白術(shù)多糖指紋圖譜和抗氧化活性的譜效關(guān)系分析

朱靜堅 ,伍春桃 ,周玉磊 ,楊惠寧 ,田 薇?

(1.縉云縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,麗水 323000;2.浙江農(nóng)林大學(xué),杭州 310000)

白術(shù)(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)具有抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)肝臟和調(diào)節(jié)人體免疫力的臨床活性,在癌癥、糖尿病、肝炎、免疫缺陷等疾病的防治中起著重要的作用[1]。由于自然環(huán)境和人為因素對白術(shù)藥物中活性成分影響顯著,白術(shù)藥材質(zhì)量存在著巨大差異,因此迫切需要制定嚴(yán)格的白術(shù)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。以往的研究主要集中在白術(shù)中的小分子化合物上,如黃酮類、萜類和揮發(fā)性成分的質(zhì)量評價體系的建立等。多糖也是白術(shù)中的主要成分[2],具有一定的抗氧化活性,而由于白術(shù)中多糖組成成分復(fù)雜,其提取分離方法和在質(zhì)量控制方面的研究報道較少,且相關(guān)研究進(jìn)展緩慢,嚴(yán)重制約了白術(shù)多糖質(zhì)量的評價和功能性多糖產(chǎn)品的商業(yè)化開發(fā)[3]。

目前,藥用植物中多糖質(zhì)量評價的報道很少,涉及的藥材僅有黃芪[4]、靈芝[5]、藏紅花[6],主要采用指紋圖譜及其抗氧化活性建立多糖質(zhì)量的評價體系。同時,多糖抗氧化活性的作用機(jī)制尚不明確,已有的研究表明:含有葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸的酸性多糖中存在醛、酮等親電基團(tuán),有利于氫從O－H鍵中釋放出來,對多糖抗氧化活性的貢獻(xiàn)較大[7];多糖的抗氧化活性與鼠李糖、甘露糖和半乳糖具有正相關(guān)關(guān)系[8],與葡萄糖呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,與半乳糖不相關(guān)[9]。另外,由于多糖的組成、結(jié)構(gòu)和檢測方法的復(fù)雜性,長期以來將其作為大多數(shù)植物的藥用活性成分并沒有得到重視[10]。復(fù)雜的組成和結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了不同來源藥材中多糖的種類和含量的差異,因此可篩選出特征多糖,使其成為潛在的化學(xué)標(biāo)記物[11-12]。基于此,本工作采用高效液相色譜法(HPLC)采集指紋圖譜,以白術(shù)多糖抗氧化活性與化學(xué)計量學(xué)相結(jié)合的方法,探討白術(shù)多糖的潛在化學(xué)標(biāo)記物,為建立不同產(chǎn)地白術(shù)多糖的有效評價體系奠定基礎(chǔ)。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters 2695系列高效液相色譜系統(tǒng),配紫外檢測器;DZF-6020型真空干燥箱;UV-2100型紫外分光光度計。

單糖混合對照品溶液:0.45 g·L－1,準(zhǔn)確稱取適量的鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、半乳糖對照品,用水溶解稀釋,配制成質(zhì)量濃度均為0.45 g·L－1的單糖混合對照品溶液。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液:1.00 g·L－1,準(zhǔn)確稱取10 mg無水葡萄糖,用水溶解并定容至10 mL,配制成質(zhì)量濃度為1.00 g·L－1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:分別移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1,2,3,4,5 mL,用水稀釋并定容至10 mL,配制成質(zhì)量濃度為0.10,0.20,0.30,0.40,0.50 g·L－1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖醛酸和半乳糖對照品的純度均不小于99%;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、三氟乙酸(TFA)為分析純;乙腈為色譜純;試驗用水為超純水。

38批白術(shù)樣品(S1～S38)來自不同地區(qū),詳細(xì)信息見表1。

表1 38批白術(shù)樣品的產(chǎn)地Tab.1 Producing regions of 38 batches of Atractylodes macrocephala samples

1.2 儀器工作條件

SunFire-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱溫30 ℃;檢測波長245 nm;流量1.0 mL·min－1;進(jìn)樣量20μL。流動相A 為0.1 mol·L－1磷酸鹽緩沖液(pH 6.0),B 為乙腈;梯度洗脫程序:0～10 min時,A 為83%;10～25 min時,A 由83%降至78%;25～35 min 時,A 由78%降至50%;35～40 min 時,A 由50% 升 至70%;40～45 min時,A 由70%升至83%。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立

移取單糖混合對照品溶液100μL 置于5 mL的安瓿瓶 中,加 入0.6 mol·L－1氫氧化 鈉溶液100μL,混勻,加入0.5 mol·L－1PMP 100μL,于70 ℃反應(yīng)60 min。取出,放冷,加入0.3 mol·L－1鹽酸溶液100μL,轉(zhuǎn)移至5 mL 離心管中,渦旋混勻。加入三氯甲烷1 mL,以轉(zhuǎn)速3 000 r·min－1離心10 min,棄去三氯甲烷層,重復(fù)3次至三氯甲烷層無顏色,水層即為混合對照品溶液。按照儀器工作條件測定,使用國家藥典委員會發(fā)布的?中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)?軟件(2004A 版),將混合對照品溶液的HPLC數(shù)據(jù)進(jìn)行峰匹配,制作標(biāo)準(zhǔn)色譜圖,建立標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

