高效液相色譜法同時(shí)測定紅景天藥材中6種有效成分的含量及質(zhì)量相關(guān)性分析

胡英婕,王 磊

(錦州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)療學(xué)院,錦州 121000)

紅景天是?中華人民共和國藥典?(2020年版)(簡稱ChP 2020)一部收錄的中藥材,具有益氣活血、通脈平喘功效,用于治療氣虛血淤、胸痹心痛、中風(fēng)偏癱、倦怠氣喘等癥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,紅景天還具有抗缺氧、抗疲勞、抗衰老、抗抑郁、抗病毒、提高免疫力的功能。在復(fù)方制劑及保健品中都有廣泛應(yīng)用[1-2],約有二十多種紅景天為亞洲傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的常用藥,例如大花紅景天、薔薇紅景天、高山紅景天等[3-5]。

Ch P 2020中紅景天的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只有單一有效成分紅景天苷的含量測定。而紅景天的有效成分包括苷類(紅景天苷、熊果苷、花色苷)、黃酮類(蘆丁、異槲皮苷、槲皮素、山萘酚)、酪醇和沒食子酸等,測定紅景天中一種或幾種有效成分的含量也有報(bào)道[6-15],但還沒有同時(shí)測定紅景天中紅景天苷、熊果苷、酪醇、沒食子酸、山萘酚、槲皮素等6種有效成分含量的報(bào)道。本工作采用二極管陣列檢測器,提出了高效液相色譜法(HPLC)同時(shí)測定紅景天中6種有效成分含量的方法,對完善中藥材紅景天的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、保證藥材質(zhì)量、保證人民群眾用藥安全有效以及有效開發(fā)紅景天新制劑提供了參考依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

FΦ2200型高效液相色譜儀,配二極管陣列檢測器;KQ-100A 型超聲波清洗器;BP211D 型十萬分之一電子分析天平。

混合對照品溶液:精密稱取紅景天苷對照品3.00 mg、熊果苷 對照品2.50 mg、酪醇對照品1.50 mg、沒食子酸對照品2.00 mg、山萘酚對照品1.50 mg和槲皮素對照品1.00 mg,用甲醇溶解并定容至100 mL,配制成各對照品質(zhì)量濃度依次為30.0,25.0,15.0,20.0,15.0,10.0 mg·L－1的混合 對照品溶液。

紅景天苷對照品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.4%,批號(hào)174458- 201903;熊果苷對照品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%,批號(hào)165924- 201905;酪醇對照品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%,批號(hào)135689- 201903;沒食子酸對照品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%,批號(hào)157810- 201901;山萘酚對照品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%,批號(hào)101149- 201905;槲皮素對照品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.1%,批號(hào)142856- 201904;甲醇為色譜純;磷酸為分析純;試驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

大花紅景天、高山紅景天、狹葉紅景天、長鞭紅景天、唐古紅景天藥材,經(jīng)某執(zhí)業(yè)藥師鑒定為正品藥材。

1.2 色譜條件

ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5.0μm);柱溫35 ℃;流量0.8 mL·min－1;進(jìn)樣量10μL;流動(dòng)相A 為甲醇,B 為0.3%(體積分?jǐn)?shù),下同)磷酸溶液。梯度洗脫程序:0～20 min時(shí),A 為5%;20～30 min時(shí),A 由5%升至15%;30～50 min時(shí),A 由15%升至40%;50～60 min時(shí),A 由40%升至60%;60～75 min時(shí),A 由60%升至80%。檢測波長275 nm(0～50 min,檢測紅景天苷、熊果苷、酪醇、沒食子酸),360 nm(50～75 min,檢測山萘酚、槲皮素)。

1.3 試驗(yàn)方法

取已過3號(hào)篩[孔徑為(355±13)μm]的樣品粉末約1.0 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加入甲醇10 mL,密塞,稱重。常溫超聲提取30 min,放冷,再稱重,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量。搖勻,用0.45μm 濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得供試品溶液,需根據(jù)實(shí)際情況稀釋至線性范圍內(nèi),按照色譜條件進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的選擇

制備供試品溶液時(shí)曾用75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液(固液比1.0 g∶30 mL)加熱回流提取30 min,得到有效成分的色譜峰峰形不好,且拖尾嚴(yán)重。試驗(yàn)還嘗試用70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液(固液比1.0 g∶40 mL)于80 ℃微波提取樣品,結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅景天苷、熊果苷、山萘酚、槲皮素等4種有效成分的峰面積較小,提取不完全。而用甲醇(固液比1.0 g∶10 mL)常溫超聲提取樣品,得到有效成分的色譜峰峰形較好,分離度高,回收率好。因此,試驗(yàn)最終采用甲醇(固液比1.0 g∶10 mL)常溫超聲提取樣品。

2.2 流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)分別以乙腈-水、乙腈-0.3%磷酸溶液、甲醇-水、甲醇-0.3%磷酸溶液和甲醇-0.5%(體積分?jǐn)?shù),下同)磷酸溶液為流動(dòng)相體系進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明:以乙腈-水、甲醇-水為流動(dòng)相體系時(shí),色譜峰拖尾嚴(yán)重;以乙腈-0.3%磷酸溶液、甲醇-0.5%磷酸溶液為流動(dòng)相體系時(shí),色譜峰峰形不好,分離度差;而以甲醇-0.3%磷酸溶液為流動(dòng)相體系時(shí),可以避免色譜峰拖尾,峰形及分離效果均較好。因此,試驗(yàn)最終選擇以甲醇-0.3%磷酸溶液為流動(dòng)相體系,梯度洗脫條件見1.2節(jié)。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

