KASP技術(shù)及其在牛SNP分型中的應(yīng)用研究進展

馬士龍 謝書瓊 劉益麗 唐嬌 江明鋒

摘要：競爭性等位基因特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（kompetitive allele specific PCR，簡稱KASP）是一種基于單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，簡稱SNP）的新型基因分型技術(shù)，可從基因組水平對SNP和插入缺失多態(tài)性（insertion and deletion，簡稱Indel）進行精準(zhǔn)分型，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。KASP與其他分型技術(shù)相比，支持低、中、高通量SNP檢測，具備成本低、特異性好、準(zhǔn)確性高等優(yōu)勢，可通過分子檢測手段對家畜功能基因進行準(zhǔn)確分型，從而達到優(yōu)良性狀的定向改良育種目標(biāo)。目前，KASP技術(shù)已在牛功能基因相關(guān)SNP檢測、疾病分型等方面應(yīng)用起來，本文對近年來KASP技術(shù)及其在牛SNP基因分型中的應(yīng)用研究進展進行概述，以期為該技術(shù)在牛的產(chǎn)乳、產(chǎn)肉等性狀的改良應(yīng)用方面提供借鑒。

關(guān)鍵詞：KASP;SNP基因分型技術(shù);功能基因;SNP檢測;疾病分型;改良育種

中圖分類號：S823.2 文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2022）11-0031-06

收稿日期：2021-10-21

基金項目：四川省國際科技創(chuàng)新合作/港澳臺科技創(chuàng)新合作項目（編號：2019YFH0035）;四川省重點研發(fā)項目（編號：21ZDYF2193）;四川省科技計劃（編號：21ZDYF2706）;西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新型科研項目（編號：CX2020SZ40）。

作者簡介：馬士龍（1996—），男，河南駐馬店人，碩士，主要從動物遺傳育種與繁殖研究。E-mail： 1471879112@ qq.com。

通信作者：江明鋒，博士，教授，主要從生理基因組學(xué)及基因工程研究。E-mail： mingfengjiang@vip.sina.com。

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，簡稱SNP）是動植物基因組中最常見的遺傳變異類型之一，可用于構(gòu)建高密度遺傳圖譜和標(biāo)記輔助選擇，有利于全基因組選擇研究，對目的性狀相關(guān)的候選基因SNP進行精細(xì)定位，可實現(xiàn)對性狀的選擇。目前，越來越多簡單、快速、高效、高通量的SNP檢測方法不斷被開發(fā)出來，競爭性等位基因特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（kompetitive allele specific PCR，簡稱KASP）檢測技術(shù)在基因組學(xué)的快速發(fā)展下應(yīng)運而生，它是一種基于已知SNP的終點熒光基因分型技術(shù)，可對基因組SNP位點以及插入缺失多態(tài)性（insertion and deletion，簡稱Indel）進行雙等位基因分型。國外首次報道出KASP適用于大樣本（N>10 000）的少量SNP分型，并且鑒定出與牛結(jié)核病相關(guān)的多個SNP;我國已將其應(yīng)用到奶牛隱形遺傳缺陷病的檢測。

21世紀(jì)以來，KASP作為國際上動植物遺傳育種主流的SNP分型工具之一，在植物分子標(biāo)記輔助選擇領(lǐng)域應(yīng)用最多，國內(nèi)外已經(jīng)構(gòu)建出小麥、水稻等多種植物基因組KASP標(biāo)記庫;近幾年，國內(nèi)外不少學(xué)者將KASP技術(shù)應(yīng)用在牛、羊等家畜的產(chǎn)乳、生長繁殖等生產(chǎn)性狀基因SNP位點挖掘及遺傳疾病鑒定方面，且取得了不錯的進展。隨著KASP技術(shù)逐漸成熟，該技術(shù)對國內(nèi)奶牛、肉牛品種的選育及改良具有巨大應(yīng)用潛力，本文對近年來KASP技術(shù)在牛育種領(lǐng)域的研究進展以及應(yīng)用前景進行總結(jié)，以期為將來的育種研究提供理論依據(jù)。

