硼上調(diào)皖西白鵝產(chǎn)蛋期卵巢IGFBP3、DRD2和CDK1基因表達(dá)

趙春芳， 金吉雄， 張夢玲， 葉園園， 隋蘭偉，韓玉皎， 任 曼， 靳二輝,2， 李升和*

(1.安徽科技學(xué)院 動物營養(yǎng)調(diào)控與健康安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 鳳陽 233100;2.安徽安豐堂動物藥業(yè)有限公司，安徽 廬江 231521)

皖西白鵝源于安徽六安,是經(jīng)過長期的自然選擇和人工選育誕生的中國優(yōu)良鵝種,其具有明顯的季節(jié)性就巢,這為推廣皖西白鵝的養(yǎng)殖造成了一定的難度[1]。改善皖西白鵝的就巢性能有利于該品種的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展,推廣皖西白鵝的養(yǎng)殖,提高其市場占有量。硼是一種具有生物活性的微量元素,動物個體可從豆類和飲用水等中獲得,飼糧中的營養(yǎng)物質(zhì)可為畜禽個體提供生理濃度的硼元素[2]。在動物飼料中補(bǔ)充酵母菌,需要更多的硼元素來保證這些生物的生長和生物活性的發(fā)揮[3]。飲用水中補(bǔ)充100 mg/L硼對4～6周齡肉雞的生長性能和免疫器官的發(fā)育有積極影響[4]。低劑量的硼可顯著提高體外培養(yǎng)的睪丸支持細(xì)胞的存活能力[5]。

IGFBP3為胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3,是IGFs系統(tǒng)的重要組成成員,是生長和繁殖信號通路的重要節(jié)點(diǎn)之一。有研究表明,IGF1參與卵泡的發(fā)育調(diào)控,是預(yù)防卵泡閉鎖所必須的,IGF1在顆粒細(xì)胞的增殖和分化中起關(guān)鍵作用[6]。IGFBP3是IGFs家族中最為重要的運(yùn)輸載體,可直接與90%以上的受體結(jié)合,能夠間接調(diào)控IGFs的生物學(xué)作用[7]。DRD2為多巴胺受體D2,屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor,GPCR)家族成員,介導(dǎo)的信號通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分泌和細(xì)胞活力[8]。多巴胺受體是結(jié)合在膜上的供神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺(DA)識別的位點(diǎn),依據(jù)生化和藥理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)將此受體分為D1和D2兩種類型[9]。周期依賴性蛋白激酶CDK,是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,該類激酶可以與細(xì)胞周期蛋白(cyclin)協(xié)同作用,參加細(xì)胞周期的調(diào)控;CDK可以和cyclin結(jié)合形成異二聚體,催化不同的底物發(fā)生磷酸化,對細(xì)胞周期的不同時段進(jìn)行調(diào)節(jié)[10]。本試驗(yàn)通過檢測不同硼水平下卵巢組織中這三個就巢相關(guān)基因的差異表達(dá)情況,為通過飼料營養(yǎng)調(diào)控鵝繁殖性能提供更多的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

120只體重相近、健康的一年齡皖西白鵝,由安徽省六安市金安區(qū)飛翔皖西白鵝遺傳資源保護(hù)中心提供。硼酸(純度>99.5%,硼含量>17.4%)購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;Trizol試劑購于Gibco公司;EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒購于TransGen公司;SYBR Green購于Invitrogen公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

120只體重相近、健康的一年齡皖西白鵝隨機(jī)分為3組,每組40只,其中對照組飼喂基礎(chǔ)日糧,試驗(yàn)組基礎(chǔ)日糧中添加不同比例的硼元素。因硼的添加量需要用于專利申請,具體添加比例將在專利授權(quán)后公布。試驗(yàn)期60 d。試驗(yàn)結(jié)束后，采集皖西白鵝的卵巢組織,置于液氮中冷凍。

1.3 總RNA提取

將組織從液氮中取出,放入事先清洗、滅菌并冷凍好的研缽中,放入液氮進(jìn)行研磨,將組織磨碎并使用Trizol法提取組織的總RNA。為保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和精確性,測定提取的總RNA的濃度和純度,并采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測其完整性。

1.4 反轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)水平檢測

將總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,用于基因表達(dá)水平的檢測。以cDNA為反應(yīng)模板,SYBR Green為熒光染料,采用實(shí)時熒光定量PCR檢測不同硼水平下皖西白鵝產(chǎn)蛋期卵巢中IGFBP3、DRD2和CDK1基因的表達(dá)情況,其中IGFBP3、DRD2、CDK1和GAPDH基因的引物序列如表1所示。

表1 用于熒光定量PCR的引物序列

1.5 數(shù)據(jù)處理分析

所有數(shù)據(jù)的表示形式為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。對試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 21.0軟件中One-way ANOVA程序進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn),采用Duncan進(jìn)行多重比較分析,目的基因相對表達(dá)量用2-ΔΔCt法進(jìn)行計算。P<0.05或*表示差異顯著,P<0.01或**表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取質(zhì)量

如圖1所示,經(jīng)檢測,提取的總RNA的A260/A280值在2.0左右;利用1.5%凝膠電泳檢測RNA的完整性,結(jié)果顯示RNA的條帶比較清晰,其中28S和18S條帶較亮,5S條帶最暗,說明RNA沒有發(fā)生降解,質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 總RNA電泳圖

2.2 IGFBP3基因在卵巢中的表達(dá)水平

如圖2所示,與對照組相比,基礎(chǔ)日糧中添加不同濃度硼均可使IGFBP3基因的表達(dá)水平極顯著上調(diào)(P<0.01)。

圖2 卵巢中IGFBP3基因表達(dá)水平

2.3 DRD2基因在卵巢中的表達(dá)水平

如圖3所示,與對照組相比,基礎(chǔ)日糧中添加不同濃度硼均會使DRD2基因表達(dá)量上調(diào),其中低硼組DRD2基因表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。

