乳化大豆油與乳化豬油對(duì)肌原纖維蛋白/面筋蛋白凝膠的影響

歐陽園園， 鄭 志

(合肥工業(yè)大學(xué)，合肥 230601)

火腿、香腸等肉糜制品中維持結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)主要是肌原纖維蛋白(myofibrillar protein, MP)，其對(duì)產(chǎn)品的口感、組織結(jié)構(gòu)具有重要作用，并且具有良好的與水結(jié)合的能力及與脂肪顆粒結(jié)合的能力[1, 2]。在肉糜制品生產(chǎn)加工過程中，會(huì)添加一定量的植物蛋白，如小麥面筋蛋白(WG)，來提高產(chǎn)品蛋白含量，增強(qiáng)肉糜制品的口感[3-5]。

傳統(tǒng)肉糜制品會(huì)添加較高含量的動(dòng)物脂肪，具有優(yōu)良的風(fēng)味、口感，受到許多消費(fèi)者青睞[6,7]。但動(dòng)物脂肪含量較高在生產(chǎn)過程中，容易出現(xiàn)產(chǎn)品組織粗劣，硬度差、彈性低以及出油等問題，影響產(chǎn)品質(zhì)量[8]。一些研究嘗試在香腸、肉丸等產(chǎn)品中添加植物油，希望改善口感和質(zhì)地[9,10]。有研究發(fā)現(xiàn)直接將植物油加入肉糜中，油脂的氧化性會(huì)增加，影響凝膠的持水性和質(zhì)構(gòu)，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得疏松，油脂也容易聚集發(fā)生崩塌現(xiàn)象[11, 12]。脂肪的預(yù)乳化是以大豆蛋白、面筋蛋白或肌原纖維蛋白自身作為乳化劑預(yù)乳化脂肪，脂肪在高速剪切作用下會(huì)形成小分子的脂肪球膜蛋白，依靠共價(jià)或非共價(jià)作用與連續(xù)相蛋白基質(zhì)相交聯(lián)[13]。馬龍彪[14]發(fā)現(xiàn)將乳化的植物油添加到鹿肉香腸中，可獲得較好的香腸口感。Liu等[15]發(fā)現(xiàn)預(yù)乳化的花生油可以提高魚糜凝膠的白度和持水性，并通過增大油滴的表面積增強(qiáng)凝膠體系的穩(wěn)定性。目前，通過直接添加植物油來改善肉糜制品的品質(zhì)的研究有較多報(bào)道，而添加預(yù)乳化處理的植物油和豬油對(duì)肉糜蛋白凝膠的機(jī)理研究還有待于擴(kuò)展和深化。

本研究選用肌原纖維蛋白/面筋蛋白作為研究的對(duì)象，探討預(yù)乳化豬油和預(yù)乳化大豆油對(duì)肌原纖維蛋白/面筋蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)、持水性能、蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，并且進(jìn)一步明確脂肪在預(yù)乳化作用下與蛋白的相互作用及穩(wěn)定機(jī)制，為促進(jìn)植物脂肪代替動(dòng)物脂肪，開發(fā)高附加值、更健康的肉產(chǎn)品提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥面筋蛋白(蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%)、TG酶(1 000 U/g)、豬里脊肉、豬板油。

1.2 儀器與設(shè)備

10N-50A低溫冷凍干燥機(jī)，TA-XT Plus 質(zhì)構(gòu)儀，F(xiàn)J300-SH 高速剪切乳化機(jī)，DSC-500B 差示掃描量熱儀，F(xiàn)rontier傅里葉紅外光譜儀。

1.3 方法

1.3.1 凝膠制備

1.3.1.1 肌原纖維蛋白的提取

根據(jù)Wang等[16]的方法稍作修改，所有步驟均在2～4 ℃下進(jìn)行。將切好的肉糜分散在4倍體積的緩沖液(0.1 mol NaCl，10 mmol磷酸鈉，2 mmol MgCl2，1 mmol EDTA，pH 7.0)中，用攪拌器高速勻漿60 s，轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min，棄去上層清液。將沉淀溶解在上述的磷酸鹽分離緩沖液中，勻漿60 s后，轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min，同樣的步驟重復(fù)3次。將得到的沉淀置于4倍體積的0.1 mol NaCl緩沖液中，重復(fù)3次相同的離心、勻漿、洗滌處理。沉淀即為肌原纖維蛋白，備用。

