刺梨氣泡水配方優(yōu)化及其抗氧化和抗疲勞活性研究

韋會(huì)平，馬禮平，肖明鵬

（1.攀枝花學(xué)院，四川 攀枝花 617000；2.貴州初好農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司，貴州 六盤水 553000）

刺梨又名山王果、茨梨、木梨子，別名刺菠蘿、送春歸、九頭鳥等，為薔薇科薔薇屬多年生落葉小灌木刺梨（Rosa roxburghii Tratt）的果實(shí)，在我國(guó)貴州、四川、重慶、云南、鄂西、湘西等南方山區(qū)均有野生資源[1]。刺梨產(chǎn)業(yè)是貴州省重點(diǎn)發(fā)展的扶貧產(chǎn)業(yè)和生態(tài)產(chǎn)業(yè)。截至2020 年底，貴州省刺梨種植面積已達(dá)20 萬hm2以上[2]。此外，在四川冕寧、重慶秀山等地也有小規(guī)模種植。我國(guó)將刺梨作為藥食兩用食材已有悠久的歷史，在醫(yī)學(xué)典籍中也多有收載[3-4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，刺梨含有VC、黃酮、多酚、皂甙、多糖、超氧化物歧化酶（SOD）等多種生物活性成分[4-8]，具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、促進(jìn)消化和解痙、降血脂、降血糖、解酒保肝、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多方面藥理作用[4,9-13]。考慮到刺梨汁酸澀感很重，含量稍高會(huì)嚴(yán)重影響產(chǎn)品口感，因此目前市場(chǎng)上的刺梨果汁氣泡飲料產(chǎn)品一般將刺梨汁含量控制在5%以下。

本文將刺梨自身的藥理作用與?；撬?、瓜拉納提取物（主要活性成分為咖啡因）等具有抗疲勞活性的食用添加劑有機(jī)結(jié)合，將刺梨獨(dú)具特色的酸澀感與碳酸飲料的清涼爽口特性相融合，研制具有獨(dú)特風(fēng)味和更強(qiáng)抗氧化、抗疲勞活性的高果汁含量的新型氣泡飲料產(chǎn)品，為刺梨產(chǎn)業(yè)提供新的發(fā)展思路和產(chǎn)品支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

刺梨濃縮汁（鮮果壓榨、膜過濾的3 倍濃縮清汁，可溶性固形物含量為26.6 g/100 mL，VC 含量為4 600 mg/100 mL），貴州初好農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司；L（+）-抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；果葡糖漿（F55），廣州雙橋股份有限公司；瓜拉納提取物（咖啡因20%），河南晟發(fā)生物科技有限公司。其他為常規(guī)試劑，配方產(chǎn)品用的為食品級(jí)，測(cè)定分析用的為分析純。測(cè)定用水為去離子水。

試驗(yàn)動(dòng)物：6～8 周齡SPF 級(jí)昆明系雄性小鼠，由長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司提供（試驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK（湘）2014-0011），體重18～22 g。飼養(yǎng)溫度（22±3）℃，相對(duì)濕度60%±10%，室內(nèi)噪聲＜55 dB，光照時(shí)間為每日7：00—18：00，飼喂普通飼料，自由采食和飲水。

1.1.2 儀器與設(shè)備

BS250S 型賽多利斯精密天平, 北京賽多利斯天平有限公司；PHSJ-6L 型pH 計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；GR50 型全自動(dòng)折光儀，上海卓光儀器科技有限公司；S500 型數(shù)顯式電熱恒溫水溫箱，南京曉曉儀器設(shè)備有限公司；800D 型高速離心機(jī)，江蘇金怡儀器科技有限公司；80-138 型全自動(dòng)碳酸飲料殺菌灌裝機(jī)，上海沃迪智能裝備股份有限公司；PLC型碳酸飲料自動(dòng)混比機(jī)，廣州達(dá)意隆包裝機(jī)械有限公司；UV1900 型紫外分光光度計(jì)，讓奇（上海）儀器科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基本配方及工藝

