漢麻籽粕酶解物中抗肝癌Hep3B細(xì)胞活性肽的分離與鑒定

魏連會(huì)， 董 艷， 石 杰， 宋淑敏， 李國(guó)巍， 孫興榮

(黑龍江省科學(xué)院大慶分院1，大慶 163319)(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大慶分院2，大慶 163316)

漢麻(CannabissativaL)也稱為火麻、漢麻、線麻、黃麻等，是一種一年生草本植物，廣泛種植在中國(guó)和加拿大等地區(qū)[1]，是工業(yè)用途漢麻纖維、種子、油和粕的重要原料來源[2,3]。其中四氫大麻酚(Δ-9-tetrahydrocannabinol, THC)質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于0.3%，為無(wú)毒品種。目前在世界各地幾十個(gè)國(guó)家已被批準(zhǔn)種植和加工[4]，并已被用于開發(fā)系列漢麻產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于化妝品、功能性食品和營(yíng)養(yǎng)保健品行業(yè)[5]。漢麻籽的藥用功效在2000年版《藥典》和2001年“藥食同源”名單中均有記載[6]。漢麻籽中含有不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)，以及所有人體必需氨基酸[7]。

漢麻籽蛋白經(jīng)水解后產(chǎn)生的漢麻籽多肽具有多種健康功效和藥用價(jià)值。其生物活性已經(jīng)被證實(shí)，如抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)[8]、抑制腎素[9]、抑制乙酰膽堿酯酶(AChE)[10]、金屬結(jié)合能力[11]、抗氧化活性[12]、降膽固醇作用[13]和血糖調(diào)節(jié)作用[14]。

肝癌是一種常見的惡性腫瘤，是世界范圍內(nèi)發(fā)病和死亡的主要疾病之一[15，16]。目前，主要的肝癌化療藥物有5-氟尿嘧啶(5-FU)、順鉑、紫草素等，這些藥物有嚴(yán)重的副作用且價(jià)格昂貴[17]。因此，尋找一個(gè)既便宜又高效且副作用小的化療藥物迫在眉睫。多肽，除了具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值外，還有其他的生物活性，其中包括抗癌作用。相比傳統(tǒng)藥物、多肽具有高親和力、強(qiáng)特異性、低毒性和充足的組織滲透[18]。一些研究已經(jīng)證明食源性蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸對(duì)癌細(xì)胞凋亡、血管生成具有調(diào)節(jié)作用，顯示出抗腫瘤的潛力，這些肽具有抗腫瘤、抗增殖、抗炎等作用[19]，這些肽的抗癌活性主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬或凋亡，如玉米肽、綠豆肽和大豆肽等[20-24]。然而，漢麻籽多肽的抗癌作用及具有抗癌活性的多肽的結(jié)構(gòu)鑒定鮮見報(bào)道。

多肽的結(jié)構(gòu)決定著生物活性肽的生理功能，明確氨基酸的組成對(duì)揭示構(gòu)效關(guān)系具有重要的意義[25，26]。因此，在本研究中，利用復(fù)合蛋白酶酶解漢麻籽粕，制備了漢麻籽蛋白水解物，通過超濾分離對(duì)漢麻籽多肽進(jìn)行初步純化，測(cè)定漢麻籽多肽的抗肝癌Hep3B細(xì)胞作用，采用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定多肽結(jié)構(gòu)，最后通過合成漢麻籽多肽進(jìn)一步驗(yàn)證其抗肝癌活性，旨在為漢麻籽抗肝癌活性肽的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

漢麻籽粕水解物；木瓜蛋白酶(酶活力為 8×105U/g)、中性蛋白酶(酶活力為 1.3×105U/g)； Hep3B 細(xì)胞；人正常肝細(xì)胞L02。

1.2 儀器與設(shè)備

4800 Plus MALDI TOF/TOFTM分析儀，AB SCIEX質(zhì)譜儀，pellicon 切向流過濾系統(tǒng)，F(xiàn)D-2A-80型真空冷凍干燥機(jī)，800TS酶標(biāo)儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 漢麻籽粕酶解物制備與多肽的分離純化

