三相分配法在食品組分提取方面的研究進展

徐正行, 余俊文, 朱雪洋, 謝亮亮, 鄭立友, 謝 丹

(安徽工程大學生物與食品工程學院，蕪湖 241000)

溶劑萃取技術(shù)是食品工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最為廣泛的生物分離技術(shù)[1]，常用于從天然食品原料中提取和利用生物大分子如油脂、蛋白質(zhì)、碳水化合物以及其他生物活性物質(zhì)，但溶劑萃取法需要消耗大量的有機溶劑，這些溶劑對環(huán)境污染大，不易回收，且存在安全風險，對于小型工廠來說難以滿足安全生產(chǎn)的要求。此外，在實際生產(chǎn)中，溶劑萃取一般僅可針對一種或一類生物大分子實現(xiàn)有效提取，無法將多種成分同時分離。1972年，Tan等[2]首次提出三相分配(three phase partitioning，TPP)法，該法安全、綠色、高效、適用性廣且成本低廉，可以同時從原料中提取蛋白質(zhì)、油脂、多糖等生物大分子[3]。本文圍繞TPP法在食品組分提取中的應(yīng)用，首先概括其特點，再系統(tǒng)闡述提取劑及提取條件對不同食品組分提取效率的影響，在此基礎(chǔ)上，總結(jié)耦合其他輔助技術(shù)的TPP法提取強化工藝，并且介紹TPP法同時提取分配多種生物大分子的研究進展。

1 TPP法提取食品組分的特點

通常情況下，叔丁醇與水會完全混溶，在TPP法工藝中，通過加入適量硫酸銨鹽使叔丁醇與水相分層。食品原料中通常含有蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)在適宜條件下會作為第3相在上叔丁醇相和下水相之間形成中間相。整個系統(tǒng)中極性(水)和非極性(叔丁醇)溶劑的存在使得該過程同時具有分離和純化多種食品組分的作用，從上到下依次為有機相(油脂及脂溶性物質(zhì))、蛋白質(zhì)層、水相(多糖類等水溶性物質(zhì))。

工業(yè)上提取油脂多采用以己烷為提取助劑的溶劑浸出法，該法便捷高效，但是己烷高度易燃且不環(huán)保[4]，可與大氣中的其他污染物反應(yīng)生成臭氧和光化學氧化劑。在TPP法中，一般采用叔丁醇作為有機相，其不僅具有良好的油溶性，而且沸點也高于正己烷，這就使TPP法在提取油脂時更安全可靠[5]。醇沉法、離子交換色譜法、膜分離法是提取和純化蛋白質(zhì)的常用方法，但這些方法或成本和時間要求高，或難以擴大規(guī)模，并且有些萃取溶劑甚至對蛋白質(zhì)的性質(zhì)產(chǎn)生影響。TPP法中通過硫酸銨的鹽析作用可以獲得蛋白質(zhì)，成本低廉、提取高效，并且溫和的提取條件保證了蛋白質(zhì)的性質(zhì)[6]。多糖的傳統(tǒng)純化方法為乙醇沉淀法，此法雖能提取出大量的多糖，但是往往醇沉不徹底，且多糖提取物中易混有油脂、蛋白質(zhì)等，致使原料利用率較低，其次醇沉過程也存在耗時長、乙醇使用量大等問題[7]。TPP法利用所形成的三相將多糖與蛋白質(zhì)、油脂分開，操作更簡便高效，并且條件溫和，可持續(xù)操作，大大提高了原料的利用率[8]。

目前關(guān)于TPP法在食品領(lǐng)域的研究中，多數(shù)學者專注于蛋白質(zhì)和酶的回收和純化，較少數(shù)的學者則專注于脂質(zhì)、小分子有機化合物和碳水化合物的回收和純化[3]，對于不同的食品組分，TPP法各因素對其提取效率的影響也各不相同。

2 TPP法對食品組分提取效率的影響因素

2.1 提取劑的影響

2.1.1 硫酸銨

2.1.1.1 硫酸銨對油脂提取的影響

一般來說，食品原料中的油脂存在于油體中，即包裹在含油種子的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中。在TPP法中，硫酸銨的飽和點(最大需求量)取決于沉淀該網(wǎng)絡(luò)中的蛋白質(zhì)并釋放出油脂所需要的量，超過飽和點會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性。此外，隨著硫酸銨濃度的增加，體系離子強度增加，導(dǎo)致甘油三酯分解為脂肪酸和甘油，產(chǎn)油率降低[9]。

