固相萃取-離子色譜法測定坎地沙坦酯原料藥中疊氮化鈉和四丁基溴化銨的殘留量

李 晶,劉 敏,苗華明,劉麗霞,徐曉蕾

(迪沙藥業(yè)集團國家認定企業(yè)技術(shù)中心,威海 264200)

坎地沙坦酯是一種新型降壓藥,屬于選擇性血管緊張素Ⅱ受體(ATI)拮抗劑。疊氮化鈉和四丁基溴化銨作為坎地沙坦酯傳統(tǒng)工藝路線中的關(guān)鍵催化劑,在坎地沙坦酯的合成過程中發(fā)揮著重要作用。疊氮化鈉是劇毒物質(zhì),可抑制細胞色素氧化酶和其他酶,造成電子傳遞過程中斷,從而損害神經(jīng)系統(tǒng)[1]。四丁基溴化銨對皮膚、眼睛和呼吸系統(tǒng)有刺激性作用,且具有基因毒性警示結(jié)構(gòu)。為了保障藥物的質(zhì)量安全,中華人民共和國藥典(2015年版)和相關(guān)指導(dǎo)原則[2]規(guī)定,要嚴格控制兩者在藥物中的殘留量。由于未查到這兩種雜質(zhì)的具體毒性數(shù)據(jù),參照國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會(ICH)M7指導(dǎo)原則[3-4],兩種雜質(zhì)的每日最大服用量不得超過1.5μg,而坎地沙坦酯的日最大服用量為32 mg,可計算得到四丁基溴化銨和疊氮化鈉的質(zhì)量分數(shù)不得超過0.004 7%。而疊氮化鈉和四丁基溴化銨在藥物中殘留量較低,對檢測靈敏度要求高,因此開發(fā)一種高靈敏度的分析方法至關(guān)重要。

目前,測定疊氮化鈉和四丁基溴化銨的方法有液相色譜-質(zhì)譜法[5-7]、離子色譜法[8]。其中液相色譜-質(zhì)譜法操作復(fù)雜,對儀器要求高;四丁基溴化銨、疊氮化鈉均為離子型化合物,水解后會生成Br－、N 3－,經(jīng)陰離子淋洗系統(tǒng)(氫氧化鉀體系)淋洗后,可用附電導(dǎo)檢測器的離子色譜法檢測[9-10]。

鑒于此,本工作用水提取樣品中的兩種目標化合物,用HyperSep C18固相萃取小柱消除坎地沙坦酯的影響,采用附電導(dǎo)檢測器的離子色譜法進行抑制電導(dǎo)檢測。該方法操作簡便、靈敏度高、回收率好,可用于坎地沙坦酯原料藥中疊氮化鈉和四丁基溴化銨殘留量的測定。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

ICS-5000型離子色譜儀,配電導(dǎo)檢測器;DL-1000D 型智能超聲儀;HC2062 型高速離心機;MS105DU 型電子天平;Milli-Q 型超純水儀;HyperSep C18固相萃取小柱(200 mg/3 mL)。

疊氮化鈉對照品儲備溶液:7.25 mg·L－1,取疊氮化鈉對照品14.5 mg,用水溶解并定容至100 mL,分取5 mL置于100 mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻。

Br－對照品 儲備溶 液:1.00 mg·L－1,取1 000 mg·L－1Br－對照品溶液1 mL置于100 mL容量瓶中,用水稀釋至刻度。分取1 mL 置于10 mL容量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻。

NO3－對照品 儲備溶 液:1.00 mg·L－1,取1 000 mg·L－1NO3－對照品溶液1 mL 置 于100 mL容量瓶中,加水稀釋至刻度。分取1 mL置于10 mL容量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻。

系統(tǒng)適用性溶液:分別取1 mL 疊氮化鈉對照品儲備溶液、1.2 mL Br－對照品儲備溶液和4.7 mL NO3－對照品儲備溶液,置于同一10 mL容量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,即得含0.725 mg·L－1疊氮化鈉、0.12 mg·L－1Br－和0.47 mg·L－1NO3－的系統(tǒng)適用性溶液。

疊氮化鈉對照品純度為99.6%;1 000 mg·L－1Br－對照品溶液;1 000 mg·L－1NO3－對照品溶液;四丁基溴化銨為分析純;試驗用水為超純水(電阻率為18.2 MΩ·cm)。

