基于37種無(wú)機(jī)元素含量的主成分分析和層次聚類分析溯源當(dāng)歸產(chǎn)地

杜俊艷 ,劉志榮 ,馬 瀟 ,李冬華 ,宋平順 ,張 平 ,張明童?

(1.甘肅衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院,蘭州 730000;2.甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院,甘肅省中藏藥檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥材及飲片質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730070)

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根[1],主產(chǎn)區(qū)和道地產(chǎn)區(qū)均在甘肅,目前當(dāng)歸藥材主要依靠栽培,在青海、云南、四川等高海拔地區(qū)均有栽培。研究表明,當(dāng)歸中主要含藁本內(nèi)酯、阿魏酸、當(dāng)歸多糖、揮發(fā)油等活性成分[2-3],具有抗氧化、抗炎、抗心肌缺血、提高免疫、抗腫瘤等作用[4-5]。無(wú)機(jī)元素在維持人體新陳代謝方面起著關(guān)鍵作用,其進(jìn)入人體后,一部分與生物大分子結(jié)合,以多種金屬酶、金屬激素、氨基酸及蛋白質(zhì)的金屬絡(luò)合物等形式調(diào)節(jié)人體的新陳代謝[6-8],這些無(wú)機(jī)元素不僅是中藥材的組成成分,還可以和藥材中其他化學(xué)成分形成配合物,對(duì)中藥中化學(xué)結(jié)構(gòu)成分的解析以及有效成分的生物活性表達(dá)有著非常重要的作用[9-10]。近年來(lái),以多元統(tǒng)計(jì)分析建立的模式識(shí)別分析方法在中藥評(píng)價(jià)研究中應(yīng)用廣泛[11-12]。文獻(xiàn)[13-15]對(duì)某些中藥材中的無(wú)機(jī)元素進(jìn)行測(cè)定,通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)地的溯源,但鮮有通過(guò)無(wú)機(jī)元素研究不同產(chǎn)地當(dāng)歸的地域性分布及產(chǎn)地溯源的報(bào)道。

本工作采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICPMS)測(cè)定國(guó)內(nèi)4大產(chǎn)區(qū)26批當(dāng)歸藥材中Ag、As、Ba、Be、Bi、Cd、Ce、Co、Cr、Cs、Cu、Dy、Er、Eu、Gd、Hg、Ho、In、La、Li、Lu、Mn、Nd、Ni、Pb、Pr、Rb、Sc、Sm、Sr、Tb、Th、Tl、Tm、V、Y 和Yb等37種無(wú)機(jī)元素的含量,以其實(shí)測(cè)值為變量,應(yīng)用主成分分析確定當(dāng)歸中差異性特征元素;再選擇特征元素為變量進(jìn)行層次聚類分析,探索無(wú)機(jī)元素與藥材產(chǎn)地的關(guān)系,為當(dāng)歸的產(chǎn)地溯源提供試驗(yàn)方法和理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Perkin Elmer 2000型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀;Multiwave 7000 型超級(jí)微波消解儀;ME104E型電子天平。

36種元素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:移取適量的質(zhì)量濃度為10 mg·L－1的36種元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用3%(體積分?jǐn)?shù),下同)硝酸溶液稀釋,配制成質(zhì)量濃度為1 000μg·L－1的36 種元素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

Hg 元素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:取質(zhì)量濃度為1 000 mg·L－1的Hg元素標(biāo)準(zhǔn)溶液,用3%硝酸溶液稀釋,配制成質(zhì)量濃度為1 000μg·L－1的Hg元素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:分別移取適量的1 000μg·L－1的36 種元素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和1 000μg·L－1Hg元素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用3%硝酸溶液稀釋,配制成36 種元素質(zhì)量濃度為0,0.01,0.1,0.5,1,10,100,500μg·L－1,Hg元素質(zhì)量濃度為0,0.05,0.1,0.2,0.5,1,2μg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