稱取一定質(zhì)量漢麻籽粕，按照1∶5的比例加入蒸餾水溶解，加入5.0%的中性蛋白酶，0.4%的木瓜蛋白酶，酶解pH為5.5，酶解溫度為75 ℃，酶解時(shí)間為3 h，95 ℃水浴滅酶15 min，10 000 r/min離心15 min，分離取漢麻籽粕上清液。將酶解得到的漢麻籽粕酶解液，通過切向流膜過濾系統(tǒng)，進(jìn)行分離純化，采用的過濾膜截留分子質(zhì)量為3 ku，收集分子質(zhì)量小于3 ku漢麻籽多肽肽段，用真空冷凍干燥機(jī)凍干備用。

1.3.2 漢麻籽多肽抗肝癌Hep3B 細(xì)胞活性研究

1.3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將肝癌Hep3B肝癌細(xì)胞系和LO2正常肝細(xì)胞在含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%牛血清(FBS)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2.2 細(xì)胞活力研究

采用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力。將肝癌Hep3B細(xì)胞和正常LO2細(xì)胞接種于96孔板中，每孔體積為200 μL(細(xì)胞數(shù)約為每孔 4×104個(gè)/mL)，向每孔中加入不同質(zhì)量濃度的漢麻籽多肽(0、0.5、1、2、5、10、20 mg/mL)孵育24 h，向每孔滴加噻唑藍(lán)溶液(終質(zhì)量濃度為 5 mg/mL)，放回培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)2 h， 然后取出上清液將孔內(nèi)的培養(yǎng)液小心吸出，使用 PBS 輕輕的沖洗 1～3次。吸走 PBS后，每孔加入100 μL的 DMSO 溶劑，并放在搖床上慢速混勻 15 min。用酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度(A490)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.3 漢麻籽多肽組分的分子質(zhì)量分布范圍測(cè)定

采用MALDI-TOF 基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)漢麻籽粕酶解物的分子質(zhì)量范圍進(jìn)行測(cè)定[27]。

1.3.4 漢麻籽抗肝癌活性肽組分的氨基酸序列分析

采用 MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜重新進(jìn)行肽段測(cè)序，具體操作如下：取1 μL漢麻籽多肽樣品點(diǎn)至樣品靶上，自然干燥后，再取1 μL CHCA基質(zhì)溶液點(diǎn)至對(duì)應(yīng)靶位上并自然干燥，用相同方法在樣品靶位相鄰靶位上點(diǎn)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品干燥，用相同方法在樣品靶位相鄰靶位上點(diǎn)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品(4 700蛋白質(zhì)組學(xué)分析交叉校準(zhǔn)混合物1)。

校準(zhǔn)混合物1進(jìn)行外標(biāo)一級(jí)校準(zhǔn)，分子質(zhì)量誤差小于0.5 u；采集圖譜條件：一級(jí)質(zhì)譜(MS)范圍：800～4 000m/z，每張譜圖累加500個(gè)激光光束；選擇供試品目標(biāo)多肽對(duì)應(yīng)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜測(cè)試(MS/MS)，每張譜圖累加2 500個(gè)激光光束，在主要參數(shù)固定的前提下，分別調(diào)整激光強(qiáng)度和碰撞室(CID)氣體氣壓來獲取最佳譜圖。

1.3.5 抗肝癌活性多肽的合成及功能驗(yàn)證

以獲得的抗肝癌活性多肽為目標(biāo)，委托上海某公司進(jìn)行合成，共合成YGRDEISVF、NPEDEFEKIR、RSSPGALDKFVSG、NKSGTYSNDDLSH 4種多肽，并對(duì)合成多肽的純度與一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。同時(shí)，測(cè)定不同濃度合成多肽對(duì)肝癌Hep3B細(xì)胞的抑制活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 漢麻籽多肽抗肝癌活性的研究

