紫蘇籽粕蛋白源抗氧化肽的純化、結(jié)構(gòu)鑒定及體外抗氧化活性

范三紅， 賈槐旺， 李 蘭， 白寶清

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1，太原 030006)(山西大學(xué)特色植物資源研究與利用山西重點實驗室2，太原 030006)

紫蘇(perillafrutescens)，古稱茬，又名蘇麻，屬我國衛(wèi)生部首批頒布的藥食同源的60種中藥之一[1,2]。紫蘇原產(chǎn)于我國中南部地區(qū)及喜馬拉雅山脈，分布位置較廣泛，韓國、日本、不丹、印尼等國均有廣泛種植，我國主要以湖南、山西、東北等地種植[3]。紫蘇在我國具有兩千多年的藥用歷史，其味辛、性溫，具有行氣、鎮(zhèn)痛、利尿、順氣、散寒和化痰之功效，《圖經(jīng)本草》《本草綱目》等多版中國藥典均有記錄，是一種古老的經(jīng)濟作物[4]。紫蘇適應(yīng)性強，種植簡單，管理容易，在我國南北部的荒坡、河灘、溝邊等廣大地區(qū)都可種植。紫蘇富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、微量元素及維生素等多種生物活性物質(zhì)，具有抗過敏[5]、抑菌[6]、消炎[7]、提高免疫力、降血脂、降血壓[8]、抗氧化、預(yù)防細(xì)胞衰老癌變等作用[9]。紫蘇籽粕是紫蘇籽榨油后的殘留物，目前我國紫蘇籽粕最大的流向依然是作為畜禽飼料，開發(fā)、利用和深加工依然不完善，這不僅是對資源的浪費而且還會造成環(huán)境污染[10]。

天然和合成的抗氧化劑通常用于生物系統(tǒng)中的自由基清除。合成抗氧化劑既有效又便宜，然而由于其毒性和對人體健康的副作用，其使用受到嚴(yán)格管制[11]。天然來源的抗氧化活性肽由于其結(jié)構(gòu)簡單、分子質(zhì)量低，與合成化合物相比具有較大優(yōu)勢[12]。趙換維[13]使用提取的杏鮑菇蛋白制備杏鮑菇多肽并研究其體外抗氧化活性，結(jié)果表明不同分子質(zhì)量的杏鮑菇多肽均可實現(xiàn)對自由基活性的有效清除，由此證明杏鮑菇多肽具有良好的抗氧化活性。張維等[14]通過超聲破碎法提取鹿茸總多肽,并測定其不同處理時間獲得鹿茸總多肽的蛋白濃度;通過細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞增殖活性檢測研究鹿茸總多肽的抗炎活性，結(jié)果表明，通過超聲法提取的鹿茸總多肽能夠抑制LPS,誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞IL-6的高表達，具有抗炎作用。賀東亮[15]通過檢測經(jīng)紫蘇籽肽PSP3c灌胃后小鼠血液和肝臟組織中多種酶的活力了解PSP3c對小鼠抗氧化能力的影響，結(jié)果顯示紫蘇籽多肽PSP3c能夠保護機體免受自由基的攻擊，提高小鼠抗氧化能力。

本實驗通過閃式提取工藝提取紫蘇籽粕蛋白，選取堿性蛋白酶Alcalase對其進行酶解，采用超濾法、DEAE-32離子交換層析以及Sephadex G-25凝膠層析對酶解物進行分離純化，并對分離純化后的多肽組分進行抗氧化性跟蹤測定，篩選出抗氧化性較強的組分，并測定其分子質(zhì)量及氨基酸序列，以期為紫蘇籽粕蛋白的開發(fā)及其酶解活性肽在功能性食品中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇籽粕、堿性蛋白酶(2.0×104U/g)、鄰苯三酚、DPPH、ABTS、DEAE-32、G-25Sephadex、乙腈Acetonitrile(A/0626/17)、TCEP(646547)、MMTS(208795)、胰酶(V5280)、甲酸FA(64186)、碳酸氫銨(A6141)、尿素(0568)、10 Ku超濾管(OD 010C33)，試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JHBE-20V實驗型閃式提取器，SK-1030超聲波清洗儀，868 pH測試儀，SP-2000UV紫外可見分光光度計，SCIENTZ-12N冷凍干燥機，BS-100A自動部分收集器，HD-21-1核酸蛋白檢測儀，TH-100梯度混合器，BT-100數(shù)顯蠕動泵，Dionex Ultimate 3000 RSLCnano-Q Exactive 液質(zhì)聯(lián)用儀。

