超高效液相色譜-電化學(xué)檢測法測定飲料中愛德萬甜和5種二氫查耳酮類甜味劑的含量

淳澤利 ,谷瑩瑩 ,陳榮祥?

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 生命科學(xué)研究院,遵義 563000;2.遵義醫(yī)科大學(xué) 遵義市理化分析測試工程技術(shù)研究中心,遵義 563000;3.遵義醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院,遵義 563000)

甜味劑作為食品添加劑,調(diào)節(jié)著飲料的風味。愛德萬甜作為一種新型的高甜度甜味劑[1],由阿斯巴甜和香蘭素通過化學(xué)反應(yīng)合成而得,其分子式為C24H30N2O7·H2O。通過國家衛(wèi)生和計劃生育委員會發(fā)布的2017年第8號公告可知,愛德萬甜作為新品種的食品添加劑被允許加入到飲料中,其限量值為0.003 g·kg－1[2-3]。以新橙皮苷二氫查耳酮為代表的二氫查耳酮類甜味劑是一類天然甜味劑,常用于食品生產(chǎn)。

目前,關(guān)于愛德萬甜和二氫查耳酮類甜味劑檢測方法的報道均較少。愛德萬甜的測定方法有高效液相色譜-二極管陣列檢測法(HPLC-DAD)[1,4]、高效液相色譜-熒光檢測法[5]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[3,6-9];二氫查耳酮類甜味劑的測定方法有毛細管電泳法[10]、高效液相色譜法[11-15]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[16-18]等。由于愛德萬甜的甜度較高,其添加量相對其他的甜味劑較低,因此需要更為靈敏的檢測方法。愛德萬甜、根皮苷、柚皮苷二氫查耳酮、三葉苷、新橙皮苷二氫查耳酮和根皮素均為酚類物質(zhì),容易被氧化,而電化學(xué)檢測器(ECD)靈敏度極高,可達fmol水平,且該檢測器對容易被氧化的物質(zhì)有著特異的選擇性,其在藥品和食品質(zhì)量控制方面發(fā)揮著重要的作用[19-20]。目前并沒有同時測定上述6種甜味劑的文獻報道,本工作提出了超高效液相色譜-電化學(xué)檢測法(UHPLC-ECD)測定愛德萬甜和5種二氫查耳酮類甜味劑含量的方法。一方面,利用超高效液相色譜可以縮短分離時間,提高分析效率;另一方面,利用ECD 的高靈敏性,可降低檢出限,為飲料中甜味劑的快速測定提供參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

U3000型超高效液相色譜儀,配有3000 RS型ECD、3400RS型二極管陣列檢測器(DAD)及變色龍7.1工作站;Legend Micro 17臺式微型離心機;Purelab Chorus型超純水系統(tǒng);BSA124S-CW 型分析天平。

單對照品儲備溶液:精密稱取根皮苷、柚皮苷二氫查耳酮、三葉苷、新橙皮苷二氫查耳酮、愛德萬甜、根皮素標準品適量,加甲醇溶解,并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,用甲醇定容,配制成根皮苷、柚皮苷二氫查耳酮、三葉苷、新橙皮苷二氫查耳酮、根皮素質(zhì)量濃度均為2.500 g·L－1,愛德萬甜質(zhì)量濃度為1.000 g·L－1的單對照品儲備溶液,于4 ℃冰箱冷藏備用。

混合對照品溶液:移取適量的單對照品儲備溶液置于10 mL 容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,配制成根皮苷、柚皮苷二氫查耳酮、三葉苷、新橙皮苷二氫查耳酮、根皮素質(zhì)量濃度均為250.0 mg·L－1,愛德萬甜質(zhì)量濃度為125.0 mg·L－1的混合對照品溶液。

