寡聚苯乙炔修飾RM26的177Lu標(biāo)記和細(xì)胞內(nèi)化研究

廖 偉，付華霞,2，李祥玉,2，闞文濤，楊 夏，王 靜，趙 鵬，卓連剛，楊宇川，魏洪源

(1.中國工程物理研究院 核物理與化學(xué)研究所，四川 綿陽 621900；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，四川 瀘州 646000)

胃泌素釋放肽受體(GRPR)廣泛存在于多種腫瘤細(xì)胞中，在前列腺癌、肺癌、胃腸道癌中均顯著表達(dá)[1-2]。放射性核素標(biāo)記的靶向多肽可以與GRPR陽性的腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合，用于腫瘤的診斷和治療[3-4]。近年來，一系列靶向GRPR的多肽用于顯像研究，取得了良好的效果，但是基于GRPR識別的放射性治療藥物的研究則相對滯后。這是因為放射性治療藥物需要更長的藥物滯留時間，更高的腫瘤組織比。藥物的內(nèi)化，既可以提高藥物滯留時間，也可以使放射性核素更接近對放射性射線敏感的細(xì)胞核，從而提高細(xì)胞毒性，殺死癌細(xì)胞，因此內(nèi)化對放射性治療藥物具有重要意義[5-8]。激動劑多肽可以完成細(xì)胞內(nèi)化，但是激動劑存在副作用，限制了激動劑的使用[9-10]。雖然研究表明拮抗劑的特異性結(jié)合能力優(yōu)于激動劑，但是拮抗劑多肽不能完成細(xì)胞內(nèi)化，很少用于放射性治療藥物的研究[11-12]。為了利用拮抗劑優(yōu)良的靶向特異性，同時提高細(xì)胞內(nèi)化率，可以在拮抗劑上連接具有跨膜能力的基團(tuán)，輔助完成藥物的內(nèi)化?？缒ざ嚯?CPP)是常用的跨膜基團(tuán)，但存在體內(nèi)不穩(wěn)定、代謝快的缺點[13]?？缒ば》肿硬粌H可以完成跨膜作用，也具有更好的穩(wěn)定性。理論計算和實驗都表明，寡聚苯乙炔(OPE)是一類具有良好跨膜能力的小分子[14-17]，將OPE與拮抗劑通過化學(xué)鍵連接，同時連接配位基團(tuán)，可以得到具有靶向、跨膜和放射性標(biāo)記多功能一體的潛在放射性治療藥物前體。

RM26 (D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2)是一種廣泛應(yīng)用于顯像和治療研究的GRPR拮抗劑，能特異性靶向前列腺癌細(xì)胞[18-20]。將RM26和OPE結(jié)合，可以得到具有良好親和性和內(nèi)化能力的藥物前體。人前列腺癌細(xì)胞(PC3)是一種GRPR陽性的細(xì)胞系，廣泛應(yīng)用于GRPR陽性靶向研究，可以用于RM26及其衍生物的細(xì)胞內(nèi)化研究[21-22]。

放射性核素的選擇對放射性治療藥物的療效和藥代動力學(xué)也有重要意義。177Lu具有合適的β發(fā)射和γ發(fā)射能量和合適的半衰期，廣泛應(yīng)用于腫瘤的放射性診斷和治療[23-24]。2018年，177Lu-DOTATATE獲美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)，用于腸道神經(jīng)內(nèi)分泌瘤治療[25]，顯示了177Lu作為放射性治療核素的巨大價值。

因此，將具有跨膜能力的OPE和具有特異靶向性的RM26結(jié)合，并連接NOTA基團(tuán)，可以得到放射性治療藥物前體NOTA-OPE-1-RM26和NOTA-OPE-2-RM26。選擇NOTA作為配體，可以用于177Lu、68Ga、Al18F等標(biāo)記，以滿足不同需求[26]。本文對標(biāo)記化合物的PC3細(xì)胞親和性、內(nèi)化率和特異結(jié)合性進(jìn)行研究，并討論引入跨膜基團(tuán)OPE提高拮抗劑藥物細(xì)胞內(nèi)化率的可行性。

