氯化鈣破乳輔助水酶法提取江永香柚籽油工藝的研究

張佳蒙， 劉千千， 王東梅， 肖新生， 蔣黎艷

(湖南科技學院化學與生物工程學院，永州 425199)

柚(Citrusgrandis)屬蕓香科常綠喬木，原產(chǎn)東南亞，在中國種植廣泛。湖南省江永縣為柚子重要產(chǎn)區(qū)，所產(chǎn)“江永香柚”與香芋、香菇、香姜和香米并列“江永五香”[1]。香柚具有清肺、消食、降血壓、通便、順氣等藥用價值，能促進人體的新陳代謝，維持正常的生理活動，對治療敗血癥和解酒輕身也有一定的效果[2，3]。香柚柚果經(jīng)鮮食或加工后，產(chǎn)生約35%～55%皮渣和果核，多被廢棄處理，既污染環(huán)境又浪費資源[4]。目前，香柚柚皮和果實的開發(fā)已被廣泛研究，然而香柚加工的副產(chǎn)品柚子籽卻未得到綜合利用。據(jù)測定柚子籽的油脂質(zhì)量分數(shù)豐富[5，6]，一般在40%以上；此外，柚子籽較其他柑橘類籽大，質(zhì)量為柚子整果肉質(zhì)量的0.1%～4.0%，有較高的實用價值，可以作為新的油脂資源。

水酶法是一種在酶法基礎上發(fā)展形成的脂類提取方法，利用非油成分對油和水的親和力差異及油水比重不同將非油成分和油分離[7]。相對于傳統(tǒng)的油脂提取方法，水酶法反應條件溫和，油脂精煉工藝流程少，所使用的酶安全無毒、易降解，且綠色、經(jīng)濟環(huán)保等[8，9]。Hu 等[10]發(fā)現(xiàn)水酶法提取得到的油的生育酚、酚類物質(zhì)含量比己醇提取的油更高，此外，氧化穩(wěn)定性也更好。然而，水酶法在提油過程中會產(chǎn)生一種水中含油(O/W)的乳狀液，穩(wěn)定乳狀液的形成會降低水酶法的提油率。為了減少乳狀液的形成，可采用加熱、凍融、酶法、溶劑等多種方法對乳狀液進行破乳，其中添加乙醇、CaCl2和調(diào)節(jié)pH等破乳方法具有成本低、操作簡單等優(yōu)點。Fang等[11]采用添加乙醇水溶液對水酶法提取的油茶籽油進行破乳研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水酶法提取與破乳相結(jié)合，可提高8.83%提取率。Liu等[12]研究添加不同無機鹽對水酶法提取花生油形成乳狀液的破乳效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同無機鹽的加入均可降低乳狀液的穩(wěn)定性，其中CaCl2破乳率最高。郝佳等[13]采用調(diào)節(jié)pH法對水酶法提取的稻米油進行破乳研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在pH為7時，破乳率可達到93.15%。

目前水酶法已被廣泛應用于山蒼子核仁油[14]、椰子油[15]、野杏仁油[16]、芝麻油[17]等多種油料種子中油脂的提取，然而運用氯化鈣破乳輔助水酶法提取江永香柚籽油工藝的研究還鮮見報道。因此，本實驗以江永香柚籽為原材料，研究在水酶法提取過程中添加氯化鈣來減少乳液形成和增加油脂提取率的方法，并對提取工藝的條件進行了優(yōu)化，旨在為新資源油脂的開發(fā)利用和江永香柚加工副產(chǎn)物的綜合利用現(xiàn)狀提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

江永香柚；堿性蛋白酶(100 000 U/g)、纖維素酶(100 000 U/g)、CaCl2、NaOH、HCl、酚酞溶液、碘化鉀溶液、淀粉溶液、硫代硫酸鈉標準溶液、韋氏試劑、乙醇、百里酚酞、冰乙酸、三氯甲烷、石油醚、無水硫酸鈉、重鉻酸鉀等均為分析純。