1.3 方法

1.3.1 紫蘇籽粕蛋白的提取流程

紫蘇籽粕→去雜、粉碎、過篩、脫脂→配制成一定料液比→調(diào)節(jié)pH→閃式提取→離心機去渣→取上清液調(diào)節(jié)pH為等電點→離心→蛋白質(zhì)沉淀→真空冷凍干燥→密封低溫保存。

1.3.2 單因素實驗

以蛋白提取率為考察指標(biāo)，選擇閃提pH(8、9、10、11、12)、閃提時間(10、20、30、40、50 s)、閃提速率(1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 r/min)及料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)4個因素進行單因素實驗，考察各因素對蛋白提取率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理，選取A閃提時間、B料液比、C閃提pH 3個主要影響因素為獨立變量，以蛋白提取率(Y)為響應(yīng)值設(shè)計三因素三水平實驗方案，其因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面實驗因素和水平

1.3.4 紫蘇籽粕蛋白酶解產(chǎn)物的制備

以最優(yōu)工藝條件下制備的紫蘇籽粕蛋白為原料，參考賀東亮[15]的方法，經(jīng)酶解工藝優(yōu)化，確定選用堿性蛋白酶Alcalase進行酶解，酶解工藝條件為：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、pH 9.5、酶解溫度60 ℃、酶用量7%、酶解時間4 h為最佳酶解條件。酶解結(jié)束后經(jīng)沸水浴10 min滅活，4 500 r/min離心10 min，取上清液即為紫蘇籽粕蛋白酶解產(chǎn)物。

1.3.5 超濾法分離抗氧化活性肽

使用裝有截留分子質(zhì)量為3、5、10 ku的聚醚砜超濾膜，在二氧化碳壓力為2.5×104Pa下依次對紫蘇籽粕蛋白酶解液進行超濾，得到分子質(zhì)量分別為<3、3～5、5～10 ku以及>10 ku的4種不同分子質(zhì)量段的超濾組分，真空冷凍干燥以測定抗氧化活性，獲得抗氧化活性最強的紫蘇籽粕多肽超濾組分[16]。

1.3.6 DEAE纖維素DE-32離子交換層析分離抗氧化活性肽

將抗氧化活性最強的多肽超濾組分，利用DEAE纖維素DE-32離子交換層析繼續(xù)分離純化，選用20 mm×400 mm規(guī)格層析柱，用50 mmol/L Tris-HCl(pH 8)的緩沖液平衡柱床，上樣量3 mL，用0～1 mol/L NaCl平衡緩沖液進行梯度洗脫，流速為1.5 mL/min，紫外檢測波長220 nm。將所得分離組分冷凍干燥以測定抗氧化活性，篩選出抗氧化活性最好的組分用于后續(xù)凝膠色譜的分離純化。

1.3.7 凝膠色譜Sephadex G-25分離抗氧化活性肽

使用凝膠色譜Sephadex G-25繼續(xù)分離純化經(jīng)離子交換層析分離獲得的抗氧化活性最好的多肽組分，選用16 mm×300 mm規(guī)格層析柱，洗脫條件為：用100 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)的平衡緩沖溶液，上樣量3 mL，洗脫流速0.5 mL/min，紫外檢測波長220 nm。分離純化后的組分冷凍干燥以測定其抗氧化活性，將抗氧化能力最強的組分進行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.3.8 紫蘇抗氧化肽氨基酸序列質(zhì)譜分析