1 KASP技術(shù)

KASP技術(shù)是繼第2代測序技術(shù)（next generation sequencing，簡稱NGS）和基因芯片等SNP分析的第3代分子標(biāo)記技術(shù)。2011年，KBiosciences公司開發(fā)出基于等位基因特異性寡核苷酸延伸和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，簡稱FRET）產(chǎn)生信號的KASP系統(tǒng)，該系統(tǒng)相對其他基因分型系統(tǒng)更容易、更便宜且更靈活，目前KBiosciences公司已被英國政府化學(xué)家實驗室（LGC）收購。2013年，Lister等首次將KASP技術(shù)用于古DNA（aDNA）分析中，由于所需的DNA模板長度通常比Sanger測序（第1代測序）法短得多，并且對于樣本產(chǎn)量低、降解水平高的情況，KASP有較高的成功率。另外KASP分型可在短時間內(nèi)用生成遺傳多樣性的SNP數(shù)據(jù)，有助于快速進行重要表型性狀調(diào)控基因的選擇。Semagn等將KASP平臺與傳統(tǒng)SNP檢測平臺GoldenGate對比，發(fā)現(xiàn)KASP更精確、費用更低且效率更高;與此同時，低密度的KASP標(biāo)記足以達到質(zhì)量控制所需的鑒定目的，比高密度簡化基因組測序（genotyping by sequencing，簡稱GBS）方法更有效。Yu等開發(fā)了Fluidigm/KASP標(biāo)記系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)僅需11個KASP標(biāo)記就可以完成品種鑒定。Zhang等利用牛純合致死基因HH5 的KASP檢測技術(shù)，與已報道的高分辨率溶解曲線（HRM）檢測方法相比，大幅提高了檢測效率。Kaur等認(rèn)為KASP標(biāo)記正成為利用SNP進行育種的首選標(biāo)記。

當(dāng)前，KASP系統(tǒng)在SNP分型方面比其他技術(shù)具有一定的優(yōu)勢，如KASP和TaqMan的SNP分型檢出率（call rate）雖然都可達到99.9%，但KASP的引物設(shè)計和優(yōu)化更具SNP位點適用性;另外KASP比HRM、Snapshot、質(zhì)譜法的成本低，相較于Snapshot、質(zhì)譜法，KASP引物設(shè)計簡單、試驗操作簡易。而基于測序的簡化基因組測序（GBS）雖說可從大樣本量中快速挖掘和鑒定出高密度的SNP變異，但建庫費時、數(shù)據(jù)量大、成本較高，對于篩選到的SNP后續(xù)還需驗證;面對國內(nèi)研發(fā)的奶牛液相芯片（液相雜交捕獲測序），雖然可應(yīng)用于A2等功能基因和遺傳缺陷基因檢測方面，但液相芯片仍不能滿足低成本單標(biāo)記檢測的要求，針對主基因性狀僅需幾個SNP標(biāo)記時，還需要KASP技術(shù)在大群體范圍內(nèi)進行檢測。因具有設(shè)計簡單、分型準(zhǔn)確度高、成本較低、高效便捷等優(yōu)勢，KASP備受科研工作者的喜愛，而且KASP標(biāo)記不含凝膠，同時還避免了高密度SNP陣列靈活性差的缺點，可通過熒光檢測儀實現(xiàn)基因的快速準(zhǔn)確檢測，非常適用于高通量的育種研究。

1.1 KASP技術(shù)的原理

KASP 技術(shù)是通過終端熒光讀取判斷的高通量基因分型方法，其原理是依據(jù)引物末端堿基的特異性匹配，利用Touch-down PCR與熒光淬滅探針結(jié)合，發(fā)出熒光信號來對SNP分型以及檢測InDels。該反應(yīng)體系成分由3個部分構(gòu)成（圖1），第1部分為模板DNA;第2部分為KASP主混合物，包括英國LGC公司的FRET試劑盒（內(nèi)含2個通用的淬滅熒光探針FAM 和 HEX）、ROX陰性參比染料以及PCR所需的Taq酶等其他成分;第3部分為KASP分析混合物，包含根據(jù)SNP位點前后序列特異性而設(shè)計的2條競爭性等位基因特異性正向引物和1條反向引物，2條正向引物的5′ 端連接了已知序列的等位基因1或等位基因2，它們分別與FAM 和 HEX對應(yīng)結(jié)合，發(fā)出熒光信號。