1 實驗材料

1.1 主要儀器

Agilent 1100高效液相色譜：美國安捷倫公司；CHA高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國沃特世公司；PLC 2020液相色譜：美國吉爾森公司；Mini-Scan型TLC薄層放射性掃描儀：美國Bioscan公司；AE200電子天平：瑞士Ettler公司。

1.2 主要試劑

多肽RM26：成都凱捷多肽科技有限公司，純度>95%；寡聚苯乙炔：根據(jù)文獻(xiàn)[27]合成，經(jīng)過1H NMR和13C NMR表征；177LuCl3：中國工程物理研究院核物理與化學(xué)研究所制備，核純度>99.9%，放化純度>99%，放射性濃度0.5 Ci/mL；p-NCS-Bn-NOTA：Macrocyclics，純度>95%。其他試劑均為分析純，從百靈威、阿拉丁公司購買。人前列腺癌細(xì)胞(PC3)：ATCC提供。

2 實驗方法

2.1 制備RM26多肽衍生物

NOTA-OPEs-RM26的合成路線示于圖1?？傮w合成過程為，具有對稱二酸結(jié)構(gòu)的化合物Fmoc-L-β-谷氨酸-5-叔丁基酯1作為合成起始物，在三氟乙酸的作用下脫去叔丁基保護(hù)基，得到化合物2，然后使用二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化兩個羧基，得到化合物3，接著分步加入RM26，寡聚苯乙炔OPE-1或OPE-2，哌啶，得到化合物4，最后加入p-NCS-Bn-NOTA，得到化合物5(圖1)。產(chǎn)物NOTA-OPE-1-RM26和NOTA-OPE-2-RM26結(jié)構(gòu)示于圖2。

a——TFA, rt, 30 min; b——DCC, NHS, DMF, rt, 2 h;c—— RM26, DIPEA, DMF, rt, 8 h;d——OPE-1 or OPE-2, DMF, rt, 8 h;e——哌啶, DMF, rt, 3 h;f——p-NCS-Bn-NOTA, NEt3, DMF, rt, 2 h圖1 NOTA-OPEs-RM26的合成Fig.1 Syntheses of NOTA-OPEs-RM26

圖2 NOTA-OPE-1-RM26和NOTA-OPE-2-RM26結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Structures of NOTA-OPE-1-RM26 and NOTA-OPE-2-RM26

2.1.1化合物2的合成 200 mg化合物1溶解在1 mL三氟乙酸中，室溫攪拌30 min，減壓旋蒸除去溶劑，得到化合物2。

2.1.2化合物3的合成 依次將化合物2(1 eq)，DCC(2.1 eq)，NHS(2.1 eq)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室溫攪拌2 h，然后使用高效液相色譜分離，分離條件為：流動相為含0.1%三氟乙酸純水和含0.1%三氟乙酸乙腈溶液，乙腈濃度0～30 min，20%～90%，流速：9 mL/min，得到化合物3。

2.1.3化合物4的合成 將化合物3(1 eq)，RM26(0.9 eq)溶解在DMF中，加入二異丙基乙胺(DIPEA，10 eq)，室溫攪拌8 h；然后加入OPE-1或OPE-2(1 eq)，室溫攪拌8 h；最后加入哌啶(100 eq)，繼續(xù)室溫攪拌3 h。反應(yīng)結(jié)束后用HPLC分離樣品，分離條件為：流動相為含0.1%三氟乙酸純水和含0.1%三氟乙酸乙腈溶液，乙腈濃度為0～30 min，20%～50%，流速：1 mL/min，得到化合物4。

