QuEChERS凈化-柱前衍生-高效液相色譜法測(cè)定煙葉中抗蚜威的殘留量

王煥琦 ,聶四平 ,黃家?guī)X ,王正強(qiáng)

(1.貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院,貴陽(yáng) 550016;2.貴州醫(yī)科大學(xué),貴陽(yáng) 550025)

抗蚜威是以甲酸酯為前體化合物合成得到的一種農(nóng)藥[1],結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 抗蚜威的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of pirimicarb

滅蟲原理是抑制乙酰膽堿酯酶在昆蟲體內(nèi)的活性,從而降低昆蟲的神經(jīng)傳導(dǎo)功能。它是一種神經(jīng)內(nèi)毒素,有一定的遺傳毒性和細(xì)胞毒性[2-3],廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn),具有滅蟲效果明顯、選擇性高和殘留期短等特點(diǎn),但是若大量使用而不加以控制,其殘留物則會(huì)轉(zhuǎn)移到食品中,造成人和動(dòng)物的中毒,從而危害人類健康,造成環(huán)境污染[4-5]。因此,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763－2019?食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量?對(duì)不同蔬菜中抗蚜威農(nóng)藥的限量有相應(yīng)的規(guī)定。

目前我國(guó)關(guān)于抗蚜威農(nóng)藥殘留量的測(cè)定方法主要有氣相色譜法[6]、氣相色譜-質(zhì)譜法[7]、高效液相色譜-質(zhì)譜法[8-10]、柱后衍生-附熒光檢測(cè)器的高效液相色譜法[11]、超臨界流體色譜法[12]。其中,液相色譜-質(zhì)譜儀和氣相色譜-質(zhì)譜儀價(jià)格昂貴,成本過高,不適合在各級(jí)地方實(shí)驗(yàn)室普及;氣相色譜法需要在高溫高壓的條件下將目標(biāo)物氣化,再進(jìn)入色譜柱進(jìn)行分離,而抗蚜威農(nóng)藥有一定的熱不穩(wěn)定性,在高溫堿性條件下會(huì)分解,因此氣相色譜法也有一定的局限性。目前主流的檢測(cè)方法和我國(guó)現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 23200.112－2018?食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 植物源性食品中9種氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測(cè)定 液相色譜-柱后衍生法?針對(duì)植物源性食品中9種氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝物殘留的測(cè)定采用的都是液相色譜-柱后衍生化法,但是柱后衍生化法在從色譜柱到檢測(cè)器的過程中還增加了衍生器,待測(cè)物需要通過漫長(zhǎng)的通路才會(huì)進(jìn)入熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè),會(huì)導(dǎo)致儀器死體積過大、樣品擴(kuò)散,進(jìn)而使色譜峰容易變寬、峰形變差,影響對(duì)目標(biāo)物的定性和定量。并且,為保證衍生反應(yīng)徹底以及定量結(jié)果的準(zhǔn)確度,柱后衍生一般需要衍生試劑大量過載,因此還存在衍生試劑浪費(fèi)的情況。目前常用的前處理方法有固相萃取法、液液萃取法、凝膠滲透色譜法和固相微萃取法等,這些前處理方法和QuEChERS 方法[13-18]相比,存在前處理效率低、耗時(shí)、成本過高的問題。

目前QuEChERS凈化-柱前衍生結(jié)合高效液相色譜法測(cè)定煙葉中抗蚜威農(nóng)藥殘留量的方法還未見報(bào)道,本工作著眼于此點(diǎn)進(jìn)行研究。使用柱前衍生法替代以往普遍使用的柱后衍生法,待測(cè)物的極性降低,可以使用普通的非極性C18色譜柱進(jìn)行分離,大大降低了成本,并且結(jié)合Qu ECh ERS前處理,降低了難度,縮短了時(shí)間,大大提高了工作效率。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260II型高效液相色譜儀,配熒光檢測(cè)器;Milli-Q academic型超純水系統(tǒng);FSH-II型高速電動(dòng)勻漿器;TECHNE 型氮吹儀;HZQ/THZ型振蕩器;AE100型電子分析天平。

0.05mol·L－1硼酸鈉溶液:稱取19.1 g十水合硼酸鈉,完全溶解于1 L水中。

0.05mol·L－1氫氧化鈉溶液:稱取片狀氫氧化鈉1 g,用水溶解后轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中,定容,混合均勻,用0.45μm 濾膜過濾并脫氣,濾液儲(chǔ)存于棕色瓶中。

