死谷芽孢桿菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對桃褐腐病的抑菌作用

徐玲娜，徐新月，董 錚

（山東省青島市即墨區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 青島 266200)

桃褐腐病是桃樹的重要病害之一[1]，病原菌屬子囊菌亞門鏈核盤菌[2]，危害桃樹的花、葉、枝梢及果實，其中果實受害最重[3]。果實成熟期發(fā)病率高，傳播快[4]，在田間即造成果實嚴重腐爛，經(jīng)濟損失較大。目前防治桃褐腐病主要方法是化學(xué)防治，易造成環(huán)境污染，采取高效、低毒、低殘留的生物防治方法是治療桃褐腐病的必然趨勢。拮抗菌不僅安全性高，而且成本相對較低。本文研究死谷芽孢桿菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對桃褐腐病的抑菌效果，并測定揮發(fā)性活性氣體的成分，以期為桃貯藏及保鮮提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

桃樹品種為重陽紅，產(chǎn)地為山東青島即墨。

菌種為死谷芽孢桿菌（12a），由本試驗室從即墨桃園的土壤中分離篩選所得。在40℃條件下活化培養(yǎng)4 天，用無菌打孔器取直徑為8 mm 的菌塊用于試驗。

供試培養(yǎng)基：褐腐菌平板培養(yǎng)使用馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），拮抗菌平板培養(yǎng)使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA），液體培養(yǎng)使用NB 培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1 揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的測定

揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的提取。取直徑為5 mm 的死谷芽孢桿菌菌餅接種到PDB 培養(yǎng)基中，先在40℃恒溫條件下以180 r/min 振蕩培養(yǎng)，48 h 后靜止狀態(tài)下培養(yǎng)。7 天后，分別將菌絲和PDB乙醚萃取，萃取液濃縮后進行GC-MS 分析。

定性分析方法。萃取液經(jīng)色譜分離后進入質(zhì)譜儀進行全掃描，質(zhì)譜掃描每個色譜峰得到質(zhì)譜圖，通過計算機用標準NIST08 質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫檢索，定性分析確定揮發(fā)性氣體的組分種類。

定量分析方法。采用色譜分析法中的歸一化法。

1.2.2 揮發(fā)性氣體成分對病原菌菌絲的抑制率

平板對峙法測定[5]。作為對照組，用5 mm 打孔器取樣，在PDA 平板中央接種直徑5 mm 的死谷芽孢桿菌菌餅，40℃恒溫條件下培養(yǎng)5 天。處理組，同樣用用5 mm 打孔器取樣，在空白平板中央接種直徑 5 mm 的桃褐腐病菌菌餅，然后與培養(yǎng)5 天的死谷芽孢桿菌平板兩皿底對扣，接種桃褐腐病菌菌餅的平板在上，然后用封口膜將對扣的2 個平板密封，試驗重復(fù)3 次。在28℃條件下培養(yǎng)24 h 后，每隔12 h 用直尺交叉法測量病原真菌菌落直徑，計算揮發(fā)性氣體成分的抑制率。

抑制率（%）={（對照組病原菌直徑-處理組病原菌直徑）/對照組病原菌直徑}×100%

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的測定

試驗組與對照組的GC-MS 總離子流圖詳見圖1、圖2。對照組產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)主要有甲氧基苯基肟、酞酸二乙酯、芴；試驗組產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)主要有甲氧基苯基肟、2-戊基呋喃、酞酸二乙酯，其他還有異戊基丙酮（6-甲基-2-庚酮）、2，3，4-三甲基戊烷、5-甲基-5-丙基壬烷、環(huán)十二醇、十四烷、4，6-二甲基十二烷、正二十烷、金合歡烷、1-異丙苯基萘、柏木腦。其中，只存在于試驗組的有異戊基丙酮（6-甲基-2-庚酮）、2，3，4-三甲基戊烷、環(huán)十二醇、十四烷、正二十烷、金合歡烷、1-異丙苯基萘、柏木腦。推測這些只存在于試驗組的揮發(fā)性物質(zhì)具有抑菌作用，抑菌效果有待進一步研究。

圖1 CK 揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的GC-MS 總離子流圖

圖2 死谷孢桿菌菌絲乙醚萃取液的GC-MS 總離子流圖

2.2 揮發(fā)性物質(zhì)對病原菌菌絲的抑制結(jié)果

試驗組與對照組的菌斑直徑對比詳見圖3。試驗組24 h 時揮發(fā)性成分就對病原菌產(chǎn)生抑制作用，但效果不明顯。時間越長，抑制效果越明顯。結(jié)果表明，死谷芽孢桿菌揮發(fā)性氣體成分能夠明顯抑制桃褐腐病病原菌絲的生長，控制桃褐腐病的發(fā)病程度。

圖3 試驗組與CK 的菌斑直徑

3 結(jié)論與討論

本試驗對死谷芽孢桿菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)展開研究，主要包括死谷芽孢桿菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)的測定、揮發(fā)性物質(zhì)對病原菌菌絲的抑制作用。試驗結(jié)果可知，死谷芽孢桿菌揮發(fā)性氣體成分能夠明顯抑制桃褐腐病病原菌絲的生長，控制桃褐腐病的發(fā)病程度。