一次平衡法和二次平衡法在測定七氟烷代謝產(chǎn)物六氟異丙醇中的聯(lián)合應(yīng)用

林芷萱，楊小霖

(川北醫(yī)學(xué)院，1.麻醉學(xué)系；2.第二附屬醫(yī)院麻醉科，四川 南充 637000)

目前，氣相色譜儀常用于測定氣相和液相中的揮發(fā)性吸入麻醉藥濃度。氣相色譜法(gas chromatography，GC)具有效能高、相對靈敏、選擇性強、快速、穩(wěn)定、重復(fù)性好等特點。七氟烷因具有誘導(dǎo)快、對呼吸和循環(huán)影響小、蘇醒迅速等優(yōu)點廣泛應(yīng)用于臨床。七氟烷進入體內(nèi)后絕大部分以原型經(jīng)呼吸道排出，僅約5%在肝臟內(nèi)代謝[1]，在細胞色素P450酶系作用下轉(zhuǎn)化生成無機氟離子及六氟異丙醇(hexafluoro-isopropanol，HFIP)[2-4]。國外研究[5]報道，吸入七氟烷麻醉后所生成的游離HFIP濃度不足血中七氟烷濃度的1%。有研究[6]表明，HFIP在SD大鼠的最低肺泡有效濃度極低(0.004 4%)，說明HFIP具有很強的潛在麻醉作用，且可能協(xié)同影響七氟烷的麻醉強度。由于HFIP的血/氣分配系數(shù)極大，體內(nèi)排出緩慢，可能導(dǎo)致患者蘇醒延遲或蘇醒期躁動的發(fā)生。但大鼠吸入一定濃度的七氟烷麻醉后血中游離HFIP的生成規(guī)律尚不清楚。本小組前期研究[7-8]中發(fā)現(xiàn)，由于HFIP具有極大的血/氣分配系數(shù)(B/G)，若常規(guī)使用頂空二次平衡法測定其濃度，則在第二次平衡完成時，要從氣相中測出HFIP的濃度則極為困難且偏差較大。本研究旨在探討聯(lián)合應(yīng)用一次平衡法和二次平衡法準確測定大鼠吸入七氟烷麻醉后血中HFIP含量的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品及儀器

液態(tài)七氟烷：120 mL/瓶(上海恒瑞醫(yī)藥有限公司)；液態(tài)HFIP：10 mL/瓶(美國Sigma Aldrich公司)；肝素鈉注射液：2 mL∶12 500單位/支(馬鞍山豐原制藥有限公司)；0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司)。Agilent Technologies氣相色譜儀(GC7890A)；Ugo動物麻醉機(Ugo Basile，意大利)；七氟烷專用蒸發(fā)器(Vaor2000，德國)；SPH-300A氫氣發(fā)生器(北京中惠普)等。氣相色譜儀測定條件：色譜柱(Agilent19091J-413)：325 ℃，30.00 m×320.00 μM×0.25 μM，柱箱溫度45 ℃，氫離子火焰檢測器溫度200 ℃，后進樣口溫度100 ℃，氫氣流速30 mL/min，空氣流速400 mL/min，氮氣流速20 mL/min。

1.2 方法

1.2.1 待測氣體標(biāo)準曲線的制備 在上述氣相色譜測定條件下，采用倍比稀釋法利用已知濃度的七氟烷(或HFIP) 標(biāo)準氣制備色譜峰面積-麻醉藥物濃度的標(biāo)準曲線[9]，并得出相應(yīng)的線性回歸方程(y=mx+b)及相關(guān)系數(shù)(r)，其中x為麻醉藥濃度(%)，y為峰面積，相關(guān)系數(shù)r應(yīng)達到>0.999。需要注意的是，當(dāng)日待測氣體濃度范圍要包含在該標(biāo)準曲線建立的范圍之內(nèi)，即建立的標(biāo)準曲線方程中x的范圍應(yīng)覆蓋所有待測氣體濃度。

1.2.2 實驗大鼠的麻醉處理 將室溫控制在25 ℃，從預(yù)定的42只健康成年SD大鼠中隨機選取6只，采用水合氯醛腹腔注射麻醉后，隨即腹主動脈取血5～7 mL轉(zhuǎn)移至帶有三通的氣密性良好的注射器內(nèi)，用于測量SD大鼠標(biāo)準品HFIP的血/氣分配系數(shù)[10]。余下36只大鼠，用隨機數(shù)字表法分成6組，每組各6只，分別接受1 MAC(2.32%)濃度的七氟烷麻醉[11]，麻醉時間分別為0.5 h(S1組)、1.0 h(S2組)、1.5 h(S3組)、2.0 h(S4組)、3.0 h(S5組)和4.0 h(S6組)。麻醉開始時將麻醉裝置氧流量調(diào)至2 L/min，利用氣相色譜儀校正七氟烷揮發(fā)罐濃度，確保揮發(fā)罐實際輸出的七氟烷濃度接近設(shè)定值。隨后向自制大鼠麻醉裝置預(yù)充七氟烷(時間≥5 min)，將其中一組大鼠放入麻醉框中開始計時。當(dāng)吸入麻醉達設(shè)定時間后，在盡可能使得大鼠不脫離原七氟烷麻醉環(huán)境條件下，迅速開腹從腹主動脈取血5～7 mL，轉(zhuǎn)移至帶有三通的密閉注射器，置于恒溫箱內(nèi)，進行平衡處理。其余各組均按上述要求完成麻醉并取樣。