1.3.8.1 蛋白酶水解

蛋白液加4 μL 0.05 mol/L TCEP 溶液，60 ℃反應(yīng)1 h；還原后，加入2 μL 55 mmol/L MMTS溶液，室溫避光45 min；將蛋白液加入10 ku 超濾管，12 000 g離心20 min；加入100 μL UA(8 mol/L尿素pH 8.5)溶液，12 000 g離心20 min,離心2次；加入100 μL 0.25 mol/L TEAB,12 000 g離心20 min，重復(fù)3次；加入50 μL 0.5mol/L TEAB，加入2%胰酶(胰酶與蛋白質(zhì)量比為1∶50)，37 ℃孵育過夜(12 h)；次日補加1%胰酶(胰酶與蛋白質(zhì)量比為1∶100)，37 ℃孵育4 h；更換新的收集管，離心收集濾液，低溫真空抽干[17]。

1.3.8.2 質(zhì)譜鑒定

肽段用樣品溶解液(0.1%甲酸、2%乙腈)溶解， 13 200 r/min，4 ℃離心20 min，取上清，進行質(zhì)譜鑒定。

液相參數(shù)：捕集柱：Acclaim PepMap RSLC C18(300 μm 5 mm, 5 μm, 10 nm)；分析柱：Acclaim PepMap C18(75 μm×150 mm, 3 μm，10 nm)；流動相A∶0.1%甲酸、流動相B∶0.1%甲酸，80%CAN、流速：300 nL/min；梯度分離：B相從5%上升至90%(0 min-5%、5 min-5%、45 min-50%、50 min-90%、55 min-90%、65 min-5%)。

分離后的肽段直接進入質(zhì)譜儀Thermo Scientific Q Exactive進行在線檢測，具體參數(shù)為：一級質(zhì)譜參數(shù)，分辨率：70 000、AGC：目標(biāo)3e6、最大噴射時間：40 ms、掃描范圍：350～1 800m/z；二級質(zhì)譜參數(shù)， 分辨率：17 500、AGC 目標(biāo)：1e5、最大噴射時間：60 ms、TopN ：20、NCE / stepped NCE：27。

1.3.9 抗氧化能力測定

1.3.9.1 DPPH自由基清除能力測定

取3 mL待測溶液，加入1mL DPPH·乙醇溶液(40 μg/mL)，避光放置30 min，測定吸光度A1(517 nm)；3 mL蛋白溶液和1 mL乙醇溶液(40 μg /mL)混合，測定吸光值A(chǔ)2；3 mL乙醇和1 mL DPPH·乙醇溶液(40 μg /mL)混合測定吸光度值A(chǔ)0[18]，DPPH自由基清率除按式(1)進行計算。

(1)

1.3.9.2 超氧陰離子清除能力測定

依次加入pH 8.2的Tris-HCL緩沖液6 mL和3 mL待測溶液，37 ℃恒溫10 min，加入1 mL鄰苯三酚溶液(3 mmol/L)，反應(yīng)4 min，用0.5 mL的鹽酸(0.5 mol/L)結(jié)束反應(yīng)，測吸光度(320 nm)值A(chǔ)1，以蒸餾水代替蛋白溶液和鄰苯三酚分別測吸光度A0和A2；超氧陰離子清除率按式(1)進行計算[19]。

1.3.9.3 羥自由基清除能力測定

加入1 mL FeSO4(9 mmol/L)溶液、1mL水楊酸-乙醇溶液(9 mmol/L)、1 mL待測溶液，最后加入1 mL H2O2啟動反應(yīng)，37 ℃水浴30 min，510 nm處測定吸光度A1；用蒸餾水分別代替H2O2和蛋白溶液測定吸光度A2和A0；羥自由基清除率按式(1)進行計算[20]。

1.3.9.4 ABTS自由基清除能力的測定

加入0.1 mL待測溶液，加入3.9 mL ABTS工作液，混勻精確反應(yīng)6 min，734 nm下測定吸光度值A(chǔ)1；以無水乙醇和蒸餾水分別代替工作液和蛋白溶液測定吸光度值A(chǔ)2和A0；ABTS自由基清除率按式(1)進行計算[21]。