1.3.2 白術(shù)多糖含量的測定

取50 g白術(shù)粗粉,用500 mL 水于90 ℃提取2次(第1次3 h,第2次2 h),過濾,將合并的濾液減壓濃縮至100 mL,加入250 mL 95%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙醇溶液,靜置,過濾,濾渣用無水乙醇反復(fù)洗滌,于65℃烘箱中干燥,粉碎,即得白術(shù)多糖。白術(shù)多糖的質(zhì)量與白術(shù)粗粉質(zhì)量的比值即為得率。參考文獻(xiàn)[13],采用苯酚-硫酸法測定白術(shù)多糖的含量。

1.3.3 白術(shù)多糖指紋圖譜的建立

準(zhǔn)確稱取0.05 g白術(shù)多糖,置于5 mL 安瓿瓶中,用2 mL的4 mol·L－1TFA 溶液溶解,密封,于105 ℃保存6 h。冷卻至室溫,濾膜過濾,旋蒸,加入3 mL 甲醇,旋蒸干燥(重復(fù)3 次),用水定容至10 mL,備用。

對文獻(xiàn)[14]中PMP柱前衍生單糖的方法進(jìn)行了改進(jìn)。將50μL 的水解多糖樣品與50μL 的3 mol·L－1氫氧化鈉溶液混合,再加入0.5 mol·L－1的PMP甲醇溶液50μL,于70 ℃反應(yīng)60 min,放冷,用50μL的0.5 mol·L－1鹽酸溶液中和反應(yīng)混合物。用1 mL 三氯甲烷提取溶液,萃取,靜置30 min,重復(fù)3次,用水定容至10 mL,過0.45μm濾膜,得到供試品溶液。按照儀器工作條件進(jìn)行測定,建立白術(shù)多糖指紋圖譜。

1.3.4 白術(shù)多糖抗氧化活性的測定

1) 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力

參考文獻(xiàn)[15]方法評價DPPH 自由基清除能力,并計算半數(shù)最大抑制濃度(IC50)值。

2) 羥自由基清除能力

參考文獻(xiàn)[16],制備羥自由基芬頓反應(yīng)體系,采用水楊酸比色法測定羥自由基清除能力,并計算IC50值。

3) Fe3＋總還原能力

參考文獻(xiàn)[17]方法評價Fe3＋總還原能力,并計算IC50值。

1.3.5 多元統(tǒng)計分析

用角度余弦值評價樣品色譜圖相對標(biāo)準(zhǔn)色譜圖的相似度,使用SIMCA-P(version 11.5,Umetrics AB,Umea,Sweden)軟件對白術(shù)多糖指紋圖譜和抗氧化活性進(jìn)行相似度分析、層次聚類分析(HCA)和偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)等多元統(tǒng)計分析,結(jié)果導(dǎo)出至R(版本3.62.0)以進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)驗證

2.1.1 儀器精密度試驗

取白術(shù)樣品S1 按試驗方法處理后,按儀器工作條件連續(xù)進(jìn)樣5次,記錄色譜峰信息。結(jié)果顯示:以PMP為參考物質(zhì),占總峰面積5%以上的主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積沒有明顯的變化。各主要色譜峰相對保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.050%～0.15%,相對峰面積的RSD 為0.58%～2.5%,滿足指紋圖譜的技術(shù)要求(RSD 小于3.0%)。說明儀器精密度良好。

2.1.2 重復(fù)性試驗

取白術(shù)樣品S1共5份,按試驗方法制備后分別進(jìn)樣分析,并記錄色譜峰信息。結(jié)果發(fā)現(xiàn):占總峰面積5%以上的主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積沒有明顯的變化。各主要色譜峰相對保留時間的RSD 為0.080%～2.5%,相對峰 面積的RSD 為0.64%～2.7%,滿足指紋圖譜的技術(shù)要求(RSD 小于3.0%)。說明方法具有良好的重復(fù)性。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗

稱取白術(shù)樣品S1,按試驗方法制備,分別放置0,4,8,12,24 h 后按照儀器工作條件進(jìn)樣分析,記錄色譜峰信息。結(jié)果發(fā)現(xiàn):占總峰面積5%以上的主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的比值沒有明顯的變化。各主要色譜峰相對保留時間的RSD 為0.29%～0.59%,相對峰 面積的RSD 為0.88%～2.3%,滿足指紋圖譜的技術(shù)要求(RSD 小于3.0%)。說明樣品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.2 白術(shù)多糖的得率和含量

38批白術(shù)樣品的多糖得率和含量見表2。其中S19(浙江新昌)多糖得率(32.91%)最高,S14(河北安國)多糖得率(15.04%)最低,其他白術(shù)樣品中多糖的得率大多為20.00%～30.00%。多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的是S22(湖南隆回,58.23%),最低的是S26(四川寶興,23.46%),其他白術(shù)樣品中的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為40.00%。結(jié)果表明,不同產(chǎn)地白術(shù)樣品的多糖產(chǎn)量(得率)和含量存在差異,而白術(shù)品質(zhì)可能與多糖產(chǎn)量和含量的差異有關(guān)。