1.2.3 樣本中七氟烷及HFIP濃度測定 首先應(yīng)用注射器頂空二次平衡法完成HFIP樣品血/氣分配系數(shù)的測定[9，12-14]。用上述裝有未經(jīng)七氟烷麻醉的大鼠血液樣本的6支注射器分別吸取6 mL當(dāng)日所配制的較高濃度的HFIP標(biāo)準氣，吸空氣至18 mL刻度處并關(guān)閉三通，放入37 ℃恒溫箱內(nèi)進行空氣浴。每15 min取出震蕩20次，然后重新置于恒溫箱內(nèi)，如此反復(fù)至1.5 h時，取出注射器，抽吸空氣至20 mL刻度處后繼續(xù)于恒溫箱中進行重新平衡1.0 h，總平衡時間為2.5 h。此時HFIP在液相及氣相中達第一次平衡，采用頂空法用氣相色譜儀測出此時注射器內(nèi)氣相中HFIP的濃度，記為C1。排出注射器內(nèi)全部氣體及部分液體，使注射器內(nèi)剩余3 mL液體，隨即抽吸空氣至18 mL刻度處，關(guān)閉三通繼續(xù)上述平衡，步驟同第一次平衡。2.5 h后HFIP在氣、液相中達第二次平衡。用氣相色譜儀測定此時氣相中HFIP濃度，記為C2。由于第二次平衡結(jié)束后兩相中麻醉藥總量等于第二次平衡開始時的藥物量，得出以下公式：

C2×V2+CL2×VL2=CL1×VL2

(1)

其中C2為第二次平衡結(jié)束后用氣相色譜儀測得的氣相中吸入麻醉藥濃度(vol %，氣態(tài)容積百分比濃度)；V2和VL2分別為第二次平衡時注射器內(nèi)氣體和剩余液體的容積(mL)，CL1和CL2分別為第一次和第二次平衡結(jié)束時注射器內(nèi)液相中吸入麻醉藥濃度(vol%)。液/氣分配系數(shù)為達到平衡時液相中麻醉藥濃度與氣相中麻醉藥濃度的比值：

λ=CL1/C1或者λ=CL2/C2

(2)

公式中C1為第一次平衡結(jié)束時測得的氣相中HFIP濃度(vol%)。將公式(1)、(2)換算可推出：

λ=(V2/VL2)×C2/(C1-C2)

(3)

此公式即為二次平衡法測定HFIP血/氣分配系數(shù)λ的計算公式。

一次平衡法測定血中HFIP濃度：取上述裝有麻醉后血液樣本的注射器，抽空氣使注射器內(nèi)總體積達18 mL，關(guān)閉三通，將其放入37 ℃的恒溫箱內(nèi)進行一次平衡，步驟同上。2.5 h后測得此時注射器內(nèi)氣相中HFIP的濃度，記為C1。根據(jù)第一次平衡結(jié)束時兩相中麻醉藥總量守恒，可得出以下公式：

V0×C0= VG1×C1+V0×CL1

(4)

將公式(2)和公式(4)進行轉(zhuǎn)換，可推出待測液體中實際揮發(fā)性麻醉藥濃度：

C0= C1×(VG1/V0+λ)

(5)

其中V0表示被測液體的體積(mL)；C0表示被測液體中揮發(fā)性麻醉藥的濃度(vol%)；VG1、C1分別表示平衡結(jié)束時注射器內(nèi)氣體的體積和氣相中麻醉藥濃度；CL1表示平衡結(jié)束時液相中麻醉藥濃度(vol %)。λ引用前面測得的HFIP在SD大鼠體內(nèi)的血/氣分配系數(shù)進行計算。

二次平衡法測定血中七氟烷濃度：操作步驟與測定HFIP的血/氣分配系數(shù)時相同。當(dāng)達到一次平衡時，注射器內(nèi)七氟烷總量等于平衡最初待測血液中所含七氟烷的量，因此有：

VG1×C1+V0×CL1=V0×C0

(6)

結(jié)合公式(2)、(6)可得出待測血液中七氟烷濃度C0的計算公式為：

C0=VG1×C1/V0+C1×λ

(7)

由以上公式(3)、(7)即能得出待測樣本血液中七氟烷血/氣分配系數(shù)及其濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