1.3.9.5 鐵離子還原能力測定

1 mL的待測溶液、1 mL磷酸緩沖液(pH 6.6)和1 mL鐵氰化鉀(1%)混勻，50 ℃水浴20 min，冷卻至室溫，加入1 mL三氯乙酸(10%)，3 000 r/min離心10 min，2 mL上清液、 2 mL蒸餾水和1 mL三氯化鐵(0.1%)混勻，反應(yīng)10 min，在700 nm處測定吸光度[22]。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析

每組樣品重復(fù)測試3次，所有的實驗數(shù)據(jù)均以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，實驗結(jié)果采用Origin 8.5軟件繪制圖表，采用Design Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken設(shè)計及分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

如圖1所示，在測試pH范圍內(nèi)，當(dāng)pH為8～10時，提取率隨pH的增大而升高；當(dāng)pH為10時提取率為46.2%，達到最大值。pH為10～12時，提取率快速下降，可能是強堿導(dǎo)致蛋白開始變性，閃提加快了蛋白分子與強堿的接觸，使蛋白質(zhì)的變性速率增快，導(dǎo)致提取率下降[23]。在閃提時間從10～30 s時間段，提取率隨時間的增加不斷升高；閃提時間30 s時提取率達到最大45.8%。繼續(xù)延長閃提時間，蛋白提取率開始緩慢下降，可能的原因是原料蛋白達到限定條件下的最大溶解且與提取液充分接觸，提取率已無上升空間，而隨著閃提時間延長，高速運轉(zhuǎn)的閃提器轉(zhuǎn)子與提取物摩擦產(chǎn)生的高溫使得料液溫度升高進而導(dǎo)致部分蛋白因高溫產(chǎn)生變性[24]。在閃提速率1 000～3 000 r/min內(nèi)，提取率隨著閃提速率的增加而升高；這是因為不斷增速的閃提進一步加速了蛋白的溶解；當(dāng)閃提速率達到3 000 r/min時，提取率達到最大44.9%。繼續(xù)增加轉(zhuǎn)速，高轉(zhuǎn)速加快了轉(zhuǎn)子與提取物的摩擦導(dǎo)致料液溫度升高，高溫使部分蛋白質(zhì)開始變性從而使得提取率開始逐漸降低[25]。在測試料液比范圍內(nèi)以1∶20為分界點，蛋白提取率先逐漸升高后逐漸降低；因為隨著料液比的擴大，蛋白與提取液接觸面積增大，加速了蛋白的溶解，從而使得提取率不斷增加；繼續(xù)擴大料液比的比值，提取體系變大，短時間的閃提操作不能使得蛋白完全溶出，從而導(dǎo)致蛋白提取率不升反降[15]。根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取pH 10、堿提時間20 min、閃提速率3 000 r/min、料液比1∶20為最佳閃式提取單因素。

圖1 閃式提取紫蘇籽粕蛋白單因素實驗

2.2 響應(yīng)面實驗

以單因素實驗結(jié)果為依據(jù)，依據(jù)Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理，采用閃提時間(A)、料液比(B)和閃提pH(C)中影響顯著的中心值，以紫蘇籽粕蛋白提取率為指標(biāo)做響應(yīng)面分析實驗，響應(yīng)面實驗方案及結(jié)果見表2使用Design Expert8.0.6軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，構(gòu)造提取工藝參數(shù)回歸模型。紫蘇籽粕蛋白提取率為Z值，得出閃提時間(A)、料液比(B)和閃提pH(C)的二次多項回歸預(yù)測模型方程：

Z=46.64+0.50A-0.57B+1.06C+1.05AB-0.70AC-0.16BC-4.84A2-1.55B2-3.15C2。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

表3 回歸模型各因素方差分析

經(jīng)Design-Expert 8.0.6軟件分析可得最佳工藝條件為料液比1∶19.08、閃提pH 10.17 、閃提時間30.19 s，相應(yīng)的響應(yīng)面二次模型預(yù)測紫蘇籽粕蛋白提取率為46.78%。為驗證該響應(yīng)面法的可行性，考慮到實際操作的可行性，選取料液比1∶20、閃提pH 10、閃提時間30 s，修正條件下進行3次平行實驗，結(jié)果表明紫蘇籽粕蛋白提取率穩(wěn)定在(46.54±0.17)%，與預(yù)測值基本相同，說明該實驗?zāi)Ｐ涂梢暂^好地預(yù)測紫蘇籽餅粕蛋白的實際提取效果，具有應(yīng)用價值。

