基于KASP 標記研究光周期基因Ppd-1 對二系雜交小麥親本抽穗期的作用

陳現(xiàn)朝，劉江峰，張風廷

（北京市農(nóng)林科學院 雜交小麥研究所，北京 100097）

雜交小麥具有大幅度提高小麥產(chǎn)量的潛力，而制種產(chǎn)量是二系雜交小麥品種走向市場的主要限制因素之一［1］。二系雜交小麥親本發(fā)育進程不一致，年度間抽穗期差異較大，是導致其制種產(chǎn)量不穩(wěn)的主要因素之一。研究二系雜交小麥親本抽穗期的遺傳和環(huán)境因素作用，對篩選抽穗期穩(wěn)定的材料并通過播期協(xié)調其發(fā)育進程，從而穩(wěn)定二系雜交小麥的制種產(chǎn)量具有重要的科學意義。

小麥抽穗期和開花期相關的基因有春化基因（Vernalization, Vrn）、光周期基因（Photoperiod,Ppd）和早熟基因（Earliness per se, EPS），其中春化基因Vrn-1和光周期基因Ppd-1是決定小麥抽穗期和開花期的關鍵基因［2］。迄今已有多個研究對Vrn-1和Ppd-1在小麥中的組成和分布進行檢測［3-7］，及其在小麥抽穗期和開花期的作用進行探索［8-10］，結果表明春化和光周期等位基因的組成、分布和作用與品種特性和生態(tài)區(qū)域相適應。此外，Padovan 等研究表明通過播期等栽培措施可以提高小麥的適應性［11］。Rasheed 等利用春化基因和光周期基因的KASP 功能標記對不同國家和地區(qū)的小麥抽穗期進行鑒定［12］。KASP 標記以其簡便高效方式對基因的SNP 位點變異檢測，逐漸成為小麥種質資源鑒定、評價和篩選的主要技術手段［13-14］。

目前，二系雜交小麥親本年度間抽穗期和開花期差異較大且不穩(wěn)定，已成為二系雜交小麥大面積制種亟需破解的科學問題。前期，本團隊已經(jīng)對245 份親本春化基因和光周期基因的組成、分布進行研究［15］，但光周期基因Ppd-1在抽穗期的作用亟待闡明。本研究利用光周期基因Ppd-1的6組KASP 功能標記對453 份二系雜交小麥親本進行檢測，以播種到抽穗的時間和生長度日為指標，研究Ppd-1對二系雜交小麥親本抽穗期的作用，分析Ppd-1不同單體型的親本抽穗期穩(wěn)定性。以期通過光周期基因Ppd-1的分子標記輔助鑒定并篩選抽穗期穩(wěn)定的材料，結合播期協(xié)調其發(fā)育進程，為獲得制種產(chǎn)量穩(wěn)定的二系雜交小麥親本組合奠定科學基礎。

1 材料和方法

1.1 供試材料

本試驗于2018—2019 年和2019—2020 年在北京市農(nóng)林科學院河南鄧州雜交小麥產(chǎn)業(yè)化實驗基地進行（32.68°N,112.08°E）。供試材料共453 份，其中二系雜交小麥骨干光溫敏不育系94 份（在鄧州地區(qū)常年10 月25 日播種，不育度大于95%），骨干恢復系359 份（均為本所改良的高恢復力材料）。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 田間試驗設計及表型調查 2018 年和2019年，39 和55 份不育系分別于10 月13 日和19 日播種，154 和205 份恢復系分別于10 月19 日和27日播種。每個材料種植2 行，每行30 粒，1.5 m 行長，行距25 cm。實驗材料采用隨機區(qū)組設計，設置2 個重復。施用小麥專用復合肥，N ∶P ∶K 為25 ∶14 ∶7，化肥全部基施，按照一般大田管理。參照宋彥霞等方法進行抽穗期的田間調查［16］。播種到抽穗的時間計算公式：HD=H-S，其中HD、H和S分別為抽穗期、抽穗日期、播種日期。抽穗期差值計算公式：△HD=HDS-HDR，其中HDS 和HDR 分別為不育系和恢復系的抽穗期。

1.2.2 光周期基因Ppd-1檢測 參照Rasheed［12］等研究設計本研究所需的6 組KASP 標記引物見表1。根據(jù)KASP 標記引物設計要求，F(xiàn)AM引物和HEX 引物5′ 端分別含有特異性接頭，G A A G G T G A C C A A G T T C A T G C T 和GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，可與熒光標記結合用于熒光檢測，具體引物序列信息如表1 所示。田間剪取實驗材料葉片。利用植物基因組DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）分別提取453 份供試小麥材料基因組DNA，以供試小麥材料基因組DNA 為模板，分別采用6 組引物進行PCR 擴增。反應程序為：94 ℃ 預變性，15 min；94 ℃ 變性20 s，61 ～55 ℃（選用Touchdown 程序，每循環(huán)降低0.6 ℃）1 min，擴增10 個循環(huán)；94 ℃變性20 s，55 ℃ 延伸1 min，繼續(xù)擴增26 個循環(huán)。用LGC 公司開發(fā)的SNP viewer 2.0 軟件讀取檢測數(shù)據(jù)。試驗結果剔除單體型雜合和缺失樣本，用Excel統(tǒng)計不育系和恢復系材料中Ppd-D1、Ppd-B1和Ppd-A1基因單體型的頻率。