1.2 儀器與設備

TDZ-WS低速離心機，F(xiàn)W-177搖擺式中藥粉碎機，GC-2010Plus氣相色譜儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料的制備

挑選大小均勻、無機械傷、無病蟲害、無腐爛的江永香柚，沿十字方向縱切，去掉外皮、果肉，取其內(nèi)核，在90 ℃烘箱中烘6 h，去除外殼取其種仁，粉碎機粉碎過40目篩，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 氯化鈣破乳輔助水酶法的提取工藝

準確稱取2.00 g粉碎過的樣品與16 mL蒸餾水混合在100 mL錐形瓶中，質(zhì)量比為1∶8。將混合物加熱到90 ℃，保持10 min，冷卻至酶解溫度50 ℃。使用0.1 moL/L NaOH和HCl將料漿pH調(diào)整到6.0再添加一定量的纖維素酶，50 ℃培養(yǎng)1 h。再用2 moL/L NaOH調(diào)整懸浮液pH至適宜pH，然后加入一定量的堿性蛋白酶。將混合物在一定的溫度下酶解一定的時間，同時按特定的加入方式加入一定比例的氯化鈣，酶解結(jié)束后90 ℃滅酶10 min，冷卻至室溫。酶解液以3 000 r/min離心30 min，離心后，仔細收集油并稱重，計算得率。

香柚籽油得率=

1.3.3 單因素實驗

按照1.3.2節(jié)所述實驗方法，設置單因素實驗考察水酶法對香柚籽油得率的影響，雙酶分步水解可提高提油效率[16，18]，且根據(jù)初步預實驗發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶的酶解條件對香柚籽油得率的影響要高于纖維素酶。因此，在纖維素酶水解后，以纖維素酶與堿性蛋白酶質(zhì)量比1∶1 的實驗條件下，進行堿性蛋白酶的水解條件優(yōu)化，單因素水平設置如下：pH為6、7、8、9、10，酶添加量為0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%，酶解溫度40、45、50、55、60 ℃，酶解時間3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5 h，破乳劑氯化鈣加入方式為未加入、一次加入、分批加入、取乳液加入，氯化鈣與原料比為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6，每個單因素實驗重復3次，結(jié)果取平均值。

1.3.4 響應面分析

在單因素實驗結(jié)果的基礎上，采用響應面法對香柚籽油得率的工藝參數(shù)進行優(yōu)化，利用響應面Box-Behnken設計，選取影響香柚籽油得率較大的四個因素：pH、酶解溫度、酶解時間和氯化鈣與原料比為提取變量，香柚籽油得率為響應值，設計響應面分析實驗。

1.4 香柚籽油理化指標測定

香柚籽油過氧化值參照GB 5009.227—2016[19]測定；香柚籽油酸價參照GB 5009.229—2016[20]測定；香柚籽油碘價參照GB/T 5532—2008[21]測定；香柚籽油皂化值參照GB/T 5534—2008[22]測定。

1.5 香柚籽油脂肪的測定

參照GB 5009.168—2016[23]：0.1 g樣品油與8 mL、2%NaOH-CH3OH溶液充分混勻，在(80±1) ℃水浴中回流，直至油滴消失。從回流冷凝器上端加入7 mL、15%BF3-CH3OH充分混勻，在(80±1) ℃水浴中繼續(xù)回流2 min，用少量水沖洗回流冷凝器。停止加熱，從水浴上取下燒瓶，迅速冷卻至室溫。準確加入10～30 mL正己烷，振搖2 min，再加入飽和氯化鈉水溶液，靜置分層。吸取上層正己烷提取溶液大約5 mL，至25 mL試管中，加入大約3～5 g無水硫酸鈉，振搖1 min，靜置5 min，吸取上層溶液待測。

色譜參考條件：GC條件：色譜柱：Rtx-WAX (30 m×0.32 mm×0.25 μm)；溫度程序：200 ℃恒溫分析；載氣(N2)，流速：1.0 mL/min，進樣量：1 μL，分流比：20∶ 1。