產(chǎn)品配方由果葡糖漿、刺梨濃縮汁、二氧化碳、?；撬帷⒐侠{提取物、檸檬酸、植酸鈉、三氯蔗糖8 種組分構(gòu)成。根據(jù)一般藥用劑量，結(jié)合我國(guó)食品添加劑使用限量規(guī)定、產(chǎn)品質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)性設(shè)計(jì)要求，將產(chǎn)品的核心功能性成分刺梨濃縮汁、?；撬?、瓜拉納提取物和植酸鈉含量分別固定為7%、0.05%、0.05%和0.005%。其余組分主要用于調(diào)整產(chǎn)品感官品質(zhì)，根據(jù)前期單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定其較為適宜的用量范圍為：果葡糖漿4%～10%,檸檬酸0.006%～0.012%，三氯蔗糖0.000 7%～0.001 3%，二氧化碳0.4%～1%。因此，配方只需對(duì)后4 種組分的用量進(jìn)行優(yōu)化即可。產(chǎn)品制作工藝為：先將配方中除二氧化碳以外的各組分用飲用水溶解混合均勻，定容，超高溫瞬時(shí)滅菌（132 ℃，5 s）并冷卻至40 ℃以下，再用碳酸飲料自動(dòng)混比機(jī)充入二氧化碳，灌裝密封，即得到產(chǎn)品。

1.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以果葡糖漿（A）、檸檬酸（B）、三氯蔗糖（C）和二氧化碳（D）為主要影響因素，以產(chǎn)品感官品質(zhì)為考察指標(biāo)，進(jìn)行L16(45)正交試驗(yàn)[14]，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 L16(45)正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 L16(45)orthogonal test factors and levels 單位：%

1.2.3 感官評(píng)價(jià)

參考復(fù)合運(yùn)動(dòng)飲料的感官評(píng)價(jià)方法[15]，結(jié)合本產(chǎn)品的實(shí)際特性，確定其感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（見表2）。邀請(qǐng)5位在飲料感官評(píng)價(jià)方面有較豐富經(jīng)驗(yàn)的人員組成感官評(píng)定小組，根據(jù)產(chǎn)品色澤、滋味、氣味、組織形態(tài)和氣泡5 個(gè)方面對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

表2 產(chǎn)品感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria of products

1.2.4 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.4.1 pH

使用pH 計(jì)檢測(cè)最終產(chǎn)品的pH。

1.2.4.2 離心沉淀率稱取一定質(zhì)量（m0）的飲料置于離心管中，以3 000 r/min 離心10 min 后，對(duì)管內(nèi)上清液稱重（m），按下式計(jì)算飲料的離心沉淀率[16]。

1.2.4.3 可溶性固形物含量

參照GB 15266—2009[17]中的折光計(jì)法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4.4 VC 含量

參照GB 5009.86—2016[18]中的第3 法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4.5 微生物指標(biāo)

按GB 7101—2015[19]中的方法檢測(cè)產(chǎn)品的微生物菌落總數(shù)、大腸桿菌和致病菌等微生物指標(biāo)。

1.2.5 體外抗氧化活性評(píng)價(jià)

1.2.5.1 羥基自由基清除率

參照文獻(xiàn)[20]中的方法并作適當(dāng)修改。在試管中裝入2.0 mL 9 mmol/L 硫酸亞鐵和2.0 mL 9 mmol/L 水楊酸醇溶液，再準(zhǔn)確加入2.0 mL 優(yōu)化后的配方飲料樣品，搖勻繼續(xù)加入2.0 mL 20 mmol/L 雙氧水，混合搖勻，于37 ℃水浴加熱30 min，以純水作空白對(duì)照，2.9 g/L VC 作陽性對(duì)照，在510 nm 處測(cè)定吸光度值，平行測(cè)定3 次，按下式計(jì)算羥自由基清除率。