Dutta等[9]采用控制變量法在室溫條件下研究硫酸銨濃度對大麻油提取率的影響，大麻油得率隨硫酸銨質(zhì)量濃度升高而升高，但到達最適提取質(zhì)量分數(shù)(5.58%)后，大麻油得率反而下降。Panadare等[10]也發(fā)現(xiàn)，伴隨著硫酸銨質(zhì)量濃度的增加，蘋果籽油得率隨著蛋白質(zhì)沉淀量的增加而增加，在最適硫酸銨質(zhì)量分數(shù)(40%)下，油脂得率可達25.24%，在此之后繼續(xù)升高硫酸銨濃度，蘋果籽油的提取率略有減少。此外，在提取嗜糖小球藻脂質(zhì)時，30%的硫酸銨質(zhì)量濃度下，TPP法可以獲得69.05%的微藻脂質(zhì)提取效率[11]。這些研究均說明了對于不同的油脂，采用的最佳硫酸銨質(zhì)量濃度也不相同。

2.1.1.2 硫酸銨對蛋白質(zhì)提取的影響

硫酸銨能顯著影響蛋白質(zhì)的溶解性，低濃度的硫酸銨鹽會使帶各種帶電基團的蛋白質(zhì)溶解到溶液中，提高蛋白質(zhì)溶解度。但達到最大的蛋白質(zhì)溶解度后，鹽濃度的增加將導(dǎo)致可用于溶解蛋白質(zhì)的溶劑減少，蛋白質(zhì)出現(xiàn)沉淀[12]。

2.1.1.3 硫酸銨對多糖的影響

Tan等[14]在利用TPP法純化蘆薈多糖時發(fā)現(xiàn)，在26.35%的鹽濃度下蘆薈多糖的提取率最高，隨著鹽濃度的增加，蘆薈多糖的提取率逐漸降低，他們對此現(xiàn)象的解釋是較強的鹽析作用使溶解蘆薈多糖的自由水減少，硫酸銨使蘆薈多糖絮凝，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)移到中間相，造成下層水相中蘆薈多糖的減少。因此，在以提取多糖成分為TPP法的主要目標時，選取合適的硫酸銨濃度也至關(guān)重要。

2.1.2 叔丁醇

與正己烷、丙酮、甲醇或乙醇等常用提取溶劑相比，叔丁醇的易燃性要小得多，且沸點較高(84 ℃)，同時不易滲透到折疊的蛋白質(zhì)分子中導(dǎo)致其變性。此外，Dutta等[9]曾比較叔丁醇、乙醇、異丙醇和正辛醇在分配系數(shù)、相對極性和三相形成鹽要求方面的差異，發(fā)現(xiàn)叔丁醇具有較高的分配系數(shù)和最低的相對極性。雖然正辛醇與叔丁醇相比具有更高的分配系數(shù)，但它不需要加入銨鹽就可將混合物分相，無法分離出蛋白質(zhì)；較低的相對極性使叔丁醇在TPP法中更易與水分離，所以綜合來看叔丁醇是TPP法中最佳的萃取溶劑。

2.1.2.1 叔丁醇對油脂提取的影響

Tan等[4]采用酶輔助TPP法從亞麻籽中提取油脂，發(fā)現(xiàn)當所用叔丁醇質(zhì)量分數(shù)從24.47%增加到49.29%時，亞麻籽油得率顯著增加；當叔丁醇質(zhì)量分數(shù)大于49.29%時，得率沒有明顯增加，這說明在提取過程中需要足夠濃度的叔丁醇才能充分提取油脂，但過量叔丁醇僅會增加提取成本，對提取率的升高影響不顯著。