1.6 數(shù)據(jù)分析與處理

運用Design Expert 12軟件處理數(shù)據(jù)，使用Origin Pro 8.6、Excel軟件畫圖，進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同pH對香柚籽油得率的影響

在先添加1.2%纖維素酶(50 ℃，pH 6.0)培養(yǎng)1 h，再添加1.2%堿性蛋白酶(50 ℃)酶解4.5 h ，氯化鈣與原料比為1∶4一次加入的條件下，考察堿性蛋白酶不同pH對香柚籽油得率的影響。由圖1可知，在pH為6～8時，隨著pH的增加，香柚籽油的得率也逐漸增大；在pH為8～10范圍內(nèi)，隨著pH的增加，香柚籽油的得率逐漸降低，這可能是因為繼續(xù)增大pH會對堿性蛋白酶的活性起到強烈抑制作用，降低了酶的活性，進而導致香柚籽油得率降低。因此，最終選擇pH 8作為提取條件。

圖1 各因素對香柚籽油得率的影響

2.2 不同酶添加量對香柚籽油得率的影響

在先添加纖維素酶(50 ℃，pH 6.0)培養(yǎng)1 h，再添加堿性蛋白酶(50 ℃，pH 8.0)酶解4.5 h，氯化鈣與原料比為1∶4一次加入的條件下，考察不同酶添加量對香柚籽油得率的影響。由圖1可知，在酶添加量為0.6%～1.4%時，隨著酶添加量的增加，香柚籽油的得率逐漸增大；在酶添加質(zhì)量分數(shù)為1.4%～2.0%時，隨著酶添加量的繼續(xù)增加，香柚籽油的得率逐漸趨于穩(wěn)定。分析原因可能是因為在酶解過程中，充分的底物與添加適量酶作用，從而使香柚籽油得率增大；繼續(xù)增加酶添加量，底物量有限，過量酶會對油脂產(chǎn)生吸附作用，使酶在體系中香柚籽的表面附著，從而影響油脂的釋放，得率趨于穩(wěn)定。因此，最終選擇酶添加量1.4%作為提取條件。

2.3 不同酶解溫度對香柚籽油得率的影響

在先添加1.2%纖維素酶(50 ℃，pH 6.0)培養(yǎng)1 h，再添加1.2%堿性蛋白酶(pH 8.0)酶解4.5 h， 氯化鈣與原料比為1∶4一次加入的條件下，考察不同酶解溫度對香柚籽油得率的影響。由圖1可知，在酶解溫度為40～50 ℃時，隨著酶解溫度的增加，香柚籽油的得率也逐漸增大；在酶解溫度為50～60 ℃時，隨著酶解溫度的繼續(xù)增加，香柚籽油的得率逐漸降低。分析原因可能是因為在一定的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高可以增加分子的運動和擴散作用，反應速度增大，從而香柚籽油的得率逐漸增大；然而當溫度超過酶的最適溫度時，酶的中心結(jié)構(gòu)受影響，酶的催化活性降低，從而得率降低。因此，最終選擇酶解溫度50 ℃作為提取條件。

2.4 不同酶解時間對香柚籽油得率的影響

在先添加1.2%纖維素酶(50 ℃，pH 6.0)培養(yǎng)1 h，再添加1.2%堿性蛋白酶(50 ℃，pH 8.0)進行酶解， 氯化鈣與原料比為1∶4一次加入的條件下，考察不同酶解時間對香柚籽油得率的影響。由圖1可知，在酶解時間為3～5 h時，隨著反應時間的增加，香柚籽油的得率也逐漸增大；在酶解時間為5～6.5 h范圍內(nèi)，隨著酶解時間的繼續(xù)增加，香柚籽油的得率先下降再逐漸趨于穩(wěn)定。分析原因可能是因為隨著酶解時間的延長，細胞結(jié)構(gòu)逐步被打開，酶與底物作用越來越充分，油脂的釋放量相應增多，從而得率明顯升高；當酶解時間為5～6.5 h時，底物逐漸減少，酶解趨于充分，隨著時間繼續(xù)延長，乳化油部分逐漸增多，使清油的分離受阻，影響油脂分離及品質(zhì)[24]，從而香柚籽油的得率稍有下降并逐漸趨于穩(wěn)定。因此，最終選擇酶解時間5 h作為提取條件。