混合內(nèi)標(biāo)溶液:20μg·L－1,分別移取質(zhì)量濃度為1 000 mg·L－1的48Ti、103Rh、186Re 內(nèi)標(biāo)溶 液2μL,置于100 mL容量瓶中,用3%硝酸溶液稀釋至刻度,搖勻。

調(diào)諧液:Ce、Co、Mn、Bi、In、Be的質(zhì)量濃度為0.1 mg·L－1。

36種元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,10 mg·L－1;Hg元素標(biāo)準(zhǔn)溶液,1 000 mg·L－1;48Ti、103Rh、186Re內(nèi)標(biāo)溶液,1 000 mg·L－1;氬氣和氦氣均為高純氣,純度為99.999%;硝酸為超高純;試驗(yàn)用水為超純水(電阻率大于18.2 MΩ·cm)。

當(dāng)歸藥材26批(編號(hào)S1～S26),經(jīng)鑒定均為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根。

采集信息見表1。

表1 不同產(chǎn)地的當(dāng)歸樣品信息Tab.1 Information of Angelica sinensis samples from different producing regions

1.2 儀器工作條件

脈沖電壓900 V;模擬電壓－1 675 V;等離子體功率1.2 k W,流量18 L·min－1;霧化氣壓力689.5 k Pa;輔助氣流量0.80 L·min－1,載氣流量0.86 L·min－1;冷卻循環(huán)水溫度15 ℃;測(cè)定模式為碰撞反應(yīng)模式,碰撞氣體為氦氣,重復(fù)測(cè)量3次。

1.3 試驗(yàn)方法

分別稱取各批次樣品粗粉0.3 g,置于石英消解罐中,加入2 mL 硝酸和1 mL 水,混勻,消解程序:0～5 min時(shí),功率升至800 W,保持10 min;15～30 min時(shí),功率由800 W 升至1 200 W,保持20 min;冷卻溫度80 ℃。待消解完全后,取出,放冷,轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,用少量水洗滌消解罐,洗液合并于容量瓶中,用3%硝酸溶液稀釋至刻度,搖勻,即得待測(cè)溶液。同法制得樣品空白溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限

按照儀器工作條件測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以各元素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得線性回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表2。

按照試驗(yàn)方法測(cè)定空白樣品溶液,平行測(cè)定11次,計(jì)算空白標(biāo)準(zhǔn)偏差(s),按照3s/k(k為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)計(jì)算檢出限,按照10s/k計(jì)算測(cè)定下限,結(jié)果見表2。

表2 線性參數(shù)、檢出限和測(cè)定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

結(jié)果表明,各元素的質(zhì)量濃度與對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均大于0.990 0;各元素的檢出限為0.02～48.43μg·kg－1,測(cè)定下限為0.06～161.44μg·kg－1。

2.2 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品6份,分別按1.3節(jié)試驗(yàn)方法制備待測(cè)溶液,按1.2節(jié)儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算各元素測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表明,各元素測(cè)定值的RSD 為0.81%～3.6%,說(shuō)明方法重現(xiàn)性良好。

取上述待測(cè)溶液1份,分別放置0,2,4,8,12 h后測(cè)定,結(jié)果顯示,各元素測(cè)定值的RSD 為0.83%～2.1%,說(shuō)明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 精密度和回收試驗(yàn)

取已知含量的供試品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平按照試驗(yàn)方法平行測(cè)定5次,計(jì)算各元素的回收率及測(cè)定值的RSD,結(jié)果見表3。

由表3可知,37種元素的回收率為78.9%～116%,RSD 為0.81%～4.8%,說(shuō)明方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝5)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

2.4 樣品分析

在甘肅、青海、四川和云南等地采集了26批當(dāng)歸藥材,按照試驗(yàn)方法測(cè)定其中37種無(wú)機(jī)元素的含量,結(jié)果見圖1,其中Tm、Lu、Bi、In、Ag未檢出,未列入圖1。