2.1.2.2 叔丁醇對蛋白質(zhì)提取的影響

Sharma等[15]的研究表明，在提取小麥胚芽淀粉酶抑制劑時，原料粗提物與叔丁醇的比例很重要，漿料和叔丁醇1∶1的比例可使酶得到最大純化效果。在此濃度下，叔丁醇很容易與沉淀的蛋白質(zhì)結(jié)合，增加蛋白質(zhì)的浮力，使其浮在水相表面，利于高效分離。如果叔丁醇的用量較少，它就不能與硫酸銨發(fā)揮協(xié)同作用；而高濃度的叔丁醇會與鹽離子爭奪水分子，導(dǎo)致大量的水從鹽層中脫出，產(chǎn)生鹽析效果，同時很可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，并阻礙蛋白質(zhì)沉淀。

2.1.2.3 叔丁醇對多糖提取的影響

Wang等[13]利用TPP法提取米糠中的多糖時，當料漿與叔丁醇的比例為1∶1時，米糠多糖的最大得率達到2.06%，隨著叔丁醇比例的增加，米糠多糖在水相的分配效果下降，米糠多糖提取率降低。Yan等[16]在提取河蜆多糖的過程中同樣發(fā)現(xiàn)，當叔丁醇與粗提物的比例為1∶1時，河蜆多糖的得率最高(9.57%)，進一步提高叔丁醇用量會導(dǎo)致分配體系界面張力的增加，提取率開始下降。

2.2 提取條件的影響

2.2.1 pH

在TPP法工藝過程中，pH會影響蛋白質(zhì)中氨基酸的離子化，進而影響帶電蛋白質(zhì)分子間的作用力，改變食品組分在各相中的分配作用[17]，表1列舉了溶液pH對TPP法提取油脂、蛋白質(zhì)和水溶性成分的影響。

一般來說，當三相系統(tǒng)的pH高于目標提取蛋白質(zhì)的pI等電點時，蛋白質(zhì)帶有負電荷并主要向底層水相移動并富集；三相體系pH與蛋白質(zhì)pI接近時，硫酸銨與目標蛋白質(zhì)之間的相互作用最小，影響目標蛋白質(zhì)分離效果；當三相系統(tǒng)的pH低于目標提取蛋白質(zhì)的pI時，蛋白質(zhì)帶有正電荷，此時溶液中硫酸銨電離出的硫酸根離子可與蛋白質(zhì)正電荷結(jié)合，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)緊縮、沉淀析出，在中間層沉淀和富集[18,19]。在提取油脂時，合適的pH條件下會促進氫離子和蛋白質(zhì)與硫酸鹽的相互作用，引起最大程度蛋白質(zhì)沉淀，提高油脂提取率。同時，需要注意，pH會影響所提蛋白質(zhì)及活性成分的性質(zhì)。

表1 溶液pH對TPP法提取食品組分的影響

2.2.2 溫度

TPP工藝過程通常使用低溫，這有利于散發(fā)溶劑或鹽沉淀產(chǎn)生的熱量，確保蛋白質(zhì)不變性[22]。各種研究報道稱在TPP法中獲得高提取率的最佳溫度范圍通常為20～40 ℃，但關(guān)于這一結(jié)論也存在一些爭議[12]。如表2所示，在具體提取某一食品組分時，由于原料的不同和各種外界因素的不確定性，最適溫度很難統(tǒng)一。此外，若提取過程不在密封條件下，當溫度升高到40 ℃以上時，叔丁醇揮發(fā)性增加，可用于萃取的溶劑體積較小，不足量的叔丁醇會降低與硫酸銨的協(xié)同作用，從而降低食品組分的提取率?？紤]到成本的因素，萃取過程中采用的溫度越高，能耗越大。

表2 提取溫度對TPP法提取食品組分的影響

2.2.3 提取時間

提取時間關(guān)系到提取產(chǎn)品的得率、質(zhì)量和所需的成本，是評判提取效率的重要參考數(shù)據(jù)，最佳的提取時間應(yīng)綜合考慮。如表3所示，不同提取原料甚至相同原料的不同組分提取的最適TPP提取時間也不相同。

表3 提取時間對TPP法提取食品組分的影響

2.3 實驗各因素影響大小

提取劑和提取條件均會影響TPP法的提取效率。表4列舉了部分文獻對于TPP法單因素影響實驗的結(jié)果，可以看出基于提取原料及目標提取組分的不同，各因素對于TPP法的影響并完全不相同，這表明在實際操作中，應(yīng)根據(jù)提取物質(zhì)選擇合適的工藝參數(shù)。

