追氮時期對強筋小麥根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

付博陽，張鈞浩，楊明曉，許華森，彭正萍，薛 澄

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 華北作物改良與調(diào)控國家重點實驗室/資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/河北省農(nóng)田生態(tài)環(huán)境重點實驗室，河北 保定 071000）

小麥是我國重要的糧食作物，近年來，我國小麥年產(chǎn)量穩(wěn)定在1.3 億t 左右，約占糧食總產(chǎn)量的20%［1］。氮肥施用是影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一［2］，合理的氮肥調(diào)控為小麥高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)提供了保障。除氮肥施用量以外，氮肥供應(yīng)時期對小麥產(chǎn)量和品質(zhì)也具有較大的影響。前人研究表明，在小麥生育后期追施氮肥可在保障小麥高產(chǎn)的前提下顯著提高氮肥利用率和小麥籽粒蛋白質(zhì)含量、優(yōu)化蛋白質(zhì)組成，進而提高其加工品質(zhì)［3-4］。

土壤氮素供應(yīng)水平顯著影響土壤微生物多樣性及其群落結(jié)構(gòu)與功能［5-6］。熊藝等［7］研究表明，在小麥根際微生物群落多樣性和群落結(jié)構(gòu)變化中起主導(dǎo)作用的是土壤中可溶性無機氮含量，且土壤微生物群落在氮素供應(yīng)不足的情況下具有更高的α-多樣性。隨施氮水平提高，小麥根際微生物總量和細菌、放線菌、真菌數(shù)量均呈單峰曲線［8］，微生物多樣性隨施氮量增加呈下降趨勢［5,9］。Zhou 等［10］通過對不同生態(tài)區(qū)454 個氮肥試驗進行meta 分析發(fā)現(xiàn)，提高氮肥施用量降低了土壤微生物量碳/氮比以及真菌/細菌比，但氮素輸入量每年小于100 kg /hm2時，對土壤微生物并不會產(chǎn)生負面效果。長期定位試驗結(jié)果也表明，長期施氮會降低細菌群落的α-多樣性及微生物數(shù)量［6］。

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)不僅與施氮量有關(guān)，還受氮肥施用方式的影響。王淑貞［11］研究表明，在施氮量相同條件下，分次施氮（基施氮+拔節(jié)期追氮、基施氮+灌漿期追氮、基施氮+拔節(jié)期追氮+灌漿期追氮）相較于播前一次性施氮顯著提高了冬小麥的產(chǎn)量和土壤微生物多樣性?，F(xiàn)有研究主要關(guān)注中筋小麥土壤微生物對氮肥調(diào)控的響應(yīng)特征，很少涉及強筋小麥，而不同基因型小麥的土壤微生物結(jié)構(gòu)與功能存在明顯的差異［12］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)［4］，施氮量相同時，孕穗期追氮能夠?qū)崿F(xiàn)強筋小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的協(xié)同提高，但土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化仍未可知?；诖?，本試驗以優(yōu)質(zhì)強筋小麥品種‘藁優(yōu)2018’為供試材料，研究不同追氮時期對小麥根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，以期為小麥高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)中科學(xué)施肥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2017 年10 月—2020 年6 月在河北省邢臺市鳳凰鎮(zhèn)孟村（37°36′N, 114°54′E）進行，該地屬大陸性季風(fēng)氣候，年均氣溫12.8 ℃，年均降水量449.1 mm，無霜期198 d，年均日照時長2 629.5 h。供試土壤類型為壤質(zhì)潮褐土，其0 ～20 cm 土層基本理化性狀為：有機質(zhì)含量17.2 g/kg，全氮含量1.0 g/kg，硝態(tài)氮含量8.7 mg/kg，銨態(tài)氮含量5.8 mg/kg，有效磷含量19.2 mg/kg，速效鉀含量132.7 mg/kg，pH（水土比2.5 ∶1）值8.34。

1.2 試驗設(shè)計

試驗共設(shè)置5 個處理：N0，不施氮肥；NE，基施氮96 kg /hm2，拔節(jié)期追氮144 kg /hm2，后期不追氮；NB、NH、NF為后期追氮處理，即將NE處理拔節(jié)期追氮的50%分別于孕穗期、抽穗期、開花期追施，各施氮處理總施氮量均為240 kg /hm2。播前各處理均同時施入 135 kg /hm2P2O5和105 kg /hm2K2O，基肥為摻混肥，追肥為尿素（N ≥46%），追施方式為撒施。各處理均設(shè)置4 次重復(fù)，采用隨機區(qū)組設(shè)計，小區(qū)面積25 m2(4 m×6.45 m)。供試小麥品種為優(yōu)質(zhì)強筋冬小麥‘藁優(yōu)2018’，小麥播種量為262.5 kg/hm2，行距0.15 m，其他田間管理均按當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)管理進行。