表2 38批白術(shù)樣品中多糖得率和多糖含量Tab.2 Polysaccharide yield and content in 38 batches of Atractylodes macrocephala samples

2.3 指紋圖譜分析

在38批白術(shù)多糖指紋圖譜[圖1(a)]中,根據(jù)每個指紋峰的相對保留時間(以PMP 的保留時間為參考),多糖的共有峰鑒定出5種單糖,分別為鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖,與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜[圖1(b)]對應(yīng)。

圖1 HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints

2.4 相似度分析

采用夾角余弦法對不同產(chǎn)地白術(shù)多糖指紋圖譜進(jìn)行相似度分析,結(jié)果見表3。結(jié)果表明,38批白術(shù)多糖的相似度差異明顯,為0.47～0.94。在16個產(chǎn)地中,浙江的相似度最高,福建和安徽次之,均大于0.75。此外,產(chǎn)地相近的樣品具有相近的相似度?；诮Y(jié)果推測,白術(shù)樣品的差異與地理位置密切相關(guān)。

表3 38批白術(shù)多糖的相似度Tab.3 Similarity of 38 batches of Atractylodes macrocephala polysaccharide

表3 (續(xù))

2.5 白術(shù)多糖的抗氧化活性

白術(shù)多糖的抗氧化活性以IC50值表示。IC50值越低,白術(shù)多糖的抗氧化活性越強,結(jié)果如圖2所示。

圖2 38批白術(shù)多糖的抗氧化活性Fig.2 Antioxidant activity of 38 batches of Atractylodes macrocephala polysaccharide

結(jié)果表明:浙江、安徽和福建樣品的IC50值較小,貴州、湖北和湖南樣品的IC50值較大。DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力和Fe3＋總還原能力的IC50值的平均值分別為3.833,1.931,2.150 g·L－1。其中,S19(浙江新昌)表現(xiàn)最好,IC50值分別為1.272,0.608,0.930 g·L－1,S35(貴州貴定)表現(xiàn)最差,IC50值分別為8.801,4.326,8.620 g·L－1。相似地理位置樣品的抗氧化活性結(jié)果相似,即白術(shù)的抗氧化活性存在明顯的區(qū)域差異。多糖含量較高的湖南樣品(S22、S23)的IC50值較大,湖北樣品(S34)的IC50值也較大,推測白術(shù)多糖的抗氧化活性可能與多糖的組成結(jié)構(gòu)密切相關(guān),而與多糖的含量無關(guān),但需要進(jìn)一步驗證。

2.6 層次聚類分析

以組間連接為合并規(guī)則,角度余弦值為度量指標(biāo),利用HCA 對38批樣品進(jìn)行比較,可將38批樣品分為3類,如圖3所示。

圖3 38批白術(shù)多糖的HCAFig.3 HCA of 38 batches of Atractylodes macrocephala polysaccharide

大多數(shù)相似地理位置的樣品可以相鄰聚類,表明多糖組成及其比例與地理分布有一定的關(guān)系。河北的部分樣品和四川的樣品也可以聚為一類,可能與晝夜溫差大有關(guān),表明溫度可能是影響該組白術(shù)生長的主要因素。

2.7 偏最小二乘法-判別分析

16個產(chǎn)地38 批白術(shù)樣品HPLC 指紋圖譜的PLS-DA 模型沒有觀察到顯著差異,因此提取綜合指標(biāo)模型的變量重要性投影值(VIP),尋找對組間差異貢獻(xiàn)較大(VIP＞1.0)的成分,如圖4所示。

由圖4可知:半乳糖醛酸VIP 值為1.22,半乳糖VIP值為1.88,均大于1.0,表明半乳糖醛酸和半乳糖可以作為區(qū)分不同來源白術(shù)的潛在化學(xué)標(biāo)記物。在3種抗氧化活性檢測方法中,DPPH 自由基清除能力指標(biāo)對應(yīng)的VIP值為1.03,大于1.0,揭示DPPH 自由基清除能力對應(yīng)的抗氧化活性可作為白術(shù)多糖質(zhì)量輔助鑒別的候選檢測指標(biāo)。

本工作采用HPLC指紋圖譜、抗氧化活性結(jié)合化學(xué)計量學(xué)對16個產(chǎn)地38批白術(shù)多糖進(jìn)行質(zhì)量評價?；谙嗨贫确治觥CA 和PLS-DA,浙江、安徽、河北和四川的白術(shù)樣品分離顯著。此外,選擇半乳糖醛酸和半乳糖作為潛在的化學(xué)標(biāo)記物,DPPH自由基清除能力對應(yīng)的抗氧化活性可作為輔助鑒別的候選檢測指標(biāo)。本工作表明,指紋圖譜和抗氧化活性結(jié)合化學(xué)計量學(xué)是一種可靠的方法,可用于其他生物活性多糖的質(zhì)量控制,具有實用價值。