鄰苯二甲醛(OPA)/2-巰基乙醇溶液:取50 mg OPA 于5 mL 甲醇中,緩慢旋轉(zhuǎn)使其完全溶解后,轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中,用0.05 mol·L－1硼酸鈉溶液稀釋至刻度,混合均勻,用0.45μm 濾膜過濾并脫氣。然后,加入0.5 mL 2-巰基乙醇,緩慢旋轉(zhuǎn)直至混合均勻。一旦2-巰基乙醇加入后,切勿再將溶液脫氣,將此溶液置于密閉的棕色玻璃瓶中,用鋁箔包裹避光保存。

酸化水溶液(pH 3):用鹽酸將500 mL 水酸化至pH 3,并用已校正的pH 計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

抗蚜威標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:100 mg·L－1,準(zhǔn)確移取1 000 mg·L－1抗蚜威標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL 置于10 mL容量瓶中,用乙腈定容,配制成質(zhì)量濃度為100 mg·L－1的抗蚜威標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

抗蚜威標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:分別移取100 mg·L－1的抗蚜威標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液10,100,200,500,1 000μL置于5支100 mL容量瓶中,用酸化水溶液(pH 3)稀釋至刻度,混勻,配制成質(zhì)量濃度為0.01,0.10,0.20,0.50,1.00 mg·L－1的抗蚜威標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。儲(chǔ)存于棕色玻璃瓶中,充氮?dú)?除濕隔絕空氣,于冷凍裝置中密閉保存,此溶液至少穩(wěn)定3個(gè)月。

抗蚜威標(biāo)準(zhǔn)溶液,質(zhì)量濃度為1 000 mg·L－1;N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳黑(GCB)、十八烷基鍵合硅膠(C18)固相吸附劑;OPA 的純度不小于97%;2-巰基乙醇的純度不小于98%;甲醇、乙腈均為色譜純;片狀氫氧化鈉、氯化鈉、無水硫酸鎂(MgSO4)、十水合硼酸鈉和鹽酸均為分析純;試驗(yàn)用水為超純水(電阻率為18.2 MΩ·cm)。

樣品來自市售煙葉。

1.2 儀器工作條件

EXTEND-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);柱溫30 ℃;進(jìn)樣體積400 μL;流量1.0 mL·min－1;熒光檢測(cè)器,激發(fā)波長(zhǎng)339 nm,發(fā)射波長(zhǎng)445 nm;增益10;流動(dòng)相A 為水,B為甲醇,C 為乙腈;梯度洗 脫程序:0～5.3 min 時(shí),A 為88%,B 為12%,C 為0;5.3～14.0 min 時(shí),A 由88%降 至68%,B 由12%升 至16%,C 由0 升至16%;14.0～18.0 min時(shí),A 由68%降至50%,B由16%升至25%,C 由16%升至25%,保持2.0 min;20.0～30.0 min時(shí),A 由50%升至88%,B 由25%降至12%,C由25%降至0。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品提取

稱取10.00 g均質(zhì)完畢的煙葉樣品置于50 mL離心管中,加入含1%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙酸的乙腈溶液10 mL和2～3 g氯化鈉后,振蕩提取10 min,以轉(zhuǎn)速9 500 r·min－1離心5 min。

1.3.2 Qu ECh ERS凈 化

取上清液5 mL置于預(yù)先加有200 mg PSA 和900 mg MgSO4的離心管中,渦旋提取15 s,以轉(zhuǎn)速9 500 r·min－1離心5 min,取上層提取液2.0 mL置于試管中,于35 ℃氮吹至近干。

1.3.3 柱前衍生

取1.3.2 節(jié)中試管,加入酸化水溶液(pH 3)500 μL、OPA/2-巰基乙 醇溶液 250 μL 和0.05 mol·L－1氫氧化鈉溶液250μL,渦旋1 min溶解,經(jīng)0.2μm 微孔膜過濾于進(jìn)樣小瓶中,用酸化水溶液(pH 3)定容至1 mL,于80 ℃水浴避光加熱30 min,衍生完成,按照儀器工作條件測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

氨基甲酸酯類農(nóng)藥沒有特征光譜吸收基團(tuán),在堿性條件下可以與OPA/2-巰基乙醇溶液反應(yīng)生成具有強(qiáng)熒光吸收的異氮(雜)茚基衍生物,進(jìn)而降低待測(cè)物的極性,增大離子的電離效率,改善色譜分離度,提高檢測(cè)器響應(yīng)[19]。由于待測(cè)物的極性降低,可以使用普通的非極性C18色譜柱進(jìn)行色譜分離,試驗(yàn)考察了BEH-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)、T3 色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)和EXTEND-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)對(duì)目標(biāo)物分離效果的影響。結(jié)果表明:使用T3色譜柱分離后,抗蚜威色譜峰存在拖尾,峰形較差;與BEH-C18色譜柱相比,使用EXTEND-C18色譜柱分離后,抗蚜威色譜峰尖銳、對(duì)稱,分離效果更好。因此,試驗(yàn)選擇EXTEND-C18色譜柱進(jìn)行色譜分離。在所選定的儀器工作條件下,抗蚜威標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白煙葉基質(zhì)的色譜圖見圖2。