1.3 樣品采集與測定方法

1.3.1 樣品采集 經(jīng)過3 年的定位試驗后，于2020年6 月4 日采集小麥成熟期根際土壤樣品，取樣工具事先經(jīng)過消毒滅菌處理，采用抖根法進行根際土的采集。每小區(qū)隨機采集20 ～30 株生長均勻并具有代表性的小麥，將這些小麥根部（0 ～20 cm 土層）挖出，抖掉小麥根部周圍土壤，用毛刷刷取根際土，將其進行混合放置于密封袋中作為1 個分析樣品。將所取樣品放置于低溫保藏箱（-20 ℃），帶回實驗室后保存在-80 ℃超低溫冰箱中。于2020 年6 月4 日采集小麥成熟期0 ～20 cm 土層的土壤樣品，每小區(qū)隨機取2 點，2 個采樣點的土壤混合作為1個分析樣品，用于測定土壤含水量、硝態(tài)氮含量、銨態(tài)氮含量和pH 值［13］。

1.3.2 根際土壤DNA 提取與PCR 擴增 DNA 提?。悍Q取-80 ℃保存的根際土壤0.5 g，采用試劑盒提取土壤微生物群落DNA（Fast DNA? Spin Kit for Soil，MP Biomedicals，USA），用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質(zhì)量［14］。PCR 擴增：細菌以引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′） 和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）進行細菌16sRNA 的V3-V4 高變區(qū)域擴增，真菌以引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）進行真菌ITS1 區(qū)域擴增。PCR 反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，27 個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在4 ℃進行保存（PCR 儀：ABI GeneAmp?9700 型）。

1.3.3 高通量測序 使用2% 瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn) 物， 利 用AxyPrepDNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CAM，USA）進行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用QuantusTMFluorometer（Promega，USA）對回收產(chǎn)物進行檢測定量，使用NRXTFLEX Rapid DNASeq Kit 進行建庫。利用I11umina 公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250 平臺進行測序。

1.4 測序數(shù)據(jù)處理和分析

測序數(shù)據(jù)的處理參考Wang 等人［15］的方法。使用SPSS 軟件進行統(tǒng)計分析，微生物群落的α-多樣性采用一般線性模型-單因素進行方差分析，LSD 法進行多重比較（P＜ 0.05），微生物差異檢驗采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 追氮時期對土壤微生物群落α-多樣性的影響

對不同追氮時期小麥根際土壤微生物群落α-多樣性指數(shù)進行分析（表1），結(jié)果表明細菌16S-rRNA 測序文庫覆蓋度均超過97%，真菌ITS測序文庫覆蓋度均超過99%，表明各處理測序數(shù)據(jù)達到飽和，其結(jié)果能反應(yīng)真實樣本條件。

表1 根際土壤微生物群落的α-多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity index of rhizosphere soil microbial community

Sobs 值代表可觀測到的微生物物種數(shù)變化情況，數(shù)值越大說明優(yōu)勢菌群地位越突出。與N0相比，NE、NB、NH處理的細菌Sobs 值有降低的趨勢，NF處理細菌Sobs 值顯著降低10.5%（表1），表明基施氮+拔節(jié)期追氮+開花期追氮（NF）較不施氮相比降低了土壤中細菌OTU 數(shù)。與N0處理相比，NE、NB、NF處理Shannon 指數(shù)顯著降低，而NH處理無顯著差異，表明拔節(jié)期追氮、孕穗期追氮和開花期追氮降低了土壤中細菌的多樣性。NE和NF處理Simpson 指數(shù)顯著高于不施氮處理（N0），而不同追氮時期處理間無顯著差異。細菌各處理間ACE指數(shù)亦無顯著差異，表明施用氮肥和不同追氮時期對細菌群落豐富度無明顯影響。細菌Chao 1 指數(shù)各處理間表現(xiàn)出與Sobs 值相同的規(guī)律。真菌Sobs 值、Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)、ACE 指數(shù)、Chao 1指數(shù)各處理間無顯著差異。