混合對照品溶液系列:移取0.02,0.04,0.10,0.20,0.40,1.00,2.00 mL 混合對 照品溶 液置于50 mL容量瓶中,加50%(體積分數(shù))甲醇溶液稀釋至刻度,配制成根皮苷、柚皮苷二氫查耳酮、三葉苷、新橙皮苷二氫查耳酮、根皮素質(zhì)量濃度均為0.100,0.200,0.500,1.000,2.000,5.000,10.00 mg·L－1,愛德萬甜質(zhì)量濃度為0.050,0.100,0.250,0.500,1.000,2.500,5.000 mg·L－1的混合對照品溶液系列。

根皮苷、柚皮苷二氫查耳酮、新橙皮苷二氫查耳酮、根皮素、三葉苷等標準品的純度均不小于98%;愛德萬甜標準品的純度不小于97.0%;甲醇、乙腈、乙酸銨均為色譜純;檸檬酸鉀水合物、檸檬酸均為分析純;試驗用水為超純水,由Purelab Chorus型超純水系統(tǒng)制備;樣品為市售飲料。

1.2 儀器工作條件

Waters ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm);柱溫40 ℃;流動相為體積比22.5∶77.5的乙腈-50 mmol·L－1檸檬酸鹽緩沖液(pH 2.75)的混合液,等度洗脫;流量0.4 mL·min－1;進樣量2μL;自動進樣器溫度5 ℃;ECD,檢測池電壓650 mV。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品溶液的配制

稱取10 g飲料樣品,加水稀釋并定容至50 mL容量瓶中,混合均勻,取少量混合液以轉(zhuǎn)速10 000 r·min－1離心10 min,上清液經(jīng)0.22μm 濾膜過濾后進樣分析。

1.3.2 混合加標樣品溶液的配制

稱取10 g空白飲料,加入一定量的混合對照品溶液,加水稀釋并定容至50 mL 容量瓶中,混合均勻,配制成低、中、高等3個濃度水平的混合加標樣品溶液,其中根皮苷、柚皮苷二氫查耳酮、三葉苷、新橙皮苷二氫查耳酮、根皮素加標濃度水平均為0.200,1.000,8.000 mg·L－1,愛德萬甜加標濃度水平為0.100,0.500,4.000 mg·L－1。取少量混合加標樣品溶液以轉(zhuǎn)速10 000 r·min－1離心10 min,上清液經(jīng)0.22μm 濾膜過濾后進樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

在優(yōu)化的試驗條件下,混合對照品溶液和混合加標樣品溶液(根皮苷、柚皮苷二氫查耳酮、三葉苷、新橙皮苷二氫查耳酮、根皮素的質(zhì)量濃度為1.000 mg· L－1,愛德萬甜的質(zhì)量濃度為0.500 mg·L－1)的色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品溶液和混合加標樣品溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of the mixed reference solution and the mixed spiked sample solution

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 檢測池電壓

將檢測池電壓設(shè)為50～700 mV,逐步升高,將同一混合對照品溶液在不同的電壓條件下重復(fù)進樣,記錄各目標物在不同檢測池電壓條件下的峰面積。以各目標物的峰面積隨檢測池電壓的變化做曲線圖,見圖2。

圖2 目標物的峰面積隨檢測池電壓的變化曲線Fig.2 Curves showing changes of peak area of target with detection cell voltage

結(jié)果表明:檢測池電壓不大于250 mV 時,各甜味劑氧化均不明顯;檢測池電壓大于250 mV 時,二氫查耳酮類甜味劑隨著檢測池電壓的升高逐漸氧化,故選擇650 mV 為二氫查耳酮類甜味劑的檢測池電壓;當檢測池電壓為250～350 mV 時,愛德萬甜迅速氧化,繼續(xù)升高檢測池電壓,愛德萬甜氧化逐漸降低,但降低不明顯。為兼顧二氫查耳酮類甜味劑,試驗選擇650 mV 為檢測池電壓。