2.1.4化合物5的合成 將化合物4(1 eq)，p-NCS-Bn-NOTA (1 eq)和三乙胺(10 eq)溶解在DMF中，室溫攪拌2 h。反應(yīng)結(jié)束后使用HPLC分離樣品，分離條件為：流動相為含0.1%三氟乙酸純水和含0.1%三氟乙酸乙腈溶液，乙腈濃度：0～30 min，25%～50%，流速：1 mL/min，得到化合物5。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

前列腺癌細(xì)胞(PC3)在含10% 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和1% 青鏈霉素混合液雙抗(penicillin-streptomycin solution, PS)的高糖培養(yǎng)液(dulbecco’s modified eagle medium, DMEM)F12培養(yǎng)基(Ham’s F 12 nutrient medium) (1∶1)培養(yǎng)液中培養(yǎng)，溫度37 ℃，CO2含量5%。

2.3 NOTA-OPEs-RM26的177Lu標(biāo)記

將5 μL NOTA-RM26, NOTA-OPE-1-RM26或NOTA-OPE-2-RM26溶液(1 mmol/L)加入25 μL pH=5.5的醋酸鈉緩沖溶液中，加入0.8 μL177LuCl3(24 MBq)溶液，金屬浴80 ℃加熱反應(yīng)1 h。點板，以pH=5.5的檸檬酸溶液為展開體系，使用iTLC檢測，并計算標(biāo)記率。

2.4 177Lu-NOTA-OPEs-RM26體外穩(wěn)定性

取5 μL標(biāo)記好的177Lu-NOTA-OPE-1-RM26和177Lu-NOTA-OPE-2-RM26，分別使用10 μL生理鹽水、高糖培養(yǎng)液、新生牛血清稀釋，稀釋液在室溫保存，分別在2、4、48、72 h使用iTLC檢測。

2.5 177Lu-NOTA-OPEs-RM26細(xì)胞內(nèi)化

將177Lu-NOTA-RM26,177Lu-NOTA-OPE-1-RM26和177Lu-NOTA-OPE-2-RM26用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至9.07 kBq/mL。在6孔板中接種PC3細(xì)胞，每個孔接種4×104個細(xì)胞，然后在37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)48 h，然后將培養(yǎng)液吸走，加入1 mL稀釋好的177Lu-NOTA-RM26,177Lu-NOTA-OPE-1-RM26或177Lu-NOTA-OPE-2-RM26溶液，6孔板中37 ℃分別培養(yǎng)1、2、6、24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，收集每個孔的培養(yǎng)液，并用0.8 mL PBS溶液清洗一次，合并培養(yǎng)液和清洗液，測量其放射性計數(shù)，作為細(xì)胞膜外放射性計數(shù)A外。冰浴冷卻，加入預(yù)冷的1 mL pH=2.0的尿素溶液(含4 mol/L尿素和0.2 mol/L甘氨酸)，冰浴靜置5 min，收集清液，重復(fù)一次，將兩次的尿素溶液合并，測量放射性計數(shù)，作為細(xì)胞膜放射性計數(shù)A膜。室溫下加入1 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液，靜置30 min，收集液體，重復(fù)一次，將兩次的氫氧化鈉溶液合并，測量放射性計數(shù)，作為細(xì)胞膜內(nèi)放射性計數(shù)A內(nèi)。分別計算細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)放射性攝取率。細(xì)胞膜放射性攝取率：U膜=A膜/(A外+A膜+A內(nèi))；細(xì)胞內(nèi)放射性攝取率：U內(nèi)=A內(nèi)/(A外+A膜+A內(nèi))。

2.6 177Lu-NOTA-OPEs-RM26細(xì)胞特異性結(jié)合

在6孔板中接種PC3細(xì)胞，每個孔接種4×104個細(xì)胞，在37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)48 h后將培養(yǎng)液吸走，加入1 mL含1 000倍蛙皮素(bombesin, BBN)的培養(yǎng)液作為封閉劑[28]，37 ℃培養(yǎng)30 min，將培養(yǎng)液吸走，加入1 mL含有1 000倍BBN和標(biāo)記化合物(667 Bq/mL)的培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)15、30、45 min，收集培養(yǎng)液，再用0.8 mL PBS清洗，合并兩次液體，測量放射性計數(shù)；加入1 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液，靜置15 min，收集液體，重復(fù)一次，將兩次的液體合并，測量放射性計數(shù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 NOTA-OPEs-RM26的制備