圖2 典型色譜圖Fig.2 Typical chromatograms

2.2 提取溶劑的選擇

目前果蔬中農(nóng)藥的提取多是采用甲醇、乙腈或是酸性的甲醇溶液和乙腈溶液。試驗(yàn)以煙葉為空白基質(zhì),加標(biāo)量為1 mg·kg－1,分別考察了提取溶劑乙腈、甲醇、含1%乙酸的甲醇溶液、含1%乙酸的乙腈溶液的提取效果。結(jié)果表明:甲醇和含1%乙酸的甲醇溶液的提取效率不如乙腈和含1%乙酸的乙腈溶液的效果好,根據(jù)試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)分析,相較于乙腈,甲醇與水的互溶性更強(qiáng),有相當(dāng)大一部分水殘留在有機(jī)相中,增大了共提取物的含量,即使在后續(xù)處理中加入鹽(氯化鈉),其分層效果也不如乙腈,甚至無法分層,而鹽的加入能夠使乙腈有機(jī)相和水相明顯分離;含1%乙酸的乙腈溶液比乙腈的提取效果略好,是因?yàn)樗峄囊译嫒芤盒纬闪巳跛嵝缘木彌_提取溶劑體系,能夠一定程度地提高回收率,氨基甲酸酯類農(nóng)藥的平均回收率達(dá)到92.8%。因此,試驗(yàn)以含1%乙酸的乙腈溶液為提取溶劑。

2.3 QuECh ERS方法的優(yōu)化

目前QuEChERS中用到的吸附劑填料主要有PSA、C18、GCB 和MgSO4。PSA 可通過弱陰離子交換、極性相互作用,吸附極性強(qiáng)的脂肪酸類和酚類干擾物;而C18則相反,通過非極性相互作用,吸附極性較弱的色素、維生素E、油脂、烯烴類、甾類干擾物;GCB主要用于吸附樣品中的色素;MgSO4主要用于吸附樣品中的水分。試驗(yàn)選取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 mg·kg－1的加標(biāo)煙葉樣品為研究對(duì)象,按照1.3節(jié)中所述的前處理方法提取和衍生,考察了在4種吸附劑組合(分別為Ⅰ.PSA 200 mg＋MgSO4900 mg;Ⅱ.GCB 15 mg＋PSA 200 mg＋MgSO4900 mg;Ⅲ.PSA 150 mg＋C1850 mg＋MgSO4900 mg;Ⅳ.GCB 15 mg＋PSA 150 mg＋C1850 mg＋MgSO4900 mg)凈化下加標(biāo)煙葉樣品中抗蚜威的回收率,結(jié)果見圖3。

圖3 在4種吸附劑組合凈化下加標(biāo)煙葉樣品中抗蚜威的回收率Fig.3 Recovery of pirimicarb in the spiked sample of tobacco leaf purified with 4 adsorbent combinations

結(jié)果表明:在吸附劑組合I凈化下,加標(biāo)煙葉樣品中抗蚜威的回收率最高,這是因?yàn)镚CB對(duì)抗蚜威農(nóng)藥有一定的吸附作用;雖然C18在日常檢測(cè)中主要用于吸附脂類物質(zhì),但煙葉中脂類物質(zhì)較少,導(dǎo)致C18對(duì)抗蚜威農(nóng)藥產(chǎn)生了吸附,回收率降低。在吸附劑組合Ⅳ凈化下,加標(biāo)煙葉樣品中抗蚜威的回收率最低,是GCB和C18共同對(duì)氨基甲酸酯類農(nóng)藥的吸附而導(dǎo)致的結(jié)果,與文獻(xiàn)[20]研究結(jié)果一致。因此,試驗(yàn)優(yōu)選組合Ⅰ作為凈化吸附劑。

2.4 衍生條件的選擇

2.4.1 0.05 mol·L－1氫氧化鈉溶液的添加量

在不加氫氧化鈉溶液時(shí),衍生反應(yīng)無法發(fā)生。固定衍生反應(yīng)時(shí)間、溫度和衍生試劑添加量,試驗(yàn)采用0.05 mol·L－1氫氧化鈉溶液作為水解試劑,考察了其添加量(50,100,150,200,250,300μL)對(duì)抗蚜威回收率的影響,結(jié)果見圖4。