表1 檢測 Ppd-D1、Ppd-B1 和Ppd-A1 等位基因的引物信息Table 1 Primers for detecting different alleles of Ppd-D1, Ppd-B1, and Ppd-A1

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2019 對數(shù)據(jù)進行整理，利用SPSS25.0（LSD）軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計描述、顯著比較和方差分析。

2 結果與分析

2.1 Ppd-D1、Ppd-B1 和Ppd-A1 的組成及分布

鑒定結果（表2）發(fā)現(xiàn)供試材料以光周期敏感 型Ppd-D1b、Ppd-B1b和Ppd-A1b為 主。 6 個標 記TaPpdDD001、TaPpdDI001、TaPpdDD002、TaPpdBJ001、GS100-1027IND 和GS105-1117IND在供試材料檢測到7 個等位基因，分別為Ppd-D1的3 個 野 生 型，Ppd-B1 的Non-truncated 型 以 及Ppd-A1的GS-105 型和2 個光周期敏感型。此外供試材料中光周期敏感型單體型在不育系中的比例大于恢復系，但2018—2019 年度基因位點不育系中Ppd-A1基因 GS100-1027IND 標記檢測比例為87.18% 小于恢復系的93.51%。由表3 可知，供試材料包含39 種光周期基因單體型，其中Ⅰ型只在恢復系存在，占供試恢復系的37.88%；Ⅱ～Ⅴ 和ⅩⅠ 型在不育系和恢復系都存在，占供試不育系和恢復系的75.53% 和38.44%，其余單體型只在部分材料中存在，占供試不育系和恢復系的24.47%和23.96%。

表2 Ppd-D1、Ppd-B1 和Ppd-A1 等位基因在不育系和恢復系的組成和分布Table 2 Alleles composition and distribution of Ppd-D1, Ppd-B1, and Ppd-A1 in sterile lines and restorer lines

表3 Ppd-D1、Ppd-B1 和Ppd-A1 單體型的組成和分布Table 3 Distribution of Ppd-D1, Ppd-B1, and Ppd-A1 haplotype combinations

續(xù)表：

2.2 播期和光周期基因Ppd-1 對二系雜交小麥親本抽穗期的作用

選擇不育系和恢復系中Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ，播種到抽穗的時間和生長度日為指標對抽穗期的變異來源進行方差分析（表 4）。由表 4 可知播期對二系雜交小麥親本抽穗期的作用大于光周期基因，其中播期間播種到抽穗的時間和生長度日差異達到極顯著水平（P＜0.01），光周期基因不同單體型之間播種到抽穗的時間和生長度日差異均不顯著。

表4 抽穗期和生長度日的方差分析Table 4 Analysis of variance of heading date and growth degree day

由表3 可知ⅩⅠ 在總材料中比例小，無法對其單體型間進行顯著性比較分析。2018—2019 年和2019—2020 年2 個年度選擇不育系和恢復系中Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ為材料，對其播種到抽穗的時間和生長度日進行顯著性比較分析（表 5）。由表5 可知年度和單體型間生長度日比播種到抽穗的時間更穩(wěn)定。2018—2019 年度不育系比恢復系抽穗期多2.2 d，且差異顯著（P=0.03），2019—2020 年度不育系比恢復系少0.07，差異不顯著。2018—2019 年度不育系比恢復系生長度日多 36.7 ℃·d，且差異極顯著（P=0.006），2019—2020 年度不育系比恢復系生長度日多 24.5 ℃. d，且差異顯著（P=0.046）。

表5 不育系和恢復系抽穗期和生長度日顯著性比較Table 5 Comparison of significance of heading time and growth degree day between male sterile and restorer lines

為進一步闡明不同單體型的親本抽穗期穩(wěn)定性，本研究在2018—2019 年和2019—2020 年2 個年度下，選擇Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ4 個單體型的不育系和恢復系為材料，對其播種到抽穗的時間和生長度日進行顯著性比較分析（表 6），結果表明組合間播種到抽穗的時間差值不穩(wěn)定，而播種到抽穗的生長度日差值因組合不同而表現(xiàn)不同。由表6 可知不育系和恢復系抽穗期差值 2018—2019 年度均大于2019—2020 年度，且組合間和年度間抽穗期差值不穩(wěn)定。就組合間生長度日差值而言，其中單體型Ⅲ的組合在兩個年度差異較大；而單體型Ⅱ的組合（Ⅱ×Ⅲ除外）在兩個年度間穩(wěn)定性好，而Ⅱ×Ⅱ在兩個年度生長度日穩(wěn)定分別為32.94 ℃·d和32.79 ℃·d，達到極顯著和顯著水平。單體型Ⅳ的組合（Ⅳ×Ⅲ除外）在兩個年度間穩(wěn)定性好，但不顯著。單體型Ⅴ的組合穩(wěn)定性較差。