表4 TPP法各因素對不同食品組分提取效率的影響大小

3 TPP法提取工藝強化

TPP法提取效率相較于普通萃取技術(shù)具有很大的優(yōu)勢，但也存在傳質(zhì)問題[25]，將TPP法與一些輔助工藝進行耦合，可大幅度提升提取效果。

3.1 酶預(yù)處理/酶輔助TPP(EATPP)法

在TPP法提取食品組分前融入酶解技術(shù)，可以幫助目標組分從細胞中快速釋放，從而提高TPP工藝的效率。但對于不同的提取物質(zhì)，所需要的酶也不完全相同。

Varakumar等[21]在TPP法提取姜黃樹脂前，先使用淀粉酶和纖維素酶對姜粉進行預(yù)處理，分解其淀粉和纖維素，顯著提高了油脂和姜辣素的產(chǎn)量。Tan等[4]發(fā)現(xiàn)，TPP法提取亞麻籽油時，使用纖維素酶、蛋白酶、果膠酶(1∶1∶1)混合物預(yù)處理的亞麻籽油提取率高于使用單一酶或使用兩種混合酶。嚴梅榮等[28]利用EATPP法提取米糠油，發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶可以提高米糠油脂產(chǎn)率，提油效率高于單純TPP法以及纖維素酶預(yù)處理組、木瓜蛋白酶預(yù)處理組，但中性蛋白酶與纖維素酶或木瓜蛋白酶混用并沒有得到更高的提油率。

3.2 超聲輔助TPP(UATPP)法

超聲波是一種過程強化手段，在TPP法中應(yīng)用超聲波有助于破碎細胞壁、減小油料的粒徑，改善細胞間的傳質(zhì)[29，30]。如果懸浮液含有粉末狀細胞，顆粒表面的空化現(xiàn)象會對細胞壁造成破壞，并增強整個細胞的擴散，更易于物質(zhì)的提取[21]。

目前UATPP法已經(jīng)被很多學者所認可。表5列舉了UATPP法的相關(guān)文獻，UATPP工藝不僅提高了產(chǎn)品得率，還大大縮短了TPP法工藝的時間，使得提取過程更加高效。

3.3 高壓均質(zhì)預(yù)處理

高壓均質(zhì)被認為是最好的細胞分離技術(shù)，其通過給細胞懸浮液施加高壓，導(dǎo)致細胞壁破裂，隨后釋放細胞內(nèi)成分[37]，該技術(shù)易于擴大在工業(yè)生產(chǎn)中。目前采用高壓均質(zhì)預(yù)處理的TPP法應(yīng)用較少，僅有幾篇文獻用于油脂提取方面。Mulchandani等[11]采用高壓均質(zhì)預(yù)處理，然后以TPP法提取嗜糖小球藻脂類，脂質(zhì)提取率達到72.25%；當溶液經(jīng)過10次均質(zhì)處理后，脂質(zhì)提取率可進一步提高至89.91%。此外，他們還將高壓均質(zhì)與超聲波處理進行了對比，他們認為在脂質(zhì)回收方面，均質(zhì)的提取效果遠比超聲波好。

3.4 其他處理方法

除這幾種輔助手段促進TPP法的提取效率，還有微波輔助三相分配[38]、宏親配體促進三相分配(MFLTPP)[39]、基于離子液體的三相分配(ILTPP)[40]等圍繞著三相分配體系進行改進的輔助方法，從一定程度上提高了TPP法的提取效率。

表5 UATPP法的相關(guān)文獻

4 TPP法同時提取多種產(chǎn)物的研究進展

4.1 TPP法從兩相中提取產(chǎn)物

紫蘇是一種芳香草本植物，可提供優(yōu)質(zhì)油脂和蛋白質(zhì)[41]。Pintathong等[6]采用TPP法提取紫蘇油脂和蛋白，在粗提物與叔丁醇的比例1∶2、30%硫酸銨的提取體系中，油脂得率為35.13%，蛋白質(zhì)得率為13.18%。由該法提取的紫蘇油得率高于冷榨提取法(28.60%)，與使用己烷作為溶劑的索氏提取法(35.20%)相近，且TPP法提取的油脂中亞麻酸的含量均高于這兩種方法。同時，與傳統(tǒng)的油脂和蛋白質(zhì)的提取方法相比，使用TPP法大約節(jié)省了14倍的時間。研究還發(fā)現(xiàn)由該法提取出的油和蛋白質(zhì)是保濕面霜產(chǎn)品良好的基料。