坎地沙坦酯原料藥樣品由本公司自制。

1.2 儀器工作條件

IonPac AS18陰離子交換色譜柱(250 mm×4 mm,7.5μm);柱溫35℃;檢測方式為抑制電導(dǎo)檢測,抑制電流99 m A;電導(dǎo)池溫度35 ℃;進樣體積200μL;淋洗液為氫氧化鉀溶液,流量1.0 mL·min－1。梯度淋洗程序:0～25 min時,氫氧化鉀溶液濃度為9 mmol·L－1;25～38 min時,氫氧化鉀溶液濃度由9 mmol·L－1升至40 mmol·L－1;38～45 min 時,氫氧化鉀溶液濃度由40 mmol·L－1降至9 mmol·L－1。

1.3 試驗方法

取坎地沙坦酯原料藥樣品約100 mg,加入10 mL水,超聲15 min(每隔5 min強力振搖30 s)。分取約5 mL 置于10 mL 離心管中,以轉(zhuǎn)速10 000 r·min－1離心10 min。上清液過0.22μm濾膜,濾液過HyperSep C18固相萃取小柱(使用前先用3 mL甲醇活化,再用6 mL水沖洗干凈),收集洗脫液,經(jīng)0.22μm 濾膜過濾,濾液即為供試品溶液,按照儀器工作條件測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取步驟的影響

在樣品檢測時,發(fā)現(xiàn)供試品溶液中含量較高的坎地沙坦酯會吸附在色譜柱上且很難被洗脫掉,這將導(dǎo)致色譜柱柱壓變化,柱效降低。為了延長色譜柱使用壽命,試驗選擇在進樣前增加固相萃取步驟,以降低坎地沙坦酯對色譜柱的損害。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 檢測器

離子色譜常用的檢測器有電導(dǎo)檢測器和電化學(xué)檢測器,其中電導(dǎo)檢測器主要適用于離子型化合物,而四丁基溴化銨和疊氮化鈉均為離子型化合物,因此試驗選擇附電導(dǎo)檢測器的離子色譜進行抑制電導(dǎo)檢測。在此檢測條件下,背景電導(dǎo)以及基線噪聲較低,檢測靈敏度大大提高[11-14]。

2.2.2 色譜柱和柱溫

試驗考察了規(guī)格相同的不同陰離子色譜柱Ion-Pac AS11和Ion Pac AS18對Br－和N3－分離效果的影響。結(jié)果顯示:IonPac AS11 柱不能實現(xiàn)Br－和N3－的基線分離;而采用IonPac AS18 柱時,色譜峰峰形對稱,分離度良好。因此,試驗選擇的陰離子色譜柱為IonPac AS18柱。

試驗進一步考察了柱溫分別為30,35 ℃時對Br－和N3－分離效果的影響。結(jié)果顯示,兩種溫度下Br－和N3－均能完全分開,考慮到35℃時儀器壓力較小,試驗選擇的柱溫為35 ℃。

2.2.3 淋洗液濃度和淋洗方式

試驗考察了淋洗液氫氧化鉀溶液初始濃度分別為5,9 mmol·L－1時對Br－和N3－分離效果的影響。結(jié)果顯示,當淋洗液初始濃度為9 mmol·L－1時,N3－前后雜質(zhì)峰不干擾其出峰,因此試驗選擇淋洗液氫氧化鉀溶液的初始濃度為9 mmol·L－1。

水中常見的陰離子有NO2－、SO42－、HCO3－、NO3－、HCOO－,其中NO3－色譜峰位置和Br－、N3－的距離較近,可能影響B(tài)r－和N3－檢測結(jié)果的準確度。為保證Br－、N3－和NO3－能完全分離,試驗選擇梯度淋洗程序,即先采用較低濃度淋洗液淋洗25 min,保證Br－、N3－和NO3－完全出峰,然后用較高濃度淋洗液沖洗13 min,保證樣品帶進去的離子都被洗脫出來,最后平衡7 min,詳見1.2節(jié)。

2.3 四丁基溴化銨離子化程度的影響

四丁基溴化銨是一種有機鹽,其離子化程度會影響檢測結(jié)果的準確度。為了考察四丁基溴化銨離子化程度對測定結(jié)果的影響,分別配制0.82 mg·L－1四丁基 溴化銨溶液(Br－的質(zhì)量 濃度約0.20 mg·L－1)和0.20 mg·L－1Br－對照品溶液,按照儀器工作條件測定。結(jié)果顯示,兩種溶液中Br－的保留時間分別為19.843,19.797 min,峰面積分別為0.147,0.155μS·min,兩者保留時間和峰面積基本一致,以線性回歸方程計算得四丁基溴化銨溶液中Br－的質(zhì)量濃度為0.19 mg·L－1,所得Br－的回收率約為95.0%,說明四丁基溴化銨的離子化程度比較完全,檢測結(jié)果準確度較高。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗

按照儀器工作條件測定空白溶劑、供試品溶液和系統(tǒng)適用性溶液,色譜圖見圖1。

圖1 空白溶劑、系統(tǒng)適用性溶液和供試品溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of blank solvent,system suitability solution and test solution

結(jié)果顯示:Br－、N3－和NO3－均可實現(xiàn)基線分離,NO3－與N3－分離度為2.42;空白溶劑對Br－、N3－的檢測無干擾,供試品溶液中其他雜質(zhì)對Br－、N3－的檢測無干擾,說明該方法專屬性較好。

對系統(tǒng)適用性溶液連續(xù)進樣6 次,計算雜質(zhì)NO3－保留時間和峰面積的相對標準偏差(RSD),所得保留時間的RSD 不大于0.010%,小于1.0%,峰面積RSD 不大于0.5%,小于2.0%,滿足規(guī)定的檢測要求。

2.5 標準曲線、檢出限和測定下限

以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N),N3－和Br－的檢出限分別為0．00070,0．0014 mg·L－1。以10倍信噪比計算測定下限(10S/N),N3－和Br－的測定下限分別為0．00233,0．0048 mg·L－1。

用水逐級稀釋Br－對照品儲備溶液和疊氮化鈉對照品儲備溶液,以測定下限作為第一個濃度點,分別以0．466mg·L－1和0．120mg·L－1作為N3－和Br－的100%雜質(zhì)限度,再分別配制25%,50%,100%,150%,200% 雜質(zhì)限度的濃度點,即得0.002 33,0.116,0.233,0.466,0.699,0.932 mg·L－1的N3－對照品 溶液系列和0.0048,0.030,0.060,0.120,0.180,0.240 mg·L－1的Br－對照品溶液系列。按照儀器工作條件測定,以N3－和Br－的質(zhì)量濃度為橫坐標,其對應(yīng)的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結(jié)果顯示:N3－和Br－的標準曲線的線性范圍分別為0.002 33～0.932 mg·L－1和0.004 8～0.240 mg·L－1,線性回 歸方程 分別為y＝1.336x＋6.600×10－3和y＝8.006×10－1x－2.500×10－3,相關(guān)系數(shù)均為0.999 8。

2.6 精密度和回收試驗

按照試驗方法對空白樣品進行低、中、高等3個濃度水平的加標回收試驗,各濃度水平分別平行測定3,6,3次,計算回收率和中濃度水平下測定值的RSD,結(jié)果見表1。

表1 精密度和回收試驗結(jié)果Tab.1 Results of tests for precision and recovery

由表1可知,N3－和Br－的回收率分別為88.2%～93.5%和101%～104%,測定值的RSD 分別為2.6%和0.55%,說明方法的準確度和精密度均較好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

將加標供試品溶液(N3－和Br－的加標量分別為4.668 5,1.200 0μg)分別在室溫下放置0,2,4,6,8 h,按照儀器工作條件測定,計算峰面積的RSD。結(jié)果顯示,N3－和Br－峰面積的RSD 分別為2.3%和1.1%,說明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 耐用性試驗

略微調(diào)整淋洗液濃度、柱溫、流量參數(shù),比較了在不同色譜條件下系統(tǒng)適用性溶液中Br－、N3－和NO3－分離度的變化,結(jié)果見表2。

表2 耐用性試驗結(jié)果Tab.2 Results of test for durability

由表2 可知,略微調(diào)整色譜參數(shù)后,Br－與NO3－、N3－與NO3－之間的分離度均大于1.50,說明方法耐用性較好。

2.9 樣品分析

按照試驗方法分析坎地沙坦酯原料藥小試、中試以及批量生產(chǎn)產(chǎn)品各3批,分析結(jié)果見表3。

表3 樣品分析結(jié)果Tab.3 Analytical results of the samples

結(jié)果表明,開發(fā)的檢測方法可以滿足生產(chǎn)檢測的需求,同時樣品中的其他雜質(zhì)亦不干擾Br－、N3－的測定。

本工作采用離子色譜法同時測定坎地沙坦酯原料藥中疊氮化鈉和四丁基溴化銨的含量,原料藥以及溶劑水中其他雜質(zhì)離子對Br－、N3－干擾小。方法專屬性和靈敏度較好,準確度、穩(wěn)定性、耐用性均較好,可用于坎地沙坦酯原料藥質(zhì)量的監(jiān)控。