1.3.1.2 預(yù)乳化液的制備

根據(jù)Wu等[17]方法，豬板油切成1 cm×1 cm×1 cm的方塊，100 ℃加熱至液體油脂析出，降至室溫后，紗布過濾2次，備用。在60 mL 10 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液中加入40 mL豬油，高速剪切機(jī)16 000 r/min下剪切2 min，30 s 1次，分4次完成，得到預(yù)乳化豬油。同樣的操作過程，得到預(yù)乳化大豆油。

1.3.1.3 復(fù)合凝膠制備

參照前人方法并做調(diào)整[18,19]，將1.6 g的面筋蛋白添加到 50 mL 50 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液中制成蛋白分散液。將制得的大豆油與豬油乳化液分別與蛋白分散液混合均勻，得到含有0、5%、10%、15%、20%脂肪的蛋白分散液。每組分散液中都加入90 U/g的TGase，用保鮮膜封口，45 ℃保溫2 h，然后放入90 ℃水浴中加熱10 min，取出冰水浴至室溫，并冷藏24 h，待測。

1.3.2 凝膠性能測定

1.3.2.1 質(zhì)構(gòu)測定

根據(jù)Wang等[20]方法，將凝膠切成2 cm×2 cm×2 cm的方塊，采用物性儀測定凝膠的質(zhì)構(gòu)。選擇P/36R的探頭，調(diào)整測試前、后速度為2 mm/s、測試速度為1 mm/s，接觸的觸發(fā)力為5 g，凝膠壓縮的距離為10 mm?？刂苾纱螠y定的時(shí)間間隔為5 s。

1.3.2.2 持水含量測定

在Wang等[21]方法上略微調(diào)整。取3 g凝膠樣品于10 mL離心管中，5 000 r/min條件下離心20 min，濾紙吸去水分，計(jì)算得出失去水分的質(zhì)量mr。將離心后的凝膠樣品置于小燒杯中，置于120 ℃的烘箱中，烘至恒重，計(jì)算得出凝膠中總含水量mt。

式中：mr為肌原纖維蛋白/面筋蛋白凝膠離心前、后失去的水分質(zhì)量/g；mt為凝膠中總含水量/g。

1.3.2.3 可凍結(jié)水與非凍結(jié)水測定

根據(jù)Li等[22]方法測定可凍結(jié)水與非凍結(jié)水的含量，稍作修改。稱取10～15 mg凝膠樣品置于固體鋁鍋中，密封。將樣品坩堝置于傳感器上，空鋁鍋為空白對(duì)照，控制氮?dú)饬魉俜€(wěn)定為50 mL/min，以5 ℃/min的速度將溫度從-50 ℃升溫至20 ℃。根據(jù)每克樣品在0 ℃時(shí)的熔融焓與純水的熔融焓(334 J/g)比值，計(jì)算可凍結(jié)水(mf)的含量。非凍結(jié)水(mnf)由公式確定。

mnf=mt-mf

式中：mt為相同質(zhì)量凝膠樣品用烘干法測得的總含水量。

1.3.3 分子間作用力測定

采用Gómez - Guillén等[23]和Qin等[24]方法，略有改動(dòng)。取0.1 g凍干后的肌原纖維蛋白/面筋蛋白凝膠樣品于10 mL的離心管中，每個(gè)離心管中都加入5 mL緩沖液，搖勻后靜置1 h，保證充分反應(yīng)，轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心20 min，測定上清蛋白含量。緩沖液為：A液(0.05 mol NaCl的溶液)；B液(0.6 mol NaCl的溶液)；C液(0.6 mol氯化鈉的溶液+1.5 mol的脲素)；D液(0.6 mol氯化鈉的溶液+8 mol的脲素)；E液(0.6 mol NaCl+8 mol的脲素+0.5 mol/L β-巰基乙醇)，緩沖液均用0.05 mol的磷酸緩沖溶液為溶劑。其中緩沖液A和B的蛋白含量之間的差異表示離子鍵的作用，緩沖液B和C的蛋白含量差異表明氫鍵作用，緩沖液C與D蛋白含量差異表明疏水相互作用，緩沖液D與E蛋白含量差異表明二硫鍵的作用。