2.2.2 流動相

在使用ECD 時,流動相中離子濃度需要大于20 mmol·L－1,以保護ECD 的電極。因此,試驗考察了以乙腈-50 mmol·L－1乙酸鹽緩沖液、乙腈-50 mmol·L－1檸檬酸鹽緩沖液作為流動相時的分離效果。結(jié)果表明:以乙酸鹽作為流動相添加劑時,愛德萬甜及5種二氫查耳酮類甜味劑峰形較差;改用檸檬酸鹽后,愛德萬甜及5種二氫查耳酮類甜味劑的拖尾得到改善,分離度也較好;添加冰乙酸調(diào)節(jié)酸度,當檸檬酸鹽緩沖液的pH 為2.75,乙腈-50 mmol·L－1檸檬酸鹽緩沖液的體積比為22.5∶77.5時,愛德萬甜及5種二氫查耳酮類甜味劑峰形對稱、分離度好,根皮苷、柚皮苷二氫查耳酮、三葉苷、新橙皮苷二氫查耳酮、愛德萬甜和根皮素的出峰時間分別為2.2,2.7,3.1,3.9,6.8,8.0 min。因此,試驗選擇體積比22.5∶77.5的乙腈-50 mmol·L－1檸檬酸鹽緩沖液(pH 2.75)的混合液為流動相。

2.3 標準曲線、檢出限和測定下限

按照儀器工作條件測定混合對照品溶液系列,記錄各目標物的峰面積。以目標物的質(zhì)量濃度為橫坐標,對應(yīng)的峰面積為縱坐標,繪制標準曲線。所得各目標物的線性參數(shù)見表1。

以3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比計算方法的檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N),結(jié)果見表1。

表1 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.1 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.4 精密度和回收試驗

按照1.3.2節(jié)試驗方法制備低、中、高等3個濃度水平的混合加標樣品溶液,分別制備6 份,按照1.2節(jié)儀器工作條件進樣分析,計算6 種化合物的回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結(jié)果見表2。

由表2可知,6種化合物的回收率為97.1%～105%,RSD 為1.4%～5.1%,表明所建立的分析方法的精密度和準確度均滿足檢測要求。

表2 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.5 穩(wěn)定性試驗

按照1.3.2 節(jié)試驗方法制備混合加標樣品溶液,分別在自動進樣器(自動進樣器溫度5 ℃)中放置0,4,8,12,16,20,24 h后按照1.2節(jié)儀器工作條件進樣分析。結(jié)果表明,測得24 h內(nèi)混合加標樣品溶液中根皮苷、柚皮苷二氫查耳酮、三葉苷、新橙皮苷二氫查耳酮、愛德萬甜、根皮素峰面積的RSD(n＝7)分別為1.4%,1.8%,1.6%,1.9%,1.4%,1.6%,說明混合加標樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.6 重復(fù)性試驗

按照1.3.2節(jié)試驗方法制備混合加標樣品溶液6份,并按照1.2節(jié)儀器工作條件進樣分析,記錄色譜峰峰面積并計算其RSD。結(jié)果表明,測得根皮苷、柚皮苷二氫查耳酮、三葉苷、新橙皮苷二氫查耳酮、愛德萬甜、根皮素峰面積的RSD(n＝6)分別為1.1%,1.2%,1.4%,1.0%,1.1%,1.7%,說明方法的重復(fù)性良好。

2.7 方法比對

2.7.1 ECD 與DAD 的比較

采用DAD 全波長掃描模式,在波長190～400 nm 內(nèi)對6種化合物進行紫外掃描,根皮苷、柚皮苷二氫查耳酮、三葉苷、新橙皮苷二氫查耳酮、根皮素在280 nm 附近有特異性紫外吸收峰,故選擇280 nm 為5種二氫查耳酮類甜味劑的檢測波長;愛德萬甜最大吸收波長為230,280 nm,考慮到低波長下較多物質(zhì)均有吸收,可能干擾目標物的測定,故選擇280 nm 作為愛德萬甜的檢測波長。