本實驗測得37 ℃條件下，SD大鼠HFIP的血/氣分配系數(shù)為453.18±74.20。吸入1 MAC濃度七氟烷麻醉不同時間后各組大鼠血中均能測出游離HFIP及七氟烷。血中游離HFIP濃度隨著吸入麻醉時間延長其濃度呈先增高后降低趨勢，其峰值出現(xiàn)在吸入七氟烷麻醉后1.0 h。血中七氟烷濃度隨著吸入時間的延長逐漸增加，2.0 h后趨于平穩(wěn)。見表1及圖1。

表1 各時點血中游離HFIP及七氟烷濃度

3 討論

氣相色譜法現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于測定揮發(fā)性吸入麻醉藥在氣相和液相中的濃度。頂空法(Headspace)通過氣相色譜儀可測定液相中揮發(fā)性麻醉藥的液/氣分配系數(shù)(λ)，從而進一步得出液相中麻醉藥濃度[12]。液相中揮發(fā)性麻醉藥濃度的測定可使用一次平衡法和二次平衡法。一次平衡法需引用參考文獻中已有的分配系數(shù)進性計算。二次平衡法則可同時測出該種藥物的液/氣分配系數(shù)λ和濃度，減少了實驗的個體誤差，提高了測定結(jié)果的準確性，但二次平衡法較一次平衡法耗時更長[10，12-14]。

七氟烷吸入麻醉后，在體內(nèi)通過肝臟代謝生成的HFIP含量很低，且大部分與葡萄糖醛酸結(jié)合生成結(jié)合型HFIP，并通過腎臟排出，僅約15%的HFIP以游離型存在于血液中。由于HFIP本身具有麻醉作用，可能影響七氟烷的麻醉效應(yīng)[2，15]。本小組前期臨床試驗在37 ℃條件下測得人體HFIP的血/氣分配系數(shù)為452.25[16]，與本試驗測得的SD大鼠HFIP的血/氣分配系數(shù)極為相似(453.18)，可見動物及人體HFIP的血/氣分配系數(shù)均很大。血/氣分配系數(shù)是指在一定大氣壓和一定溫度條件下，吸入麻醉藥在液、氣兩相間運動達到平衡時的濃度比值。血/氣分配系數(shù)越大說明該藥物越容易溶解于血液中，在兩相中達到平衡所需時間越長，誘導(dǎo)和蘇醒越緩慢。因七氟烷麻醉生成的游離HFIP含量較低(<1%)，加之HFIP血/氣分配系數(shù)大，可推知血液樣本在注射器內(nèi)進行平衡時氣相中HFIP濃度很低，如果使用二次平衡法，在第二次平衡時血中含量極低的游離HFIP便不容易揮發(fā)出來，將對測定結(jié)果的準確性產(chǎn)生一定影響。因此，本實驗將一次平衡法及二次平衡法聯(lián)合應(yīng)用，先利用已知高濃度的標(biāo)準品HFIP氣體通過二次平衡法測得SD大鼠HFIP的血/氣分配系數(shù)，再使用一次平衡法并引用已測得的HFIP血/氣分配系數(shù)，從而推算出七氟烷麻醉后血中所生成的游離HFIP濃度，以減少實驗誤差。同時，由于七氟烷血/氣分配系數(shù)較小，平衡時易從液相中揮發(fā)出來，故可直接采用二次平衡法同時測得其分配系數(shù)及血中七氟烷濃度，而無需引用文獻中血/氣分配系數(shù)數(shù)據(jù)。本研究結(jié)果顯示，七氟烷麻醉后0.5 h，即能在血中監(jiān)測出游離HFIP，說明HFIP在體內(nèi)生成迅速，與Kharasch[1]報道相符。隨著吸入麻醉時間的延長，血中所生成的游離HFIP濃度增加，在吸入麻醉1.0 h后達峰值，隨后逐漸下降。Eger等[6]研究表明，SD大鼠HFIP的MAC值為0.004 4%。由于HFIP的血/氣分配系數(shù)很大，在體內(nèi)半衰期長(20.1±8.2 h)[15]，排出緩慢，由此可以推測七氟烷麻醉一定時間后，代謝所生成的游離HFIP可在體內(nèi)蓄積，并產(chǎn)生麻醉作用，由此可能影響七氟烷的MAC值。同時，本研究小組推知，臨床上七氟烷麻醉后較高的蘇醒期躁動發(fā)生率[17]可能與其代謝產(chǎn)物HFIP的影響有關(guān)。

本實驗將一次平衡法及二次平衡法結(jié)合起來，用于測定七氟烷麻醉后血中生成的游離HFIP濃度，解決了單獨使用二次平衡法在第二次平衡時無法測出血中極低HFIP含量的問題，為動物實驗及臨床試驗中測定HFIP含量提供了方法性參考，為七氟烷的代謝研究奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。該方法適用于樣本中藥物含量低，且血/氣分配系數(shù)較大的揮發(fā)性麻醉藥的濃度測定。