整個過程主要分為3輪反應(yīng)（圖2）。第1輪PCR：KASP分析混合物中連有等位基因1的正向引物3′端對應(yīng)其中1條DNA模板鏈上的SNP，引物與SNP上游結(jié)合并退火延伸，完成SNP的識別;反向引物也結(jié)合另一條DNA模板鏈并退火延伸。第2輪PCR：反向引物結(jié)合正向引物合成的序列并延伸，合成等位基因1末端序列的互補鏈，這一步把等位基因1引入與SNP對應(yīng)的PCR產(chǎn)物。第3輪PCR：等位基因1對應(yīng)的檢測產(chǎn)物隨PCR擴增呈指數(shù)性增長，淬滅熒光探針FAM退火到新合成的互補鏈上，發(fā)出熒光信號;如果樣本SNP的基因型是純合的，則只會產(chǎn)生1種熒光信號，雜合子的結(jié)果是混合熒光信號，從而確定SNP分型。

1.2 KASP試驗數(shù)據(jù)分析

目前，KASP技術(shù)的2個核心組分：主混合物和分析混合物，都只能從LGC公司購買，由于主混合物是通用的，可適用于所有KASP試驗，須要注意的是，不同熒光定量PCR儀對ROX陰性參比染料的要求不一樣，這就要在LGC（https：//www.biosearchtech.com）選購適合PCR儀的高、標(biāo)準(zhǔn)、低ROX配方的KASP主混合物。KASP分析混合物是不需要針對每個SNP合成特異的熒光引物，而是根據(jù)用戶提交的序列，由Kraken軟件設(shè)計。引物有2種格式，即計算機驗證（KBD）和實驗室完全驗證（KOD），KOD引物是經(jīng)LGC充分驗證和優(yōu)化后的，相較于KBD更有效，但價格會高一點。

另外，KASP擴增結(jié)束后，利用微孔板熒光分析儀、熒光定量PCR儀或帶熒光檢測功能的酶標(biāo)儀便可檢測FAM和HEX的不同激發(fā)波長來區(qū)分基因型;值得注意的是：檢測機器讀取溫度都要小于等于40℃，同樣是熒光定量PCR儀分析，均不使用實時功能來生成結(jié)束點曲線，而是在PCR運行完成后進行讀取。如果要進行聚類分析，就要用到KlusterCaller或SNPviewer軟件，SNPviewer只是個可視化工具，而KlusterCaller是Kraken的基因分型數(shù)據(jù)分析和報告模塊，當(dāng)數(shù)據(jù)導(dǎo)入KlusterCaller軟件時，內(nèi)置的算法會自動辨別結(jié)果是等位基因1純合子、等位基因2純合子還是雜合子，檢測的傳統(tǒng)聚類圖都會自動生成（圖3）。

2 KASP分型技術(shù)在牛育種中的應(yīng)用

2.1 定位生長性狀基因SNP位點

牛的體長、產(chǎn)肉量等生長性狀是復(fù)雜的數(shù)量性狀，受多基因控制。在牛的選種選育工作上，對生長、生產(chǎn)等參數(shù)進行遺傳分析，能夠?qū)θ馀．a(chǎn)業(yè)的優(yōu)選配種工作進行指導(dǎo)。早期，連鎖分析法和候選基因法在全基因組范圍內(nèi)鑒定和篩選生長性狀的主效基因效果差，由此出現(xiàn)了SNPscan、質(zhì)譜法、SNP芯片等分型技術(shù)，但是這些存在陽性率低、設(shè)備要求高、成本偏高等問題，而KASP可勝任?；蚪M中高通量DNA變異鑒定，針對家畜生長發(fā)育功能基因的定位研究，被科研工作者廣泛應(yīng)用。