式中：A1為待測(cè)管吸光度值；A2為以水替代雙氧水的待測(cè)管吸光度值；A0為以水替代樣品的待測(cè)管吸光度值。

1.2.5.2 超氧陰離子自由基清除率

參照文獻(xiàn)[20]中的方法并作適當(dāng)修改。將2.0 mL Tris-HCl 溶液（0.1 mmol/L，pH 8.2）裝入試管內(nèi)，準(zhǔn)確加入0.1 mL 優(yōu)化后的配方飲料樣品和0.1 mL 3 mol/L的鄰苯三酚鹽酸溶液，于25 ℃下水浴加熱5 min，冷卻至室溫，以水作空白對(duì)照，2.9 g/L VC 作陽性對(duì)照，于420 nm 處測(cè)定吸光度值，仍按“1.2.5.1”中公式計(jì)算超氧陰離子自由基清除率。式中A1為待測(cè)管吸光度值；A2為以水替代鄰苯三酚鹽酸溶液的待測(cè)管吸光度值；A0為以水替代樣品的待測(cè)管吸光度值。

1.2.6 抗疲勞活性測(cè)定[21]

1.2.6.1 小鼠分組與給藥

小鼠正常條件下自由攝食飲水,適應(yīng)7 d 后，隨機(jī)分為4 組（n=10）：優(yōu)化配方試驗(yàn)組（L 組，用優(yōu)化配方制作產(chǎn)品灌胃）；刺梨汁試驗(yàn)組（M 組，按優(yōu)化配方但不添加?；撬岷凸侠{提取物制作產(chǎn)品灌胃）；?；撬?瓜拉納提取物試驗(yàn)組（N 組，按優(yōu)化后配方但不添加刺梨濃縮汁制作產(chǎn)品灌胃）；空白對(duì)照組（CK 組，生理鹽水灌胃）。各組均按0.2 mL/10 g 體重劑量灌胃給藥，每日1 次，連續(xù)給藥7 d。

1.2.6.2 小鼠負(fù)重游泳試驗(yàn)

它們是幾個(gè)月前弗里蒙特在油菜旁種植的野豌豆和苜蓿，這是兩種生長(zhǎng)迅速的豆科植物，可防止油菜田里長(zhǎng)出雜草，還可防止饑餓的甲蟲和象鼻蟲的攻擊，并讓弗里蒙特需要噴灑的除草劑和殺蟲劑減少一半。他說，種植單一植物的田里間種其他各類植物產(chǎn)生的效果“十分理想”。

最后一次灌胃給藥30 min 后，在水深30~40 cm、水溫20.0~25.0 ℃的游泳裝置中進(jìn)行負(fù)重游泳試驗(yàn)。每組取10 只小鼠，尾根部負(fù)重5%體重的鉛絲，置于游泳裝置中，記錄小鼠開始游泳至頭沒入水面下10 s不能上浮所用的時(shí)間，以此作為小鼠負(fù)重游泳時(shí)間。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25.0 對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和優(yōu)化（Duncan 法），并對(duì)抗氧化和小鼠負(fù)重游泳試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。由表3 可見，因素A 除第2、4 水平間不存在顯著差異外，其余各不同水平間差異顯著（P＜0.05），以3 水平評(píng)分最高。從試驗(yàn)實(shí)際觀察結(jié)果來看，果葡糖漿用量太少，會(huì)使產(chǎn)品甜度降低、酸澀感加重；用量太高，會(huì)使口感變得滋膩，并掩蓋刺梨的特殊香味和碳酸飲料的清涼感。綜合來看，應(yīng)以3 水平為最佳。因素B 第1、2 水平與3、4 水平間差異顯著（P＜0.05），以1 水平評(píng)分最高。從試驗(yàn)實(shí)際觀察結(jié)果來看，隨著檸檬酸用量增加，飲料會(huì)產(chǎn)生更重的酸澀感。但如果不添加檸檬酸，飲料顏色就不穩(wěn)定。1 水平和2 水平之間沒有顯著差異，從節(jié)約成本考慮，以1 水平為最佳。因素C雖為影響產(chǎn)品品質(zhì)的次要因素，但不同水平間差異仍達(dá)顯著水平，以2 水平評(píng)分最高。從試驗(yàn)實(shí)際觀察結(jié)果來看，三氯蔗糖用量減少，則飲料酸澀感變重；用量過高，則其甜味會(huì)在口腔中產(chǎn)生嚴(yán)重的后味。2、3 和4水平之間無顯著差異，從節(jié)約成本考慮，以2 水平為最佳。因素D 不同水平間差異顯著，以1 水平評(píng)分最高。從試驗(yàn)實(shí)際觀察結(jié)果來看，二氧化碳用量越高，飲料開蓋后的沖瓶現(xiàn)象就越嚴(yán)重，使消費(fèi)者產(chǎn)生不安全感。1 水平和2 水平之間沒有顯著差異，從節(jié)約成本考慮，以1 水平為最佳。綜上所述，各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的主次順序?yàn)锳＞D＞B＞C，最佳組合為A3B1C2D1, 即果葡糖漿8%、檸檬酸0.006%、三氯蔗糖0.000 9%、二氧化碳0.4%。按篩選出的最佳組合，重復(fù)進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，平均得分為86.6 分，高于正交試驗(yàn)中各組合。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果（n=7,±s）Table 3 Results of orthogonal test（n=7,±s）