因此,當色譜柱、流動相、進樣體積、柱溫等色譜條件一致時,設(shè)置DAD 的檢測波長為280 nm,ECD的檢測池電壓為650 mV,對同一低濃度水平的混合加標樣品溶液進行檢測。采用ECD 進行檢測時,6種化合物均可檢出,如圖3(a)所示;采用DAD 進行檢測時,根皮苷、柚皮苷二氫查耳酮、三葉苷、新橙皮苷二氫查耳酮可檢出,但信噪比較低,愛德萬甜、根皮素的信號響應(yīng)值均低于儀器檢出限,無法檢出,如圖3(b)所示。上述結(jié)果表明,采用ECD 檢測飲料中的根皮苷、柚皮苷二氫查耳酮、三葉苷、新橙皮苷二氫查耳酮、愛德萬甜、根皮素,靈敏度高,具有明顯的優(yōu)勢。

圖3 ECD與DAD檢測同一混合加標樣品中6種化合物的色譜比較Fig.3 Comparison of chromatograms of the 6 compounds in the same mixed spiked sample detected with ECD and DAD

按照1.3.2 節(jié)試驗方法制備混合加標樣品溶液,共制備4個濃度水平,每個濃度水平平行制備3份。當色譜柱、流動相、進樣體積、柱溫等色譜條件一致時,分別采用ECD(檢測池電壓650 mV)和DAD(檢測波長280 nm)對上述混合加標樣品溶液進行測定,采用軟件Origin 8對所得的各目標物的測定值進行獨立樣本t檢驗,結(jié)果如表3所示。

由表3可知:使用DAD檢測時,當各目標物質(zhì)量濃度為0.050 mg·L－1時,無法準確定量,均低于檢出限,當各目標物質(zhì)量濃度為0.100 mg·L－1時,DAD可對根皮苷、柚皮苷二氫查耳酮、三葉苷、新橙皮苷二氫查耳酮進行準確定量,而對根皮素依然不能準確定量;使用ECD 檢測時,4 個濃度水平下,6種目標物均可準確定量。說明使用ECD 檢測時,靈敏度高、檢出限低,優(yōu)勢明顯。獨立樣本t檢驗顯示,在0.100,0.500,1.000,4.000,8.000 mg·L－1濃度水平下P值均大于0.05,表明使用ECD 和DAD檢測飲料中根皮苷、柚皮苷二氫查耳酮、三葉苷、新橙皮苷二氫查耳酮、愛德萬甜、根皮素時,方法均無顯著性差異。

表3 ECD和DAD測定結(jié)果比較Tab.3 Comparison of determined results with ECD and DAD

2.7.2 同文獻方法的比較

由于試驗所測甜味劑中愛德萬甜的甜度最高,對檢測方法的靈敏度要求最高,因此將本方法(UHPLC-ECD)同文獻中愛德萬甜的檢測方法進行了比較。目前已公開的檢測方法中,超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)的檢出限為2.0～6μg·kg－1,HPLC-DAD 的檢出限為100,600μg·kg－1,本方法的檢出限為19μg·kg－1,具體見表4。

表4 數(shù)據(jù)表明,本方法的靈敏度略低于UHPLC-MS/MS,但高于HPLC-DAD;本方法檢測成本遠低于UHPLC-MS/MS,分析時間相較于HPLC-DAD 大大縮短。

表4 本方法同其他方法的比較Tab.4 Comparison of this method with other methods

2.8 樣品分析

采用試驗方法對市售的10個飲料樣品進行前處理,并按儀器工作條件對愛德萬甜及5種二氫查耳酮類甜味劑的含量進行測定,結(jié)果表明,10個飲料樣品均未檢出上述化合物。

本工作采用UHPLC-ECD 同時測定飲料中愛德萬甜和5種二氫查耳酮類甜味劑的含量,在提高靈敏度、降低成本的同時,大大縮短了分析時間。該方法操作簡單,色譜分離效果和穩(wěn)定性好,并可獲得較高的精密度和準確度,適合大批量樣品的快速測定,同時可為其他食品的快速測定提供參考。