Kusza等對山羊生長發(fā)育基因GHRHR的 g.62894878A>G 位點進行KASP分型，成功率達94.81%;薛蕾采用KASP對內(nèi)蒙古絨山羊群體的體質(zhì)量、體高、體長等生長性狀相關(guān)的特有候選Indels位點（均小于5 bp）進行鑒定，分型結(jié)果清晰明確。這2個研究結(jié)果都表明KASP可作為有效的基因分型工具對生長發(fā)育基因的SNP位點進行定位。目前KASP在牛生長性狀基因上的研究還較少。Pareek等通過KASP分型平臺驗證了荷斯坦牛的BTA4_77555734、BTA19_27086284、BTA25_ 33248237、BTA16_ 81545856等位點，確定了生長和繁殖候選基因KCNIP4、CCSER1、DPP6、MAP3K5和GHR;這些SNP位點作為新的生長發(fā)育標(biāo)記，有助于研究荷斯坦牛肉質(zhì)和繁殖性狀關(guān)鍵調(diào)控機制。顏澤等通過整合KASP技術(shù)和微流控芯片建立了針對3個牛無角基因Celtic P位點、Mongolian P位點、Friesian P位點的快速診斷方法，首次在三河牛中檢測到Mongolian基因 P位點的存在。證明KASP技術(shù)可以有效對牛肉質(zhì)、體質(zhì)量、無角等生長性狀準(zhǔn)確分型，為肉牛業(yè)開展優(yōu)良品種的分子標(biāo)記輔助選擇育種提供了技術(shù)手段。

2.2 產(chǎn)乳性狀基因SNP定位分型

產(chǎn)乳性狀是奶牛的重要經(jīng)濟性狀，數(shù)量遺傳學(xué)認(rèn)為產(chǎn)乳性狀（包括產(chǎn)乳量、乳脂量、蛋白含量、乳脂率、蛋白率等） 是由微效多基因決定的數(shù)量性狀，也是分子標(biāo)記輔助選擇的理想性狀之一。近些年，科研工作者利用SNP分型技術(shù)如質(zhì)譜法、PCR-SSCP等技術(shù)對奶牛產(chǎn)乳性狀的候選基因及相關(guān)變異位點進行檢測，但都有操作繁瑣、樣本質(zhì)量要求高、試驗設(shè)備昂貴等缺點，而KASP技術(shù)具備靈活性高、樣本需求低、設(shè)備要求低、分型準(zhǔn)確率高等特點，非常適宜定位奶牛乳性狀的重要候選基因。

如今，國內(nèi)外已經(jīng)用KASP技術(shù)分型到了多個SNP位點與PRLR、CSN3等產(chǎn)乳性狀候選基因相關(guān)。Fontanesi等利用KASP技術(shù)鑒定出荷斯坦牛的催乳素受體編碼基因PRLR的20： g.39071965C>T位點與產(chǎn)乳量、乳脂量等性狀顯著相關(guān)（P<0.05）;酪蛋白編碼基因CSN2、CSN3的SNP位點分別與乳蛋白率、乳蛋白量相關(guān);這進一步鎖定了荷斯坦牛高日產(chǎn)奶量的基因位點，加快了奶牛的定向育種。Cosenza等首次發(fā)現(xiàn)意大利水牛催乳素受體編碼基因PRLR的20： g.11188 A>G位點（AA型）并進行KASP分型，發(fā)現(xiàn)AA型與牛乳脂肪酸等乳脂性狀有顯著影響（P<0.05），尤其與奇數(shù)和支鏈脂肪酸（OBCFA）緊密相關(guān);此多態(tài)性位點可用于標(biāo)記輔助選擇提高牛乳品質(zhì)。趙鳳等報道了一項基于KASP技術(shù)檢測奶牛κ型-酪蛋白編碼基因CSN3A、B、E這3種常見基因型的方法，依據(jù)此技術(shù)，奶牛中心成功篩選出120頭高產(chǎn)乳量BB基因型北京地區(qū)奶牛。武澤文等為了篩選β型-酪蛋白A2純合基因型荷斯坦奶牛，在奶牛場進行 KASP基因分型，結(jié)果成功檢測到A2純合基因型。說明 KASP方法可以高效快速地對奶?；蛐瓦M行篩選，并且該方法比PCR-SSCP（單鏈構(gòu)象多態(tài)性）、基因芯片等方法更適合大樣本檢測高產(chǎn)奶BB基因型奶牛個體。Abousoliman等用KASP對泌乳性狀基因的SNP進行分型，發(fā)現(xiàn)瘦素LEP（rs420693815）、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子STAT5A（rs161082816）與生長發(fā)育和泌乳性狀顯著相關(guān)，而LEP、STAT5A也在牛的泌乳性狀中發(fā)揮著重要作用，相關(guān)基因調(diào)控機制可進一步在牛上驗證。