1.3.4 FTIR的測定蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

采用吳曉娟等[25]方法，冷凍干燥的凝膠與溴化鉀研磨，壓片。FTIR進(jìn)行掃描，掃描的波段范圍為4 000～400 cm-1，掃描的次數(shù)為32次。用軟件Omnic 8.0對(duì)酰胺I帶1 600～1 700 cm-1波段的圖譜進(jìn)行分析，校正基線、去卷積以及二階導(dǎo)數(shù)擬合。根據(jù)峰面積計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)操作至少重復(fù)6次，以平均值表示結(jié)果。使用軟件Origin 8．0軟件和SPSS對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合和顯著性分析(P<0.05 )。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)構(gòu)分析

乳化大豆油與乳化豬油對(duì)凝膠咀嚼性、彈性、硬度和膠黏性的影響，如表1所示。添加了0%～20%乳化豬油與乳化大豆油對(duì)肌原纖維蛋白/面筋蛋白凝膠的硬度、彈性、咀嚼性和膠黏性都顯著性提高(P<0.05)，且添加大豆油的樣品指標(biāo)都略優(yōu)于添加豬油的樣品。硬度、彈性的提高是由于高剪切作用使脂肪顆粒體積變小，易于進(jìn)入蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的細(xì)小空隙，促使凝膠網(wǎng)絡(luò)更加致密；且有報(bào)道油脂與蛋白進(jìn)行預(yù)乳化后，有助于鹽溶性蛋白形成凝膠結(jié)構(gòu)，改善的凝膠結(jié)構(gòu)[26]。

表1 乳化大豆油和乳化豬油添加量對(duì)MP/WG凝膠硬度、彈性、咀嚼性、膠黏性的影響

2.2 持水性分析

凝膠的持水性是凝膠另一重要指標(biāo)，持水性是決定凝膠穩(wěn)定性的重要參數(shù)，反映了凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)截留水分的能力，高的持水性表明凝膠內(nèi)部水分結(jié)合牢固，加熱過程中水分不易流失。乳化大豆油與乳化豬油對(duì)肌原纖維蛋白/面筋蛋白凝膠持水性的影響，如圖1所示。對(duì)比添加乳化豬油和乳化大豆油的實(shí)驗(yàn)組發(fā)現(xiàn)，兩組之間持水性沒有出現(xiàn)明顯差異，然而添加脂肪的肌原纖維蛋白/面筋蛋白凝膠的持水性能比空白對(duì)照凝膠明顯提高(P<0.05)。持水性的增加是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與脂質(zhì)分子在高速剪切作用下，分散成較小顆粒，被束縛在致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。Wu等[17]在研究中得出，脂肪表面膜蛋白和肌原纖維蛋白的相互作用可以提高凝膠網(wǎng)絡(luò)的保水能力。

圖1 乳化大豆油和乳化豬油添加量對(duì)MP/WG凝膠的持水性的影響

2.3 可凍結(jié)水與非凍結(jié)水分析

差示掃描量熱法可以用來分析蛋白凝膠中水分的存在狀態(tài)，水分的存在狀態(tài)會(huì)影響凝膠的持水性[27]。圖2是不同脂肪添加量(乳化大豆油和乳化豬油)的肌原纖維蛋白/面筋蛋白凝膠DSC曲線圖，計(jì)算得出肌原纖維蛋白/面筋蛋白凝膠中的可凍結(jié)水和非可凍結(jié)水含量，如表2所示。由圖2可知，肌原纖維蛋白/面筋蛋白凝膠隨著乳化大豆油和乳化豬油添加量的增加吸熱峰逐漸向低溫段移動(dòng)，從3 ℃(未添加油脂)逐漸降低到0 ℃以下。

圖2 不同乳化油添加量的MP/WG凝膠的DSC圖

由表2可知，隨著脂肪添加量的增加，凝膠中可凍結(jié)水的含量逐漸降低，而非可凍結(jié)水的含量逐漸增加(P<0.05)。非可凍結(jié)水指在-40～25 ℃范圍內(nèi)沒有發(fā)生相變，依然與蛋白質(zhì)、油脂等其他物質(zhì)結(jié)合的水[27]，其含量的增加表明復(fù)合凝膠隨著油脂添加量的增加，體系中緊密結(jié)合的水含量也在增加，具體表現(xiàn)為肌原纖維蛋白/面筋蛋白凝膠的持水性增加。