表6 不同單體型間不育系和恢復系抽穗期和生長度日差異比較Table 6 Comparison of heading date and growth degree day differences between male sterile lines and restorer lines among different genotype combinations

3 討論

3.1 小麥光周期基因Ppd-1 的組成和分布

小麥光周期的組成和分布與光照反應和環(huán)境因素有關，迄今已有多個研究對小麥光周期基因Ppd-D1、Ppd-B1和Ppd-A1的分布和作用進行研究［3-6］。其中Yang 等發(fā)現(xiàn)中國小麥品種中光周期不敏感基因Ppd-D1a自北向南比例逐漸增多的趨勢［3］，該基因與本研究中Ppd-D1的TaPpdDD001標記檢測的基因位點相同，但二系雜交小麥不育系和恢復系等位基因以Ppd-D1b為主，其比例分別為 97.87% 和 91.92%。Guo 等 對Ppd-D1基 因 在國內外小麥品種的分布進行研究，發(fā)現(xiàn)其單體型遍布世界各地，但不同單體型分布與麥區(qū)的經(jīng)緯度有關［4］。Bentley 等分布對世界各國的小麥品種對光周期基因Ppd-B1和Ppd-A1等位基因分布和功能進行研究，發(fā)現(xiàn)供試材料以光周期敏感型Ppd-B1b和Ppd-A1b為主［5-6］。二系雜交小麥親本中光周期基因Ppd-D1、Ppd-B1和Ppd-A1的單體型組成和分布與上述研究結果不盡相同，一方面由于不同研究的材料來源和組成不同，研究結果自然會有所差異。另一方面，這可能與二系雜交小麥不育系在北京（可育）、鄧州（不育）兩地進行穿梭育種，人工定向選擇光周期敏感的不育系，造成其群體中春化基因和光周期基因頻率與常規(guī)小麥不同［19］。

3.2 光周期基因Ppd-1 在小麥抽穗期的作用

小麥發(fā)育既受春化和光周期基因調控，也受的光照和溫度影響［20］。本研究表明播期對二系雜交小麥親本抽穗期的作用大于光周期基因Ppd-1。這可能與二系雜交小麥骨干親本光周期基因以光周期敏感的基因單體型為主有關，已有多個研究表明發(fā)現(xiàn)Ppd-D1對二系雜交小麥親本抽穗期作用最大，Ppd-B1和Ppd-A1次之［21-23］。本研究中供試材料組Ⅱ光周期基因單體型穩(wěn)定性最好，而Ⅲ和Ⅴ光周期基因單體型抽穗期穩(wěn)定性較差。Ⅲ光周期基因為光周期不敏感型Ppd-D1a，受環(huán)境條件作用顯著，組合間抽穗期穩(wěn)定性差；而組Ⅱ和組Ⅴ光周期基因為光周期敏感型Ppd-D1b，其抽穗期穩(wěn)定性較好。因而，為篩選小麥抽穗期穩(wěn)定的小麥，應進一步通過分子標記輔助鑒定篩選組Ppd-D1b的小麥。

由于年度間或不同播期小麥發(fā)育進程溫度變化不穩(wěn)定和光照時長的差異，以小麥播種到抽穗的時間即抽穗期為小麥發(fā)育進程的指標不夠準確，本文比較不同光周期基因型播種到抽穗的時間和生長度日也對此進一步進行驗證，而且相同光周期基因型下播種到抽穗生長度日較抽穗期更穩(wěn)定。同時，小麥階段發(fā)育所需的基礎溫度因品種或發(fā)育階段有所不同［17］，本研究利用0 ℃作為小麥播種到抽穗基礎溫度不夠準確，因而，本文中不同基因型小麥播種到抽穗間的生長日溫在年度間有所變動。

3.3 光周期基因Ppd-1 在二系雜交小麥制種的意義

二系雜交小麥制種親本年度間抽穗期和開花期差異較大且不穩(wěn)定，不能滿足制種實驗的要求。研究發(fā)現(xiàn)二系雜交小麥制種產(chǎn)量與組合親本的抽穗期和開花期顯著相關［15］。研究不同光周期基因單體型親本抽穗期和開花期的作用，為分子標記輔助鑒定抽穗期和開花期穩(wěn)定的小麥提供科學依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)而Ⅱ×Ⅱ在兩個年度生長度日穩(wěn)定分別為32.94 ℃·d 和32.79 ℃·d，達到極顯著和顯著水平。該單體型在二系雜交小麥制種親本比例偏低，需進一步加強分子標記輔助鑒定和篩選抽穗期和開花期穩(wěn)定的小麥研究工作。