綜上所述，產(chǎn)乳量、乳脂等性狀SNP位點的KASP分型結(jié)果為我國奶牛優(yōu)良性狀的QTL定位和全基因組關(guān)聯(lián)研究提供了重要信息，定位到的產(chǎn)乳候選基因PRLR、CSN3、LEP、STAT5A等SNP位點可用于我國荷斯坦奶牛的分子標(biāo)記輔助選擇工作中。

2.3 遺傳缺陷疾病分型及檢測

21世紀(jì)以來，我國為了提高奶牛的生產(chǎn)性能，在進口大量胚胎、種牛和冷凍精液的同時也導(dǎo)致了遺傳缺陷在國內(nèi)奶牛產(chǎn)業(yè)傳播，造成了巨大的經(jīng)濟損失。近幾年，全基因組測序技術(shù)在荷斯坦牛中鑒定出了牛白細(xì)胞黏附缺陷病（BLAD）、脊椎畸形綜合征（CVM）、荷斯坦單倍型HH1、HH3、HH4、HH5以及膽固醇缺乏單倍型（HCD）和短脊柱綜合征（BS）等隱性遺傳缺陷病，這迫切需要分子檢測方法對奶牛個體的缺陷基因進行研究。近幾年，SNP芯片、PCR-RFLP（限制性片段長度多態(tài)性）、TaqMan探針法、高分辨率溶解曲線法、KASP等檢測方法出現(xiàn)，其中屬KASP最高效、經(jīng)濟，可以對樣本進行高通量的檢測。