2.2 不同追氮時期根際土壤微生物共有菌群分析

按照97%的相似性非重復(fù)序列（不含單序列）進行聚類后，共得到細菌OTU 總數(shù)量為6 741，真菌OTU 總數(shù)量為1 550（圖1）。通過Venn 圖可以直觀體現(xiàn)不同處理間OTU 組成的差異性和重疊情況，由圖1a 可以看出，各處理共有細菌OTU 數(shù)量為3 181，占各處理細菌總OTU 數(shù)量的47.19%，N0、NE、NB、NH和NF各 處 理 特 有 細 菌OTU 數(shù)量 分 別 為305、197、166、206、152，施 氮 處 理特異性細菌OTU 數(shù)量較不施氮處理（N0）下降了32.5%～50.2%，表明施用氮肥會降低土壤中特異性細菌OTU 數(shù)；不考慮N0處理，各施氮處理共有細 菌OTU 數(shù) 量 為3 355，NE、NB、NH和NF各 處理間特有細菌OTU 數(shù)量分別為318、271、310、230，NB處理和NF較NE處理特異性細菌OTU 數(shù)分別下降了14.8% 和27.7%，表明在孕穗期追氮和開花期追氮降低了土壤特異性細菌OTU 數(shù)。同樣，由圖1b 可以看出，各處理共有真菌OTU 數(shù)量為503，N0、NE、NB、NH和NF各處理特有真菌OTU 數(shù)量分別為104、79、74、102、73，與N0處理相比，NE、NB、NF處理特異性真菌OTU 數(shù)分別下降24.0%、28.8%、29.8%。施氮處理中，NE、NB、NH和NF各處理特有真菌OTU 數(shù)分別為107、92、144、86，與NE處理相比，NH處理特異性真菌增加了34.6%，NB和NF處理則降低了14.0%和19.6%。

圖1 不同追氮時期根際土壤細菌（a）和真菌（b）OTUs 的Venn 圖Fig.1 Veen diagram of soil bacteria（a）and fungi（b）OTUs under different split N application timing

2.3 追氮時期對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成的影響

2.3.1 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成分析 各處理土壤細菌在門水平下的群落構(gòu)成基本一致（圖2a），檢測出的優(yōu)勢菌門（平均相對豐度＞1%）為放線菌門（Actinobacteriota）、變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、綠彎菌門（Chloroflexi)、擬桿菌門（Bacteroidota）、Myxococcota、厚壁菌門（Firmicutes）、髕骨細菌門（Patescibacteria）、芽 單 胞 菌 門（Gemmatimonadota）、 浮 霉 菌 門（Planctomycetota）和疣微菌門（Verrucomicrobiota）共11 個門類。其中，各處理細菌優(yōu)勢菌門的相對豐度占細菌總豐度的比例分別為89.2%、92.2%、93.3%、92.6% 和93.8%。 對 各 處 理 土壤真菌群落在門水平上的分類進行分析，結(jié)果如圖2b 所示，子囊菌門（Ascomycota）、未分類的真菌門類（unclassified_k__Fungi）、被孢霉門（Mortierellomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）為優(yōu)勢菌門，各處理真菌優(yōu)勢菌門的相對豐度占真菌總豐度的比例分別為95.1%、92.0%、95.1%、94.2%和85.4%。

圖2 不同追氮時期土壤細菌（a）和真菌（b）門水平下的相對豐度變化Fig.2 Changes of relative abundance of soil bacteria (a) and fungi (b) at the phylum level under different split N application timing

各處理根際土壤微生物在屬水平群落構(gòu)成基本一致（圖3）。對不同追氮時期小麥根際土壤細菌群落進行分析，共鑒定出978 個屬。對其中優(yōu)勢細菌群落（平均相對豐度＞1%）在屬水平上進行分類，相對豐度如圖3a 所示，norank_f__norank_o__Vicinamibacterales、norank_f__Vicinamibacteraceae、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、norank_f__JG30-KF-CM45、芽孢桿菌屬（Bacillus）、德沃斯氏菌屬（Devosia）8 個屬為優(yōu)勢細菌屬，各處理中8 個優(yōu)勢菌屬平均占總細菌屬豐度的19.8%。不同追氮時期小麥根際土壤真菌群落共鑒定出403 個屬，對優(yōu)勢真菌群落（平均相對豐度＞2%）在屬水平上進行分類，相對豐度如圖3b 所示，其優(yōu)勢菌屬為枝頂孢屬（Acremonium）、赤霉菌屬（Gibberella）、unclassified_k__Fungi、被孢霉屬（Mortierella）和枝孢屬（Cladosporium）5 個菌屬，平均占總真菌屬豐度的42.9%。

圖3 不同追氮時期土壤細菌（a）和真菌（b）屬水平下的相對豐度Fig.3 Changes of relative abundance of soil bacteria（a） and fungi（b）at the genus level under different split N application timing