化合物1合成得到化合物3的總產(chǎn)率為23%，化合物3合成得到化合物4的產(chǎn)率為19%(OPE-1)和21%(OPE-2)，最終產(chǎn)物NOTA-OPE-1-RM26和NOTA-OPE-2-RM26的產(chǎn)率為36%和41%?；衔锛兌群徒Y(jié)構(gòu)通過高效液相質(zhì)譜-質(zhì)譜(LC-MS)驗證(圖3)。液相質(zhì)譜結(jié)果表明，化合物的化學(xué)純度大于95%。質(zhì)譜采用ESI源離子化，檢測得到一系列荷質(zhì)比峰，與計算值相比，誤差均小于0.5，確證了化合物結(jié)構(gòu)(表1)。

a——NOTA-OPE-1-RM26；b——NOTA-OPE-2-RM26圖3 LC-MS譜圖Fig.3 LC-MS spectra of NOTA-OPE-1-RM26(a) and NOTA-OPE-2-RM26(b)

表1 NOTA-OPE-1-RM26和NOTA-OPE-2-RM26荷質(zhì)比計算值與檢測值Table 1 Calculated and detected specific charges of NOTA-OPE-1-RM26 and NOTA-OPE-2-RM26

3.2 NOTA-OPEs-RM26的標(biāo)記

177Lu-NOTA-OPEs-RM26的放化純度使用iTLC檢測。展開劑為pH=5.5的檸檬酸溶液。Rf=[樣品位置(min) -起始位置(0.3 min)]/總距離(0.7 min)。游離177LuRf為0.91，標(biāo)記后化合物Rf接近0。檢測結(jié)果表明，化合物177Lu-NOTA-OPE-1-RM26，177Lu-NOTA-OPE-2-RM26和177Lu-NOTA-RM26的標(biāo)記率均大于99%(圖4)。

a——177Lu-NOTA-OPE-1-RM26；b——177Lu-NOTA-OPE-2-RM26；c——177Lu-NOTA-RM26；d——177LuCl3圖4 iTLC譜圖Fig.4 iTLC spectra

3.3 體外穩(wěn)定性

化合物177Lu-NOTA-OPE-1-RM26，177Lu-NOTA-OPE-2-RM26和177Lu-NOTA-RM26在生理鹽水、高糖培養(yǎng)液、新生牛血清中均穩(wěn)定存在，經(jīng)過72 h后，三種化合物的放化純度均大于99%。

3.4 177Lu-NOTA-OPEs-RM26細(xì)胞內(nèi)化

177Lu-NOTA-RM26的細(xì)胞膜表面吸收迅速達(dá)到最大值26%并逐漸降低到15%，而內(nèi)化率則從1 h的5%逐漸上升到24 h的28%，總攝取率在6 h達(dá)到最大47%(圖5a)。177Lu-NOTA-OPE-1-RM26的細(xì)胞膜表面吸收2 h達(dá)到最大值23%然后逐漸降低，24 h后為6%，而內(nèi)化劑量逐漸升高，從1 h的5%增加到24 h的30%，總攝取在6 h達(dá)到最大41%(圖5b)。177Lu-NOTA-OPE-2-RM26的細(xì)胞膜表面吸收在2 h達(dá)到最大值32%并逐漸降低到15%，而內(nèi)化率從1 h的6%逐漸升到到39%，總攝取在6 h達(dá)到最大值55%(圖5c)。

a——177Lu-NOTA-RM26；b——177Lu-NOTA-OPE-1-RM26；c—— 177Lu-NOTA-OPE-2-RM26圖5 PC3細(xì)胞內(nèi)化實驗結(jié)果Fig.5 Cellular internalization of 177Lu-NOTA-RM26(a) ， 177Lu-NOTA-OPE-1-RM26 (b) and 177Lu-NOTA-OPE-2-RM26 (c) to PC3 cells