2013年，le Roex等以868頭非洲水牛為研究對象，通過KASP分型確定了與水牛結(jié)核?。˙TB）顯著相關(guān)的3個SNP：SNP41、SNP137、SNP144，它們分別位于SLC7A13、DMBT1、IL1a基因上，這為后續(xù)的牛結(jié)核病檢測方法提供了理論依據(jù)。熱應(yīng)激幾乎是所有奶牛產(chǎn)業(yè)都無法擺脫的難題，Ortega等使用KASP對熱休克蛋白HSPA1L進行基因分型，發(fā)現(xiàn)HSPA1L的缺失突變可使牛胚胎抵抗熱休克和高氧2種環(huán)境;如果選育出耐熱品種，使牛獲得抵抗熱休克的能力，可大大降低奶牛產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟損失。孫東曉等通過設(shè)計BLAD的ITGB2基因突變位點1： g.145114963A>G的KASP引物，為大規(guī)模篩查攜帶BLAD荷斯坦奶牛的工作節(jié)省資源成本。2018年，孫東曉等再次發(fā)明了基于KASP技術(shù)的脊椎畸形綜合征（CVM）檢測方法，設(shè)計1組針對CVM的SLC35A3基因突變位點3： g.43412427G>T的引物，可將CVM攜帶牛準(zhǔn)確分型，分型結(jié)果與梁若冰等的檢測結(jié)果一致，且此方法工作效率較高，適合大批量地檢測篩查BLAD和CVM荷斯坦奶牛。Lehner等采用KASP分型對荷斯坦奶牛的皺胃左方移位（LDA）癥的SNP進行了驗證分析，篩選出SLC4A3、EPHA4、CDH18、PAGE、KIAA1468等候選基因與LDA顯著相關(guān)（P<0.05）。針對LDA的分子檢測可提前篩查奶牛健康狀態(tài)，避免因皺胃移位導(dǎo)致消化機能紊亂，產(chǎn)奶量驟降造成經(jīng)濟損失。2019年，呂小青等對荷斯坦單倍型HH1的APAF1基因上5： g.63150400C>T位點以及HH3的SMC2基因的g.95410507T>C位點進行KASP分型，發(fā)現(xiàn)荷斯坦奶牛群體HH1攜帶率達12.66%。而2020年，Zhang等研究8種荷斯坦牛常見遺傳缺陷基因型頻率，用相同方法確定了中國荷斯坦牛群最高的CVM的攜帶率10.5%，HH1次之（10.0%），其次是HH3（2.6%）、BS（2.1%）、HCD（1.3%）、HH5（0.8%）、BLAD （0.5%），與前者相符;說明荷斯坦奶牛群體的遺傳缺陷病在國內(nèi)已經(jīng)普遍存在，有必要在國內(nèi)排查攜帶隱性遺傳缺陷基因牛。與此同時，Sieck等還發(fā)現(xiàn)荷斯坦?fàn)倥Ｏ骂M面部骨質(zhì)疏松癥（MD）的原因，通過KASP分型驗證出牛胚胎時期CYP26C1錯義突變（Chr26g.14404993T>C）導(dǎo)致維甲酸（RA）的失調(diào)，從而影響了內(nèi)皮素-1信號通路，造成了MD的發(fā)生。以上KASP基因分型方法可簡單、準(zhǔn)確、快速鑒定出多種牛遺傳缺陷基因，降低奶牛場有害突變疾病頻率，并合理安排選種選配工作，為選育更健康的荷斯坦牛提供策略。

3 結(jié)語與展望

目前，SNP基因分型技術(shù)主要有HRM、Snapshot、質(zhì)譜法、TaqMan、KASP，以及基于測序法鑒定SNP的GBS和液相芯片等;相較于其他技術(shù)，KASP更適合低、中、高通量SNP分型研究，但KASP仍有不足之處，例如熒光信號的定量處理會產(chǎn)生分型錯誤;同時也不能像直接測序法發(fā)現(xiàn)未知SNP位點，當(dāng)突變等位基因數(shù)量少于野生型等位基因的5%時，很難區(qū)分突變或野生型的個體。如今，KASP技術(shù)與基因精準(zhǔn)分型的研究需求有一定差距，但分子標(biāo)記技術(shù)正在快速發(fā)展，引物的優(yōu)化改良工作也將不斷被突破，而KASP技術(shù)結(jié)合微流控芯片的運用正在打開新的大門，相信未來KASP技術(shù)進一步成熟。

總而言之，KASP作為一項高效、靈活、經(jīng)濟、準(zhǔn)確的SNP分型檢測方法，適合在大規(guī)模的群體中完成高通量的SNP檢測與候選基因的精細(xì)定位;在全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）分析得到與性狀關(guān)聯(lián)的SNP位點之后，進行大群體小范圍SNP的KASP基因分型，可對關(guān)聯(lián)信號的可靠性進行驗證;還可通過開發(fā)目標(biāo)性狀的KASP標(biāo)記結(jié)合QTL遺傳連鎖分析來進一步縮小定位區(qū)段。在動物產(chǎn)肉、產(chǎn)奶等重要性狀的研究中發(fā)揮著越來越重要的作用;該項技術(shù)仍在動植物育種研究領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力，將來KASP技術(shù)會更加深入和廣泛地被應(yīng)用于牛的各方面研究，得到進一步的推廣和應(yīng)用，這將加快牛的育種進程，未來在新品種育種工作中發(fā)揮更大價值。

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