2.3 紫蘇籽粕蛋白抗氧化能力測定

圖2 紫蘇籽粕蛋白的抗氧化活性

2.4 超濾分離純化組分的抗氧化性分析

但也有研究表明小分子質(zhì)量的多肽不一定都具有最強的抗氧化活性，張爽等[29]研究發(fā)現(xiàn)鮑魚外套膜酶解物分子質(zhì)量<1 ku組分的羥自由基和DPPH自由基清除力要弱于分子質(zhì)量為3～5 ku的組分，說明肽的抗氧化活性與其分子質(zhì)量大小相關(guān)，但同時也可能受到其氨基酸的序列及組成的影響。

注：a為指標(biāo)測試最小值；aa為與所測指標(biāo)最小值比較差異顯著(P<0.05)；AA為與所測指標(biāo)最小值比較差異極顯著(P<0.01)。以1 mg/mL的質(zhì)量濃度測試DPPH自由基清除活性、3 mg/mL的質(zhì)量濃度測試自由基清除能力和鐵離子還原能力，下同。圖3 紫蘇籽粕蛋白酶解液和超濾分離級分的抗氧化活性

2.5 DEAE纖維素DE-32離子交換層析分離純化紫蘇抗氧化肽

圖4 離子層析分離純化分子質(zhì)量<3 ku紫蘇籽抗氧化肽

圖5 離子層析分離純化分子質(zhì)量<3 ku紫蘇籽抗氧化肽各組分的抗氧化活性

2.6 凝膠色譜Sephadex G-25分離純化紫蘇抗氧化肽

圖6 凝膠層析分離純化紫蘇籽抗氧化肽D1

圖7 凝膠層析分離純化紫蘇籽抗氧化肽D1后各組分抗氧化活性

表4 紫蘇籽粕蛋白水解物中獲得的抗氧化活性肽的純化匯總

2.7 紫蘇抗氧化肽分子質(zhì)量及氨基酸序列測定

如圖8所示，通過LC-MS-MS鑒定，分析并獲得G1的準(zhǔn)確MS數(shù)據(jù)，該肽段由15個氨基酸組成，荷質(zhì)比m/z為672.39，分子質(zhì)量為1 718.82 u，其氨基酸序列為EMPYIASMGIYVVSK，即谷氨酸(Glu)- 蛋氨酸(Met)- 脯氨酸(Pro)- 酪氨酸(Tur)- 異亮氨酸(lle)- 丙氨酸(Ala)- 絲氨酸(Ser)- 蛋氨酸(Met)- 甘氨酸(Gly)- 異亮氨酸(lle)- 酪氨酸(Tyr)- 纈氨酸(Val)- 纈氨酸(Val)- 絲氨酸(Ser)- 賴氨酸(Lys)。較短的肽(5～16個氨基酸)比分子質(zhì)量較大的多肽表現(xiàn)出更強的抗氧化活性，這是因為它具有更好的穿過腸道屏障的能力，并且與自由基的相互作用更容易[30]。一些氨基酸對于肽的抗氧化活性至關(guān)重要，含有疏水性氨基酸的肽有助于其脂質(zhì)溶解度的增加，從而有助于增加其抗氧化活性[31]。此外，疏水性氨基酸能夠通過疏水性締合促進肽進入靶器官，便于其發(fā)揮抗氧化特性。因此，本實驗中經(jīng)純化獲得的抗氧化活性肽G1組分中存在的疏水性氨基酸殘基lle、Pro、Tyr、Ala和Val，在抗氧化活性肽能夠有效清除自由基的過程中起到重要的作用。

圖8 抗氧化肽G1組分的質(zhì)譜分析圖

3 結(jié)論