF均在0.85～1.15內(nèi),基質(zhì)效應(yīng)不明顯。鑒于此,試驗采用基質(zhì)匹配法消除基質(zhì)干擾。

2.4 工作曲線、檢出限和測定下限

分別移取2 mL空白尿液置于一組5 mL 離心管中,加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和4 mg·L－1的混合內(nèi)標(biāo)溶液0.01 mL,向各離心管中加入不低于850 U·m L－1的β-葡萄糖醛酸酶溶液和1 mol·L－1乙酸銨溶液0.5 mL[15],配制成12 種PAEs代謝物質(zhì)量濃度分別為1.00,5.00,10.0,20.0,50.0,100,200μg·L－1,內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為8μg·L－1的基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。按照儀器工作條件測定,以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以目標(biāo)物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)繪制工作曲線,內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明,12種PAEs代謝物工作曲線的線性范圍均為1.00～200μg·L－1,其線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表4。

以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N),以3倍檢出限計算測定下限,結(jié)果見表4。

表4 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.4 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

表4 (續(xù))

2.5 精密度和回收試驗

對空白尿液進行加標(biāo)回收試驗,按照試驗方法平行測定6次,計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表5。

表5 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝6)Tab.5 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表5 可知,12 種PAEs代謝物的回收率為75.3%～114%,測定值的RSD 為1.5%～10%,說明方法精密度和準(zhǔn)確度均良好。

2.6 樣品分析

采用已建立的方法對35份9～10歲兒童尿液樣品進行測定,結(jié)果如表6所示。

表6 樣品分析結(jié)果Tab.6 Analytical results of the samples μg·L－1

表6 (續(xù)) μg·L－1

由表6可知:MDP未檢出;11種PAEs代謝物均有檢出,其中MMP和MNP的檢出率均為69%,MBZP的檢出率為6%,其余8 種PAEs代謝物的檢出率均為100%。

本工作采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定尿液中12種PAEs代謝物的含量。方法簡便快速,尿液酶解后直接用乙腈定容,冷凍除去雜質(zhì)后過膜上樣,省去了固相萃取的繁瑣操作,節(jié)省了檢測成本,靈敏度高,重現(xiàn)性好,為日常監(jiān)測提供了良好的方法學(xué)基礎(chǔ)。