裂殖壺菌由于富含二十二碳六烯酸(DHA，俗稱腦黃金)，是一種很有前景的海洋微藻。此外，海藻多糖也是一種具有良好的抗氧化功能的活性成分。Chen等[42]采用TPP法提取裂殖壺菌的油脂和多糖，利用復(fù)合蛋白酶水解細胞壁和油體促進細胞中油脂和多糖的釋放，在最優(yōu)條件下油脂得率為35.69%、多糖得率為5.16%。相比于產(chǎn)油率低且易使蛋白質(zhì)變性的壓榨法和易造成溶劑浪費及環(huán)境污染的溶劑萃取法來說，TPP法具有極大的提取優(yōu)勢。

蘆薈富含多種生物活性物質(zhì)，其中的蘆薈多糖是蘆薈凝膠的主要生物活性成分，具有多種保健功能；蘆薈中獨特的蛋白質(zhì)有延緩皮膚老化的作用，具有很高的利用價值。Tan等[14]將干燥后的蘆薈果肉粉溶于水，制得蘆薈粗漿，將TPP法與透析膜聯(lián)用，可將蘆薈多糖的純度由粗漿中的28.4%提高到81.7%，純化蛋白的濃度遠高于粗提物的濃度。該法所獲得蘆薈多糖的濃度遠高于醇沉法[43]、且比離子交換色譜法與凝膠滲透色譜法節(jié)約更多的時間成本[44]，且同時獲得的蘆薈蛋白大大提升了產(chǎn)品附加值。

4.2 TPP法同時從三相中提取產(chǎn)物

米糠是糙米碾白過程中的加工副產(chǎn)物，富含蛋白、脂肪、膳食纖維、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)素[45]。米糠油富含不飽和脂肪酸，具有抗高脂血癥和抗氧化作用，屬于功能性油脂；米糠蛋白質(zhì)的氨基酸組成符合FAO/WHO的標準，是理想的營養(yǎng)保健食品的蛋白質(zhì)強化劑；米糠多糖在增強免疫力和預(yù)防腫瘤方面表現(xiàn)出良好的生理活性。但是米糠在我國的利用率很低，造成了極大的食物資源浪費，要提高米糠的利用率，提取技術(shù)無疑是最大的突破點。Wang等[13]采用TPP法從米糠中同時提取油脂、蛋白質(zhì)和多糖，利用響應(yīng)面分析得出最佳條件是硫酸銨質(zhì)量濃度28%、料漿與叔丁醇體積比1∶1.1、pH 5.10、提取溫度40 ℃、提取時間1 h，成功分離出油脂(得率17.28%)、蛋白質(zhì)(得率6.81%)和多糖(得率2.09%)，且該法所提取的米糠油、米糠蛋白以及多糖與其他提取方法相比結(jié)構(gòu)組成相似，但提取過程更便捷高效，因此，TPP法為綜合利用米糠提供了一條簡單、快速、廉價的途徑。

5 結(jié)論與展望

作為一種新興的生物分離技術(shù)，TPP法具有成本低廉、提取高效、提取條件溫和等優(yōu)點，已在食品組分的提取方面有了一些研究和進展，但由于提取原料復(fù)雜、食品組分多樣，而TPP法的具體分配過程又涉及鹽析、共溶劑、滲透等多種原理，因此未來還需要進行更深入的研究，包括對TPP法的機理深入分析，了解其在食品組分提取方面的應(yīng)用范圍；基于TPP法，進一步研究提高TPP法效率的輔助處理，發(fā)展更方便、快捷、環(huán)保的三相分配體系；拓寬TPP法的應(yīng)用范圍，嘗試更多食品組分的分離，滿足人們對新穎食品的需求。

TPP法雖受到越來越廣泛的研究，但該技術(shù)起步較晚，還不夠成熟，尤其是油脂工業(yè)生產(chǎn)中仍以技術(shù)基本成熟的己烷萃取為主，實際生產(chǎn)中尚未規(guī)模化應(yīng)用TPP法，這對于萃取領(lǐng)域是一個很大的發(fā)展機會。