2.3.2 土壤微生物群落組成差異性比較 對細菌在門水平和屬水平優(yōu)勢菌群的相對豐度進行差異檢驗，發(fā)現(xiàn)僅有綠彎菌門、疣微菌門的相對豐度處理間表現(xiàn)出顯著差異（圖4a），與不施氮處理N0相比，NE、NB、NF處理綠彎菌門相對豐度分別顯著下降了26.5%、31.8%、27.4%，不同追氮時期處理間無顯著差異，但NH處理較其他追氮處理表現(xiàn)出提高綠彎菌門相對豐度的趨勢。疣微菌門的相對豐度處理間表現(xiàn)為N0＞NE＞NH＞NB＞NF，與不施氮處理N0相比，NE處理疣微菌門的相對豐度無明顯差異，NB、NH處理有降低的趨勢，NF處理則顯著下降57.7%。與NE處理相比，隨著施氮時期的后移，疣微菌門的相對豐度有下降趨勢，其中開花期追氮時顯著下降56.9%。

對真菌在門水平和屬水平優(yōu)勢菌群的相對豐度進行差異檢驗，發(fā)現(xiàn)氮肥施用及不同追氮時期對赤霉菌屬、帚枝霉屬、鏈格孢屬的相對豐度影響顯著。與不施氮處理N0相比，NE處理顯著提高赤霉菌屬相對豐度，NF處理顯著提高帚枝霉屬和鏈格孢屬相對豐度，增幅分別為394.5%、390.9%。不同追氮時期處理間，赤霉菌屬、帚枝霉屬和鏈格孢屬的相對豐度無顯著差異（圖4b）。

圖4 不同追氮時期土壤微生物組成差異檢驗Fig.4 Soil microbial composition difference test under different split N application timing

2.4 追氮時期土壤環(huán)境因子與微生物群落結(jié)構(gòu)的冗余分析

各處理下土壤細菌門水平群落組成與環(huán)境因子的RDA 分析結(jié)果（圖5）表明，2 個排序軸共解釋了26.41%的細菌群落變化，其中第一個軸解釋了25.70%，第二個軸解釋了0.71%。在所分析的4 個指標中，土壤環(huán)境因子中的含水量與N0處理呈正相關(guān)分布關(guān)系，綠彎菌門、疣微菌門、髕骨細菌門也和N0處理呈顯著呈正相關(guān)分布關(guān)系，說明氮肥施用后，土壤含水量的變化定向改變了土壤中細菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)，但氮肥處理間土壤細菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)無差異。

圖5 不同處理下土壤環(huán)境因子與土壤細菌門水平群落組成的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis of soil environmental factors and soil bacterial phylum level community composition under different treatments

在屬水平上對土壤真菌群落進行冗余分析（RDA），如圖6 所示。RDA 分析的前兩個軸共解釋了29.15%的真菌群落變化，第一個軸解釋了19.42%，第二個軸解釋了9.73%。土壤pH 值、硝態(tài)氮含量、銨態(tài)氮含量和含水量與各處理無明顯相關(guān)關(guān)系，但枝頂孢屬與硝態(tài)氮含量、銨態(tài)氮含量和含水量呈顯著負相關(guān)系，而unclassified_k__Fungi、被孢霉屬、枝孢屬等菌屬和硝態(tài)氮含量、銨態(tài)氮含量和含水量呈正相關(guān)關(guān)系。

圖6 不同處理下土壤環(huán)境因子與土壤真菌屬水平群落組成的冗余分析Fig.6 Redundancy analysis of soil environmental factors and soil fungi genus level community composition under different treatments

3 討論

土壤中氮素狀況是土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)變化的主要驅(qū)動力之一［5-6］。許多研究表明，施用無機氮會降低土壤微生物多樣性［5,16］，其原因是氮素供應(yīng)促進了土壤中微生物DNA/RNA 的復(fù)制，提高了一些蛋白代謝相關(guān)基因的豐度，有利于富營養(yǎng)微生物的生長和繁殖，導(dǎo)致多樣性降低［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，與不施氮處理相比，施用氮肥降低了細菌Sobs 值、Shannon 指數(shù)和Chao 1 指數(shù)，與前人研究結(jié)果基本一致［5,16］。王淑貞［11］研究表明，分次施氮（基施氮+拔節(jié)期追氮+灌漿期追氮）提高了土壤真菌的多樣性，而本試驗未發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，其原因可能是本試驗后期施氮處理第3 次追氮的時期與之不同造成的。Chen 等［9］研究表明，根際微生物群落結(jié)構(gòu)在分蘗期因施氮水平不同而出現(xiàn)顯著差異，但在拔節(jié)期和成熟期又趨于相似，說明氮素的輸入確實會影響微生物群落結(jié)構(gòu)，但是隨著小麥生育期推進，土壤中氮素減少，微生物群落多樣性趨于穩(wěn)定。本試驗在總施氮量一致的基礎(chǔ)上，分別于孕穗期、抽穗期和開花期追施氮肥，隨小麥生育期推進，微生物群落結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，這可能是本試驗至小麥成熟期各施氮處理間根際微生物多樣性無顯著差異的原因之一。