比較三個化合物的吸收發(fā)現(xiàn)：1) 細(xì)胞膜表面的吸收迅速達(dá)到最大值然后逐漸下降；2) 內(nèi)化劑量隨著時間逐漸升高；3) 最大攝取量在6 h達(dá)到最大并基本保持穩(wěn)定。實驗結(jié)果表明，細(xì)胞膜表面的吸附是一個快速的過程，而化合物的內(nèi)化則需要時間，因此在6 h后，細(xì)胞膜表面劑量降低，內(nèi)化劑量升高，總劑量基本保持不變。引入OPE-1和OPE-2后，細(xì)胞內(nèi)化率從28%分別提高到30%和39%，表明OPE-1稍微提高內(nèi)化率，而OPE-2顯著提高了內(nèi)化率。OPE-2比OPE-1效果更好的可能原因是OPE-2含有3個叔胺基團(tuán)，而OPE-1只有一個叔胺基團(tuán)，而叔胺基團(tuán)可逆的質(zhì)子化/去質(zhì)子化過程可以調(diào)節(jié)化合物的親水/親脂性，有助于提高化合物的跨膜能力[17]。引入OPE-1和OPE-2后，細(xì)胞總攝取從47%分別變化為41%和55%。引入OPE-1后，化合物溶解性下降，導(dǎo)致細(xì)胞表面吸附降低，從而細(xì)胞總攝取降低，而OPE-2具有更好的溶解性和內(nèi)化能力，從而導(dǎo)致總攝取率提高。

3.5 細(xì)胞特異性結(jié)合

細(xì)胞特異性結(jié)合實驗可以驗證引入OPE是否改變了RM26的特異性結(jié)合能力?；衔锝?jīng)過BBN封閉后，177Lu-NOTA-RM26總攝取低于1.1%，而177Lu-NOTA-OPE-1-RM26和177Lu-NOTA-OPE-2-RM26的總攝取不高于2.1%和4.3%(圖6)。經(jīng)過BBN封閉后，177Lu-NOTA-OPE-1-RM26和177Lu-NOTA-OPE-2-RM26的細(xì)胞攝取率分別從41%和55%降低到2.1%和4.3%，說明引入OPE并沒有改變RM26的特異性結(jié)合能力。

圖6 177Lu-NOTA-RM26, 177Lu-NOTA-OPE-1-RM26和 177Lu-NOTA-OPE-2-RM26的PC3細(xì)胞特異性結(jié)合(1 000倍BBN作為封閉劑)Fig.6 Cellular binding affinity of 177Lu-NOTA-RM26, 177Lu-NOTA-OPE-1-RM26 and 177Lu-NOTA-OPE-2-RM26 to PC3 cells (1000-fold of BBN as the blocking agent)

4 結(jié)論

將具有跨膜能力的OPE與具有特異性結(jié)合的RM26結(jié)合，得到兩種潛在放射性治療藥物前體NOTA-OPE-1-RM26和NOTA-OPE-2-RM26。其177Lu標(biāo)記率均大于99%，并且標(biāo)記物在生理鹽水、高糖培養(yǎng)液、新生牛血清中穩(wěn)定性良好。細(xì)胞內(nèi)化實驗表明，引入OPE-1稍微提高了化合物的內(nèi)化率，引入OPE-2明顯提高了化合物的內(nèi)化率。引入OPE并沒有改變RM26的特異性結(jié)合能力。結(jié)果表明，引入跨膜基團(tuán)OPE有助于提高拮抗劑多肽的內(nèi)化率，從而提高拮抗劑作為放射性治療藥物的療效。