按照色譜條件進(jìn)樣測定,采集275 nm(0～50 min,檢測紅景天苷、熊果苷、酪醇、沒食子酸)、360 nm(50～75 min,檢測山萘酚、槲皮素)的色譜圖,理論塔板數(shù)均不低于3 000,分離度均大于1.5?；旌蠈φ掌啡芤汉凸┰嚻啡芤旱纳V圖見圖1。

圖1 典型色譜圖Fig.1 Typical chromatograms

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

移取適量的混合對照品溶液,用甲醇逐級(jí)稀釋,配制成紅景天苷的質(zhì)量分別為0.30,0.60,0.90,1.20,1.50,1.80μg,熊果苷 的質(zhì)量 分別為0.25,0.50,0.75,1.00,1.25,1.50μg,酪醇和山萘酚的質(zhì)量分別為0.15,0.30,0.45,0.60,0.75,0.90μg,沒食子酸的質(zhì)量 分別為0.20,0.40,0.60,0.80,1.00,1.20μg,槲皮素 的質(zhì)量 分別為0.10,0.20,0.30,0.40,0.50,0.60μg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。按照色譜條件進(jìn)行測定,以各有效成分的質(zhì)量為橫坐標(biāo),對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1。

根據(jù)3倍信噪比(S/N)計(jì)算方法的檢出限(3S/N),結(jié)果見表1。

表1 線性參數(shù)和檢出限Tab.1 Linearity parameters and detection limits

2.5 精密度試驗(yàn)

按照色譜條件測定混合對照品溶液,平行進(jìn)樣6次。結(jié)果表明,紅景天苷、熊果苷、酪醇、沒食子酸、山萘酚、槲皮素峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別 為0.91%,0.74%,0.68%,1.1%,0.75%,0.87%,說明儀器的精密度良好。

取同一批次紅景天藥材,按照試驗(yàn)方法制備供試品溶液,平行測定6次。結(jié)果表明,紅景天苷、熊果苷、酪醇、沒食子酸、山萘酚、槲皮素的測定值依次為8.64,1.44,2.64,2.48,1.74,1.22 mg·g－1,RSD分別為1.1%,0.97%,1.2%,0.73%,0.98%和0.85%,說明方法的重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批次紅景天藥材,按照試驗(yàn)方法制備供試品溶液,分別在放置0,4,8,12,24 h后進(jìn)行測定。結(jié)果表明,紅景天苷、熊果苷、酪醇、沒食子酸、山萘酚、槲皮素峰面積的RSD 分別為0.81%,0.93%,1.2%,0.70%,1.1%,1.1%,說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 回收試驗(yàn)

取樣品粉末約0.5 g,精密稱定,分別按照紅景天苷、熊果苷、酪醇、沒食子酸、山萘酚、槲皮素含量的80%、100%、120%加入各對照品,按照色譜條件測定,每個(gè)濃度水平測定3次,計(jì)算加標(biāo)回收率,結(jié)果見表2。

表2 回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of test for recovery

2.8 樣品分析

取5種紅景天藥材各3批,按照1.3節(jié)試驗(yàn)方法制備供試品溶液,并按照1.2節(jié)色譜條件進(jìn)樣,測定6種有效成分的含量,結(jié)果見表3。對測定結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析,結(jié)果見表4。

由表3可知,5種紅景天藥材中所含紅景天苷的含量均符合藥典規(guī)定(最低不少于0.50%)。由表4方差分析結(jié)果可知,5種紅景天藥材中紅景天苷、熊果苷、酪醇、山萘酚、槲皮素成分的含量具有顯著性差異,樣本間的差異由抽樣誤差所致的概率小于0.01(P＜0.01),沒食子酸含量不具有顯著性差異,樣本間的差異由抽樣誤差所致的概率大于0.01(P＞0.01)。進(jìn)一步采用q檢驗(yàn)法對樣本測定值的平均值進(jìn)行兩兩比較,結(jié)果顯示大花紅景天中紅景天苷、熊果苷、山萘酚、槲皮素的含量最高,高山紅景天中酪醇含量最高,長鞭紅景天中紅景天苷含量最低,不到大花紅景天中紅景天苷含量的一半,可能是不同產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境迥異所致。如大花紅景天因生長在西藏高海拔地區(qū),自然生長環(huán)境嚴(yán)重缺氧和低溫干燥,紫外線照射強(qiáng)烈,造成其有效成分含量高。

表3 樣品分析結(jié)果Tab.3 Analytical results of the samples

表4 紅景天中6種有效成分的方差分析結(jié)果Tab.4 Results of variance analysis of 6 effective ingredients in Rhodiola

表4 (續(xù))

本工作采用HPLC 同時(shí)測定了來自不同產(chǎn)地紅景天藥材中紅景天苷、熊果苷、酪醇、沒食子酸、山萘酚、槲皮素的含量,方法操作簡便、易行,且方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果符合要求,可為建立紅景天藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)支持。由紅景天藥材樣品的測定結(jié)果可知,多指標(biāo)成分含量才能更全面科學(xué)地評(píng)價(jià)該藥材質(zhì)量,其所含化學(xué)成分的差異對其藥理作用、臨床功效產(chǎn)生的影響,有待進(jìn)一步探索。