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果（n=7,±s）Table 3 Results of orthogonal test（n=7,±s）

注：同一列不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。

試驗(yàn)號(hào) 因素 評(píng)分/分A B C D 空列63.0±3.2 2 1 2 2 2 2 64.5±2.2 1 1 1 1 1 1 3 39.8±1.9 4 1 4 4 4 4 32.1±2.2 1 3 3 3 3 5 67.8±3.6 6 2 2 1 4 3 55.5±4.2 2 1 2 3 4 7 70.0±3.4 8 2 4 3 2 1 60.9±3.6 2 3 4 1 2 71.9±5.6 10 3 2 4 3 1 69.7±3.6 11 3 3 1 2 4 65.3±4.2 12 3 4 2 1 3 77.6±5.4 13 4 1 4 2 3 70.7±4.6 14 4 2 3 1 4 70.9±3.8 15 4 3 2 4 1 45.9±3.2 16 4 4 1 3 2 42.6±2.9 k1 49.850 c 68.350 a 56.600 b 70.375 a 59.875 k2 63.550 b 65.150 a 63.950 a 65.350 a 62.250 k3 71.125 a 55.250 b 60.875 ab 54.975 b 60.900 k4 57.525 b 53.300 b 57.525 ab 53.300 b 59.025 R 21.275 15.050 7.350 17.075 3.225因素主次 A＞D＞B＞C優(yōu)水平 A3 B1 C2 D1優(yōu)組合 A3B1C2D1 9 3 1 3 4 2

表4 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance(ANOVA)of orthogonal test

由表4 可見，總體試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦_(dá)極顯著水平（P＜0.01），因素A 和D 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響達(dá)極顯著水平（P＜0.01），因素B 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響達(dá)顯著水平（P＜0.05）。根據(jù)F 值和R 值判斷，各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的主次順序?yàn)锳＞D＞B＞C。

2.2 產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)優(yōu)化后的最佳配方制得的刺梨氣泡水產(chǎn)品色澤均勻而穩(wěn)定、淡黃透亮，酸甜適中，并有刺梨的香味和氣泡飲料的清涼感，靜置后未有明顯沉淀與分層。產(chǎn)品的pH 為3.6，可溶性固形物含量8.3%，VC含量290 mg/100 mL,離心沉淀率0.34%，微生物菌落總數(shù)＜10 CFU/mL，大腸桿菌和其他致病菌未檢出。將產(chǎn)品分別在5、25、37 ℃（空氣相對(duì)濕度均為65%）下進(jìn)行加速試驗(yàn)，4 個(gè)月內(nèi)3 組產(chǎn)品的外觀、口感、VC含量和微生物指標(biāo)均未發(fā)生顯著改變。據(jù)此推斷，產(chǎn)品保質(zhì)期可達(dá)1 年以上，達(dá)到運(yùn)動(dòng)飲料、碳酸飲料和果汁飲料相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[17,22-23]。