2.5 不同CaCl2加入方式對香柚籽油得率的影響

在先添加1.2%纖維素酶(50 ℃，pH 6.0)培養(yǎng)1 h，再添加1.2%堿性蛋白酶(50 ℃，pH 8.0)酶解4.5 h， 氯化鈣與原料比為1∶4加入的條件下，考察不同CaCl2加入方式對香柚籽油得率的影響。由圖2可知，CaCl2在一次加入時，得率最大；未添加時得率最低，分批加入和取乳液加入得率較低，分析原因可能是因為過量Ca+能有效地抑制乳狀液的形成，有利于游離油的形成，從而得率最好；在酶解期間分批加入 CaCl2，連續(xù)添加Ca+會導致乳化劑和穩(wěn)定劑的總水平降低，從而得率會降低；在酶解期間取乳液加入CaCl2，不能有效地抑制乳狀液的形成；未加入CaCl2時，形成的乳狀液抑制了得率，從而得率最差。因此，最終選擇CaCl2一次加入作為提取條件。

圖2 不同CaCl2加入方式對香柚籽油得率的影響

2.6 不同氯化鈣與原料比對香柚籽油得率的影響

在先添加1.2%纖維素酶(50 ℃，pH 6.0)培養(yǎng)1 h，再添加1.2%堿性蛋白酶(50 ℃，pH 8.0)酶解4.5 h，一次加入CaCl2的條件下，考察不同氯化鈣與原料比對香柚籽油得率的影響。由圖1可知，在氯化鈣與原料比為1∶2～1∶4時，隨著添加比例的增加，香柚籽油的得率也逐漸增大；在氯化鈣與原料比為1∶4～1∶6時，隨著添加比例的繼續(xù)增加，香柚籽油的得率逐漸減少。分析原因可能是因為在低氯化鈣與原料比的情況下，反應體系流動性差，不利于酶與底物相互作用；而氯化鈣與原料比過高時，較低的酶濃度和底物濃度不利于發(fā)揮蛋白酶活性，酶解不充分，從而得率降低[25]。因此，最終選擇氯化鈣與原料比1∶4作為提取條件。

2.7 響應面法優(yōu)化實驗

2.7.1 響應面實驗設計與結(jié)果

在單因素實驗的基礎上，綜合顯著性差異分析，根據(jù)Box-BeHnken響應面設計原理，運用Design Expert 12軟件，選擇pH(A) 、酶解溫度(B) 、酶解時間(C) 、氯化鈣與原料比(D) 四個因素為自變量，每個因素設計3個水平，具體因素水平見表1。

表1 香柚籽油氯化鈣破乳輔助水酶法提取工藝響應面實驗因素水平

每組實驗重復3次以估計誤差，以得率(Y)為響應值，設計四因素三水平的響應面分析，對工藝參數(shù)進行優(yōu)化，響應面實驗設計及結(jié)果見表2。

表2 香柚籽油氯化鈣破乳輔助水酶法提取工藝響應面實驗設計及結(jié)果

續(xù)表2

2.7.2 模型的建立和顯著性分析

利用Design Expert 12軟件對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，結(jié)果見表3。

表3 香柚籽油氯化鈣破乳輔助水酶法提取工藝響應面回歸方程模型方差分析

通過對表3數(shù)據(jù)進行回歸分析，可以得到二次多項回歸方程為：Y=36.87+0.079 2A-0.006 7B-0.041 7C-0.105 8D+0.015 0AB-0.337 5AC-0.410 0AD-0.062 5BC+0.012 5BD+0.045 0CD-1.52A2-1.21B2-1.35C2-1.61D2。