表2 乳化大豆油和乳化豬油添加量對(duì)MP/WG凝膠的水分狀態(tài)的影響/%

2.4 分子間作用力分析

乳化大豆油與乳化豬油對(duì)肌原纖維蛋白/面筋蛋白凝膠分子間作用力的影響，如圖3所示。肌原纖維蛋白/面筋蛋白凝膠中的相互作用力主要為非共價(jià)作用和共價(jià)作用，共價(jià)作用包括TGase介導(dǎo)異肽鍵和二硫鍵，非共價(jià)有包括離子鍵、氫鍵和疏水相互作用。由圖3可知，隨乳化油脂添加量的增加，維持肌原纖維蛋白/面筋蛋白凝膠結(jié)構(gòu)的作用力主要是二硫鍵，與添加乳化豬油的凝膠相比，添加乳化大豆油的凝膠維持凝膠結(jié)構(gòu)的相互作用還包括疏水相互作用和氫鍵。高速剪切作用形成的小分子油脂顆粒，與蛋白接觸表面積增大，利于氫鍵、二硫鍵的形成，促進(jìn)網(wǎng)絡(luò)空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，外在表現(xiàn)為乳化穩(wěn)定性及持水性的增加[5,19]。這也進(jìn)一步解釋復(fù)合凝膠持水性能增加的原因。離子鍵作用減小可能是由于疏水相互作用及氫鍵的增加改變了蛋白的空間結(jié)構(gòu)，更多的疏水基團(tuán)暴露出來，從而改變了蛋白的電荷，導(dǎo)致形成的離子鍵減少。

圖3 乳化大豆油和乳化豬油添加量對(duì)MP/WG凝膠中分子間作用力的影響

2.5 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的分析

圖4是不同乳化大豆油和乳化豬油添加量的肌原纖維蛋白/面筋蛋白凝膠紅外譜圖。由圖4可知，隨著乳化大豆油添加量的增加，肌原纖維蛋白/面筋蛋白凝膠酰胺Ⅰ帶的峰逐漸向右偏移，酰胺Ⅲ帶(1 230～1 350 cm-1)的峰強(qiáng)逐漸增加。通過Omnic 8.0對(duì)紅外圖譜的酰胺I帶進(jìn)行分析，凝膠中蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量如表3所示，不同添加量乳化大豆油與乳化豬油的肌原纖維蛋白/面筋蛋白凝膠的各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量發(fā)生顯著變化。乳化大豆油與乳化豬油添加量的增加對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生相似的影響，表現(xiàn)為α-螺旋結(jié)構(gòu)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊和β-轉(zhuǎn)角，Herrero等[28]和Shao等[29]也得出相似研究結(jié)果。有報(bào)道表明酰胺Ⅲ帶的峰強(qiáng)的增加β-折疊結(jié)構(gòu)的含量有一定關(guān)系[30]。β-折疊含量的提高利于產(chǎn)品硬度的增加，賦予產(chǎn)品更好的質(zhì)構(gòu)[31]，這也從另一方面解釋了凝膠的硬度、彈性、咀嚼性增加。

圖4 不同乳化大豆油添加量的MP/WG凝膠紅外譜圖

表3 酰胺Ⅰ帶估算不同乳化大豆油和乳化豬油添加量的MP/WG凝膠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量

3 結(jié)論

大豆油與豬油的預(yù)乳化處理能夠顯著改善添加脂肪的肌原纖維蛋白/面筋蛋白凝膠性能。隨著乳化大豆油和乳化豬油添加量的增加，凝膠的硬度，彈性、咀嚼性、持水性等均顯著升高，維持蛋白質(zhì)、脂肪顆粒及水分子間的主要相互作用力為二硫鍵；蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變由α-螺旋逐漸轉(zhuǎn)化為β-折疊和β-轉(zhuǎn)角。當(dāng)乳化脂肪添加量大于15%時(shí)，凝膠的硬度、咀嚼性仍呈增高趨勢，持水性、彈性無明顯增加。添加同比例的大豆油與豬油時(shí)，添加乳化大豆油的肌原纖維蛋白/面筋蛋白凝膠的彈性、咀嚼性以及硬度等質(zhì)構(gòu)較優(yōu)于添加乳化豬油的凝膠而持水性上沒有顯著增加。