研究表明［15］，小麥根際土壤細菌在門水平的優(yōu)勢菌門為放線菌門、變形菌門、酸桿菌門和綠彎菌門等，在屬水平的優(yōu)勢菌屬為norank_f__norank_o__Vicinamibacterales、norank_f__Vicinamibacteraceae、norank_f__norank_o__norank_c_KD4-96和norank_f__JG30-KF-CM45等，與本研究結(jié)果在門水平基本一致，而在屬水平存在差異。本研究表明，在門水平，綠彎菌門和疣微菌門的豐度在處理間表現(xiàn)出顯著差異。氮肥施用顯著影響了綠彎菌門的生長，綠彎菌門的營養(yǎng)方式極為多樣，其中化能自養(yǎng)是其主要的營養(yǎng)方式，而在氮循環(huán)中，綠彎菌門參與了硝化作用，它可以促進的氧化，加快了的形成［18］。在本試驗中，不施氮處理的土壤有效態(tài)氮素含量較低，綠彎菌門可以促進硝化過程的進行，產(chǎn)生更多利于小麥吸收的硝態(tài)氮。疣微菌門在土壤中普遍存在，但其豐度和功能可能被低估了［19］，有研究表明，疣微菌門中存在多種多樣、連接稀疏的非核糖體肽合成酶系統(tǒng)，其基因簇中有合成抗生素的潛能［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，與基施氮+拔節(jié)期追氮（NE）處理相比，隨著施氮時期后移，疣微菌門的相對豐度有下降趨勢，在開花期時達顯著水平，說明在開花期追施氮肥，可能會導(dǎo)致土壤中抗生素的合成減少，不利于小麥抗病。本研究還表明，真菌在門水平上的優(yōu)勢菌門為子囊菌門，其相對豐度平均占總真菌群落的80%以上，與肖苗苗等人［15］的研究一致。此外，施用氮肥會使土壤中赤霉菌屬、帚枝霉屬和鏈格孢屬的相對豐度增加，尤其是在無后期施氮（NE）和開花期追氮（NF）處理，而鏈格孢屬豐度的提高可能會使小麥更易發(fā)生病害。

土壤環(huán)境因子（如pH 值、含水量和養(yǎng)分狀況）對土壤微生物生長具有重要作用，這也是導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的主要原因之一［21-22］。Zhao等人［23］研究表明，在中國北方石灰性土壤中，土壤硝態(tài)氮含量是驅(qū)動土壤細菌群落變化的最重要的因素之一。本研究RDA 分析表明，土壤含水量是影響土壤細菌群落組成的關(guān)鍵因素，而土壤硝態(tài)氮含量、銨態(tài)氮含量和pH 值與細菌群落無顯著相關(guān)性。其中，綠彎菌門、疣微菌門、髕骨細菌門均與土壤含水量呈顯著正相關(guān)，與馬大龍［24］等研究結(jié)果類似。

4 結(jié)論

氮肥的施用降低了土壤細菌群落α-多樣性，而對真菌群落α-多樣性無明顯影響，不同追氮時期對小麥根際土壤微生物群落α-多樣性無顯著影響。施用氮肥能夠降低小麥根際土壤細菌多樣性以及綠彎菌門和疣微菌門的相對豐度。施氮量相同時，追氮時期對小麥根際細菌多樣性無顯著影響，但基施氮+拔節(jié)期追氮+開花期追氮的氮肥運籌方式顯著降低了疣微菌門的相對豐度。施氮對小麥根際真菌多樣性無明顯影響，但增加了赤霉菌屬、帚枝霉屬、鏈格孢屬的相對豐度，追氮時期對小麥根際真菌群落和結(jié)構(gòu)無明顯影響。綜上所述，追氮時期對強筋小麥根際土壤微生物多樣性沒有顯著影響，但開花期追氮較無后期追氮處理降低了抗生素合成相關(guān)的疣微菌門相對豐度。