圖1 樣品分析結(jié)果Fig.1 Analytical results of the samples

結(jié)果表明:當(dāng)歸藥材中含有的主要無(wú)機(jī)元素為Ba(9.2～15.1 mg·kg－1)、Rb(8.6～16.3 mg·kg－1)、Mn(28.1～45.3 mg·kg－1)、Sr(19.1～29.5 mg·kg－1)、Cr(4.1～18.2 mg·kg－1)、Cu(6.7～9.4 mg·kg－1),以中位數(shù)統(tǒng)計(jì)各元素含量由大至小依次排序?yàn)镸n、Sr、Rb、Ba、Cr、Cu、V、Ce、Li、Ni、La、Nd、Y、Pb、Co、As、Sc、Th、Cs、Pr、Gd、Sm、Dy、Er、Yb、Cd、Hg、Tl、Be、Eu、Tb、Ho,這反映了在特定的生長(zhǎng)環(huán)境下當(dāng)歸對(duì)無(wú)機(jī)元素的吸收特征,當(dāng)歸對(duì)無(wú)機(jī)元素的吸收受自身對(duì)不同無(wú)機(jī)元素的吸收能力和根際土壤環(huán)境的影響。其中重金屬及有害元 素Pb(0.2～0.9 mg·kg－1)、Cd(0.02～0.06 mg·kg－1)、As(0.2～1.2 mg·kg－1)、Hg(0.002～0.03 mg·kg－1)、Cu(6.7～9.4 mg·kg－1)的含量均在WM/T 2－2004?藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)?中各元素限量值(Hg、As、Pb、Cu、Cd的限量值分別為0.2,2.0,5.0,20.0,0.3 mg·kg－1)以下。

2.5 當(dāng)歸中無(wú)機(jī)元素的含量等級(jí)

由于環(huán)境因素和植物自身的遺傳變異造成的遺傳特征不同,同種植物對(duì)不同無(wú)機(jī)元素的累積量不同,會(huì)有常量元素、微量元素及痕量元素的區(qū)別。而且不同的無(wú)機(jī)元素的本底差異極大,同種植物中不同無(wú)機(jī)元素含量的差異比較難以得出有意義的結(jié)論。只有比較同一種無(wú)機(jī)元素在某一植物中的含量和在自然界植物中的總體含量,才能更好地判斷該植物中無(wú)機(jī)元素含量在總體水平上究竟處于哪種水平。試驗(yàn)利用植物類中藥中無(wú)機(jī)元素含量區(qū)間表來(lái)度量當(dāng)歸中各元素含量的相對(duì)水平,將自然界植物中無(wú)機(jī)元素劃分為1～10級(jí),等級(jí)越高表明該植物中某種元素在自然界的相對(duì)水平越高[16]。從測(cè)定結(jié)果來(lái)看,當(dāng)歸藥材中V(6級(jí))和Co(6級(jí))與其他植物相比處于中等水平;Ni(4 級(jí))、Sr(4 級(jí))、Mn(3級(jí))、Ba(3級(jí))、Be(2級(jí))與其他植物相比處于較低水平,不同產(chǎn)地當(dāng)歸藥材中無(wú)機(jī)元素含量等級(jí)略有差別,但多數(shù)產(chǎn)地的當(dāng)歸藥材中各無(wú)機(jī)元素含量等級(jí)順序較為穩(wěn)定。另外當(dāng)歸藥材中重金屬及有害元素Hg(4級(jí))、Cu(3級(jí))、Cd(2級(jí))、As(3級(jí))均處于較低水平,說(shuō)明當(dāng)歸根際對(duì)這4種重金屬及有害元素富集能力較其他植物弱。

2.6 不同產(chǎn)地當(dāng)歸中無(wú)機(jī)元素的主成分分析

試驗(yàn)共測(cè)定當(dāng)歸中37種無(wú)機(jī)元素的含量,其中32種元素為有效數(shù)據(jù),采用SPSS 24.0軟件對(duì)測(cè)得的樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析,以期尋找表達(dá)產(chǎn)地差異的主要特征元素。測(cè)得樣本數(shù)據(jù)經(jīng)Bartlett檢驗(yàn),結(jié)果顯示29種無(wú)機(jī)元素含量數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布,其主成分分析結(jié)果見表4。