如圖1所示，以不同質(zhì)量濃度(0、0.5、1、2、5、10、20 mg/mL) 漢麻籽多肽處理細(xì)胞24 h后，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力。結(jié)果表明，在一定的濃度范圍內(nèi)，漢麻籽多肽可有效抑制Hep3B肝癌細(xì)胞的增殖，降低細(xì)胞存活率，但不影響LO2正常肝細(xì)胞的生長(zhǎng)，隨著漢麻籽多肽濃度的增加，漢麻籽多肽對(duì)肝癌Hep3B細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。

圖1 漢麻籽多肽對(duì)Hep3B細(xì)胞存活率的影響

2.2 漢麻籽多肽的分子質(zhì)量分布測(cè)定

為獲得漢麻籽生物功能肽，利用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解漢麻籽粕。采用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析漢麻籽多肽超濾分離組分的分子質(zhì)量，分布范圍如圖2所示。生物活性肽通常含有2～20個(gè)氨基酸并具有多種生物活性。由圖2可知，漢麻籽多肽的分子質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果表明，多肽的分子質(zhì)量主要在200～1 500 ku范圍內(nèi)，說明得到的漢麻籽多肽主要是由2～10個(gè)氨基酸殘基組成的小肽段。宋淑敏等[27]研究表明，寡肽尤其是二肽或三肽，較容易被人體有效吸收并經(jīng)人體小腸黏膜利用。因此，漢麻籽多肽也可能被人體有效吸收，從而發(fā)揮其生物學(xué)作用。

圖2 漢麻籽多肽的分子質(zhì)量分布

2.3 漢麻籽多肽的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

根據(jù)多肽組分的分子質(zhì)量分布，采用MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜重新進(jìn)行肽段的測(cè)序，對(duì)4個(gè)峰值較高的肽段進(jìn)行序列分析，多肽序列分析結(jié)果及質(zhì)譜如表1，共鑒定出4種多肽序列，分別是YGRDEISVF、NPEDEFEKIR、RSSPGALDKFVSG、NKSGTYSNDDLSH。

表1 漢麻籽多肽的氨基酸序列分析

2.4 多肽合成及活性測(cè)定

合成多肽YGRDEISVF、NPEDEFEKIR、RSSPGALDKFVSG、NKSGTYSNDDLSH的純度分別為98.90%、98.03%、99.90%、98.63%同時(shí)對(duì)合成多肽的抗肝癌Hep3B細(xì)胞活性進(jìn)行測(cè)定，如圖3所示。結(jié)果表明，漢麻籽多肽YGRDEISVF和NKSGTYSNDDLSH具有很強(qiáng)的抗肝癌細(xì)胞增殖作用。

注：LO2-正常肝臟細(xì)胞；Hep3B為人肝癌細(xì)胞。a～d分別為合成多肽YGRDEISVF、NPEDEFEKIR、RSSPGALDKFVSG、NKSGTYSNDDLSH。圖3 合成多肽對(duì)肝癌Hep3B 細(xì)胞的存活率的影響

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)漢麻籽粕進(jìn)行酶解，利用超濾系統(tǒng)分離純化，得到分子質(zhì)量小于3 ku 的小分子多肽。探究漢麻籽多肽的抗肝癌作用，實(shí)驗(yàn)證明了漢麻籽多肽能夠抑制肝癌Hep3B 細(xì)胞的增殖，同時(shí)對(duì)正常的肝細(xì)胞無(wú)毒副作用。采用質(zhì)譜分析漢麻籽多肽的分子質(zhì)量分布范圍及其高峰值的序列特征，鑒定了4種小肽的氨基酸序列為YGRDEISVF、NPEDEFEKIR、RSSPGALDKFVSG、NKSGTYSNDDLSH。經(jīng)固相合成，合成肽的分子質(zhì)量分別為1 085.20、1 276.35、1 320.30、1 437.20 u，其純度分別為98.90%、98.03%、99.90%、98.63%。同時(shí)，合成多肽YGRDEISVF、NKSGTYSNDDLSH具有很強(qiáng)的抗肝癌細(xì)胞增殖作用。