2.3 體外抗氧化活性結(jié)果與分析

體外自由基清除率測(cè)定結(jié)果見表5。優(yōu)化配方試驗(yàn)組和含等劑量（290 mg/100 mL）VC 對(duì)照組對(duì)羥自由基和超氧陰離子自由基都有較強(qiáng)的清除作用，但二者清除率存在極顯著差異（P＜0.01）。

表5 產(chǎn)品對(duì)自由基的清除率（n=3,±s）Table 5 Free radical scavenging rate（n=3,±s）單位：%

表5 產(chǎn)品對(duì)自由基的清除率（n=3,±s）Table 5 Free radical scavenging rate（n=3,±s）單位：%

注：同一列中不同大寫字母表示差異極顯著（P＜0.01），下表同。

組別 羥自由基 超氧陰離子自由基優(yōu)化配方試驗(yàn)組 92.62±1.24 A 82.84±1.46 A 290 mg/100 mL VC 對(duì)照組72.63±2.12 B 58.32±1.82 B

2.4 抗疲勞活性研究結(jié)果與分析

表6 小鼠負(fù)重游泳試驗(yàn)結(jié)果（n=10,±s）Table 6 Results of weight-bearing swimming test in mice（n=10,±s）

表6 小鼠負(fù)重游泳試驗(yàn)結(jié)果（n=10,±s）Table 6 Results of weight-bearing swimming test in mice（n=10,±s）

組別 數(shù)量 平均游泳時(shí)間/s CK 10 15.86±2.64 C L 10 26.25±1.86 A M 10 17.65±2.12 B N 10 18.42±1.65 B

3 結(jié)論與討論

本研究通過正交試驗(yàn)確定刺梨氣泡水的最佳配方為：果葡糖漿8%,刺梨濃縮汁7%，二氧化碳0.4%,?；撬?.05%，瓜拉納提取物0.05%，檸檬酸0.006%，植酸鈉0.005%，三氯蔗糖0.000 9%。本配方中使用的刺梨3 倍濃縮汁，如果折合成原汁來計(jì)算，則產(chǎn)品中的果汁含量達(dá)到21%。根據(jù)配方工藝制得的產(chǎn)品中VC 含量達(dá)290 mg/100 mL, 相關(guān)指標(biāo)均達(dá)到運(yùn)動(dòng)飲料、碳酸飲料和果汁飲料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。產(chǎn)品對(duì)羥自由基和超氧陰離子自由基的清除作用超過等劑量VC。小鼠負(fù)重游泳試驗(yàn)結(jié)果表明，本產(chǎn)品具有較強(qiáng)的抗疲勞活性，而且將刺梨汁和?；撬帷⒐侠{提取物搭配使用，其抗疲勞活性會(huì)極顯著增強(qiáng)。

產(chǎn)品配方中的刺梨濃縮汁除含較高的VC 以外，還含有VP、超氧化物歧化酶（SOD）、黃酮、多酚等多種抗氧化活性成分[2-4]。此外，配方中加入的植酸鈉、?；撬岬纫簿哂幸欢寡趸饔肹24]。本產(chǎn)品多種抗氧化活性成分協(xié)同作用，不僅獲得了比等劑量VC 更高的抗氧化活性，還獲得了良好的產(chǎn)品穩(wěn)定性。有研究表明，人體在長(zhǎng)時(shí)間劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，體內(nèi)的氧化還原平衡被破壞，生成過量的自由基與活性氧，促使體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激，出現(xiàn)組織損傷、肌肉收縮能力下降等不良現(xiàn)象，產(chǎn)生疲勞感，而對(duì)機(jī)體補(bǔ)充外源性抗氧化劑是延緩疲勞的有效方法之一[25-27]。因此，本產(chǎn)品有可能正是通過多種抗氧化活性成分協(xié)同作用機(jī)制，獲得了滿意的抗疲勞效果。