圖4 氫氧化鈉溶液添加量對(duì)抗蚜威回收率的影響Fig.4 Effect of addition amount of sodium hydroxide solution on recovery of pirimicarb

由圖4可知:當(dāng)0.05 mol·L－1氫氧化鈉溶液添加量達(dá)到200μL時(shí),抗蚜威回收率接近最大,衍生效果接近最大;當(dāng)0.05 mol·L－1氫氧化鈉溶液添加量達(dá)到250μL時(shí),抗蚜威回收率穩(wěn)定;繼續(xù)增大0.05 mol·L－1氫氧化鈉溶液添加量,抗蚜威回收率不再改變。綜合考慮,試驗(yàn)優(yōu) 選250 μL 為0.05 mol·L－1氫氧化鈉溶液的添加量。

2.4.2 OPA/2-巰基乙醇溶液的添加量

由于抗蚜威不具備典型的熒光和紫外吸收基團(tuán),因此需要進(jìn)行衍生化反應(yīng)使之具有熒光吸收的特征檢驗(yàn)基團(tuán),方能在熒光檢測(cè)器上有特征響應(yīng)。固定衍生反應(yīng)時(shí)間、溫度和0.05 mol·L－1氫氧化鈉溶液添加量,選用OPA/2-巰基乙醇溶液為衍生試劑,按照1.1節(jié)中所述方法配制,試驗(yàn)考察了不同衍生試劑添加量(50,100,150,200,250,300μL)的衍生效果,對(duì)比衍生后待測(cè)物的峰面積,計(jì)算抗蚜威的回收率,結(jié)果見圖5。

圖5 OPA/2-巰基乙醇溶液添加量對(duì)抗蚜威回收率的影響Fig.5 Effect of addition amount of OPA/2-mercaptoethanol solution on recovery of pirimicarb

結(jié)果表明,OPA/2-巰基乙醇溶液添加量達(dá)到200μL 時(shí),目標(biāo)物衍生效果較好,抗蚜威回收率達(dá)到穩(wěn)定。衍生化反應(yīng)一般需要衍生試劑過量才能夠保證衍生反應(yīng)完全,試驗(yàn)為保證衍生化反應(yīng)充分,遵循定量準(zhǔn)確和節(jié)約試劑用量的原則,最終選擇250μL為OPA/2-巰基乙醇溶液的添加量。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限

按照儀器工作條件測(cè)定抗蚜威標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以抗蚜威的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的衍生物峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,抗蚜威標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0.01～1.00 mg·L－1,線性回歸方程為y＝1.174×102x－2.430×10－1,相關(guān)系數(shù)為0.999 8。

以3倍信噪比(S/N)確定檢出限(3S/N),以10倍信噪比確定測(cè)定下限(10S/N),結(jié)果得出檢出限為0.01 mg·kg－1,測(cè)定下限為0.05 mg·kg－1。

2.6 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對(duì)陰性煙葉樣品進(jìn)行0.05,0.25,0.50 mg·kg－1等3個(gè)濃度水平(按照試驗(yàn)方法處理后,加標(biāo)量相當(dāng)于0.01,0.50,1.00 mg·L－1)的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)加標(biāo)樣品平行測(cè)定6次,并計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表1。

表1 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表1可知,回收率為84.4%～85.5%,測(cè)定值的RSD 為1.4%～2.4%,表明該方法的精密度和重現(xiàn)性良好,可以滿足GB/T 27404－2008?實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)?中有關(guān)多殘留測(cè)定的要求。

2.7 樣品分析

從貴陽(yáng)市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)隨機(jī)購(gòu)買30份煙葉樣品,按照1.3 節(jié)試驗(yàn)方法前處理,1.2 節(jié)儀器工作條件測(cè)定,結(jié)果顯示,有6 份煙葉樣品檢出抗蚜威,其余24份煙葉樣品均未檢出,檢出率為20%,其中最高檢出量為0.06 mg·kg－1。

本工作提出了QuEChERS凈化-柱前衍生法結(jié)合高效液相色譜法測(cè)定煙葉中抗蚜威殘留量的方法,相較于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法,能夠避免柱后衍生儀的使用,大大降低試驗(yàn)成本,簡(jiǎn)化了前處理步驟。該方法重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高、線性關(guān)系良好,可滿足煙葉中抗蚜威的快速測(cè)定。