由表4 可知,總方差的84.051%貢獻(xiàn)來(lái)自前4個(gè)主成分,即這4個(gè)主成分包含了84.051%的當(dāng)歸中所測(cè)定的32種元素的信息數(shù)據(jù)。

表4 當(dāng)歸中無(wú)機(jī)元素的主成分分析特征值和方差貢獻(xiàn)率Tab.4 Characteristic values and variance contribution rates of principal component analysis of inorganic elements in Angelica sinensis

經(jīng)旋轉(zhuǎn)的成分矩陣分析可以確定4個(gè)主成分主要包含哪些元素的信息,分析結(jié)果見表5。

由表5可知,主成分1 中Sm、Nd具有較高的載荷值,主成分2中Cu、Cr具有較高的載荷值,主成分3中Cd、Rb具有較高的載荷值,主成分4 中Rb、Sr具有較高的載荷值。根據(jù)主成分對(duì)總方差的貢獻(xiàn)率,結(jié)合因子載荷,可以認(rèn)為Sm、Nd、Cu、Cr、Cd、Rb和Sr是當(dāng)歸的7種特征無(wú)機(jī)元素。

表5 方差最大正交法設(shè)計(jì)旋轉(zhuǎn)后的主成分載荷矩陣Tab.5 Principle component matrix rotated by variance maximum orthogonal design

2.7 不同產(chǎn)地當(dāng)歸的層次聚類分析

試驗(yàn)以所測(cè)26批樣品的7種特征無(wú)機(jī)元素含量數(shù)值為變量,采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)樣品進(jìn)行層次聚類分析,結(jié)果見圖2。

由圖2可知,26批當(dāng)歸樣品聚為2類,大致可聚類為西北產(chǎn)區(qū)和西南產(chǎn)區(qū)。其中Ⅰ類包括8批當(dāng)歸樣品(S19～S26),采自四川(S19～S22)和云南(S23～S26),四川和云南均地處西南,所產(chǎn)當(dāng)歸中7種特征無(wú)機(jī)元素分布更為相似;Ⅱ類包括18批當(dāng)歸樣品(S1～S18),明顯聚類為甘肅岷縣(1類)和青海(2類)2個(gè)小類,說(shuō)明甘肅岷縣所產(chǎn)當(dāng)歸中7種特征無(wú)機(jī)元素分布與青海所產(chǎn)當(dāng)歸有一定差異。分析表明,不同產(chǎn)地當(dāng)歸中無(wú)機(jī)元素的分布呈明顯的地域特性,通過(guò)當(dāng)歸中元素的差異分析可以實(shí)現(xiàn)當(dāng)歸的產(chǎn)地判別和溯源。另外現(xiàn)代研究表明,無(wú)機(jī)元素不僅參與人體代謝調(diào)節(jié),還可以與中藥中其他化學(xué)成分形成配合物以表達(dá)中藥生物活性[6-8]。因此,以當(dāng)歸中無(wú)機(jī)元素為切入點(diǎn)研究其地理差異性以及生物活性的表達(dá),將為當(dāng)歸的多指標(biāo)評(píng)價(jià)體系、產(chǎn)地溯源提供一定的研究思路。

圖2 不同產(chǎn)地當(dāng)歸中無(wú)機(jī)元素的層次聚類分析樹狀圖Fig.2 Hierarchical cluster analysis dendrogram of inorganic elements in Angelica sinensis from different producing regions

本工作以硝酸溶液消解采自甘肅、青海、四川和云南共計(jì)26批次的當(dāng)歸樣品,采用ICP-MS測(cè)定其中37種無(wú)機(jī)元素的含量,該方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確度高,可為當(dāng)歸中無(wú)機(jī)元素的測(cè)定提供依據(jù)。另外,應(yīng)用主成分分析和層次聚類分析方法確定當(dāng)歸中差異性特征元素,將樣品按產(chǎn)區(qū)進(jìn)行了區(qū)分,反映了樣本的地域性,可為當(dāng)歸產(chǎn)地的選擇和種植栽培提供參考。