2.7.3 兩因子間交互作用分析

由響應面及等高線結(jié)果可知，相對于pH與酶解溫度、pH與酶解時間、酶解溫度與酶解時間、酶解溫度與氯化鈣與原料比、酶解時間與氯化鈣與原料比的交互作用來說，pH與氯化鈣與原料比的交互作用最顯著。這與表3中方差分析的結(jié)果一致。

由響應面分析結(jié)果和表3中F值可以看出，四個因素對香柚籽油得率的影響大小順序為D(氯化鈣與原料比)>A(pH)>B(酶解溫度)>C(酶解時間)。

2.7.4 氯化鈣破乳輔助水酶法提取江永香柚籽油工藝的確定及驗證實驗

利用Design Expert 12軟件分析得出水酶法提取香柚籽油的最佳工藝為：pH 8.152，酶解溫度49.974 ℃，酶解時間4.965 h，氯化鈣與原料比為1∶4.474。在此條件下模型預測香柚籽油得率為36.85%。考慮到試驗的可行性，將最佳條件調(diào)整為：pH 8.0，酶解溫度50 ℃，酶解時間5 h，氯化鈣與原料比為1∶4。在此條件下進行3次平行實驗，所得香柚籽油得率為37.21%，與理論預測值的相對誤差為0.98%，說明該模型給出的工藝參數(shù)可靠。

2.8 香柚籽油理化指標分析

2.8.1 香柚籽油過氧化值

過氧化值是評定油脂品質(zhì)的重要指標之一，反映的是油脂氧化酸敗的程度。江永香柚籽油過氧化值為(0.20±0.01) mmol/kg。由此可見，水酶法反應條件溫和，對抗氧化物的損傷較少，香柚籽油氧化程度較低，在標準范圍內(nèi)，水酶法提取香柚籽油的品質(zhì)較好。

2.8.2 香柚籽油酸價

酸價是油脂中游離狀態(tài)下脂肪酸含量的標志，在日常生活中人們通常用酸價高低作為衡量油脂質(zhì)量標準之一。江永香柚籽油的酸價為(0.75±0.16)mg/g，在標準范圍內(nèi)，水酶法引起香柚籽油的油脂酸敗成度低。

2.8.3 香柚籽油碘價

碘價是評價食用油品質(zhì)的重要指標。江永香柚籽油的碘價為(111.70±0.05) g/100 g ，在標準范圍內(nèi)，表明該油脂易在體內(nèi)吸收分解。

2.8.4 香柚籽油皂化值

皂化值是反應脂肪酸分子量大小的指標。江永香柚籽油的皂化值為(188.51±0.05) mg/g，在標準范圍內(nèi)，水酶法提取香柚籽油的脂肪酸平均分子量較小。

2.8.5 香柚籽油脂肪酸組成

江永香柚籽油色澤金黃，澄清透明，具有油脂固有的氣味和滋味，并帶有柚子的獨特香味，感官品質(zhì)良好。本實驗測定的香柚籽油中不飽和脂肪酸達到75.96%，說明江永香柚籽油脂肪酸比例組成較好，適合用于食用油的開發(fā)。

3 結(jié)論

研究氯化鈣破乳輔助水酶法提取江永香柚籽油的工藝條件，采用雙酶分步水解，在先添加纖維素酶(50 ℃，pH 6.0)水解1 h后，再按照1∶1的比例進行后續(xù)堿性蛋白酶的水解條件的優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在pH 8.0、酶添加質(zhì)量分數(shù)1.4%、酶解溫度50 ℃、酶解時間5 h、一次加入氯化鈣，氯化鈣與原料比為1∶4的條件下，香柚籽油得率最高，為37.21%；并對最終提取得到的香柚籽油的酸價、碘價、皂化值、過氧化值進行了測定，均在國家標準限量范圍內(nèi)。綜上所述，采用氯化鈣破乳輔助水酶法是一種高效、環(huán)保的香柚籽油制備工藝，為促進食用油的提取提供了一種快速有效的方法。