圖3 卵巢中DRD2基因表達(dá)水平

2.4 CDK1基因在卵巢中的表達(dá)水平

如圖4所示,與對照組相比,基礎(chǔ)日糧中添加不同濃度硼均會使CDK1基因表達(dá)量上調(diào),在一定程度上使細(xì)胞周期的進(jìn)程加快,其中低硼組CDK1基因表達(dá)極顯著上調(diào)(P<0.01),高硼組CDK1基因表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。

圖4 卵巢中CDK1基因表達(dá)水平

3 結(jié)論與討論

有學(xué)者對IGFBP3基因的第一個外顯子和第一個內(nèi)含子的部分序列多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行研究,結(jié)果表明, 第一個內(nèi)含子對產(chǎn)蛋和生長發(fā)育很可能有一定的促進(jìn)作用[11-12]。閆曉娟等[13]采用 Western ligand blot 和 Western blot檢測卵巢腫瘤患者和卵巢正常的人中IGFBP3和IGFBP2表達(dá)水平的差異,結(jié)果顯示IGFBP3和IGFBP2表達(dá)改變可以引起卵巢細(xì)胞不同程度的增殖與分化,從而導(dǎo)致IGF-Ⅱ生物學(xué)功能發(fā)生改變[14]。金崇富等[14-15]研究結(jié)果顯示,IGFBP3基因可能是影響雞生長繁殖性狀的一個主效基因,或是與之存在緊密遺傳連鎖的一個標(biāo)記。固始雞飼養(yǎng)中利用飲水補(bǔ)硼,結(jié)果顯示100 mg/L硼添加量能夠使雞的體重和體增重發(fā)生顯著增加,具有促進(jìn)生長發(fā)育的作用[4]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同含量的硼可以影響IGFBP3基因的表達(dá),表現(xiàn)為使該基因表達(dá)上調(diào),推測在飼糧中添加微量元素硼可能通過影響IGFBP3基因的表達(dá),從而影響皖西白鵝的繁殖性能。

下丘腦弓狀核中的多巴胺細(xì)胞釋放多巴胺進(jìn)入門脈系統(tǒng),隨血流入垂體前葉,垂體前葉和中葉中存在多巴胺D2受體;在垂體前葉,多巴胺與催乳素細(xì)胞上的D2受體結(jié)合，抑制催乳素基因轉(zhuǎn)錄本在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上的表達(dá)[8,16],進(jìn)而抑制其合成和釋放的過程,影響禽類的就巢行為[17-18]。催乳素是參與禽類就巢發(fā)生和維持的關(guān)鍵激素[17,19]。在母禽產(chǎn)蛋期,卵泡會通過分泌孕酮和雌二醇,刺激下丘腦中的5-羥色胺神經(jīng)元和多巴胺神經(jīng)元分泌5-羥色胺和多巴胺,這兩種神經(jīng)遞質(zhì)通過與腺垂體催乳素細(xì)胞上的受體結(jié)合促進(jìn)催乳素的分泌[20-21],而高水平的催乳素可以直接抑制卵巢卵泡的發(fā)育和垂體促性腺激素的分泌,使卵巢萎縮,排卵停止,最終停止產(chǎn)蛋,表現(xiàn)出就巢行為[22-23]。

多巴胺受體也存在于外周,在交感神經(jīng)末梢上的D2受體,可抑制去甲腎上腺素的釋放。DRD2基因?qū)χ袠猩窠?jīng)系統(tǒng)以及腎臟等有著很重要的生理作用,在家禽的相關(guān)報道中也多體現(xiàn)在產(chǎn)蛋性能方面。葉峭研究發(fā)現(xiàn),DRD2基因中多個SNP位點(diǎn)的基因型與產(chǎn)蛋量和開產(chǎn)日齡都存在明顯差異,該基因與卵泡發(fā)育和卵巢癌發(fā)生有關(guān),可起到調(diào)節(jié)激素分泌和生殖行為的作用[24]。本試驗(yàn)中,檢測了DRD2在卵巢中的表達(dá),結(jié)果顯示硼可使DRD2表達(dá)上調(diào)。隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展,關(guān)于禽類就巢性分子遺傳基礎(chǔ)的研究已經(jīng)越來越多。大量就巢性內(nèi)分泌機(jī)制的研究表明,除PRL、VIP及VIPR1外,神經(jīng)遞質(zhì)5-HT和DA都參與了就巢行為的調(diào)控。

CDK1基因處于下丘腦-垂體-卵巢調(diào)控軸的核心位置,能夠整合來自下丘腦和垂體的信號,從而對卵巢和卵泡中的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)[25]。我們前期研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞培養(yǎng)液中添加低濃度硼(0.5 mmol/L)可使大鼠睪丸支持細(xì)胞周期的S期和G2/M 加快并抑制細(xì)胞凋亡,而添加高濃度的硼(40、80 mmol/L)會促進(jìn)細(xì)胞凋亡并將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期[5]。本研究發(fā)現(xiàn),日糧添加不同劑量的硼都會使CDK1基因表達(dá)上調(diào),該基因的差異表達(dá)或許會影響細(xì)胞周期進(jìn)程。

前期研究發(fā)現(xiàn),日糧中添加25 mg/kg硼可提高皖西白鵝飼料轉(zhuǎn)化率[26]。本研究揭示,日糧添加微量元素硼可不同程度地影響IGFBP3、DRD2和CDK1基因的表達(dá),可使3個基因的表達(dá)上調(diào)。3個基因表達(dá)水平的變化可在一定程度上揭示硼影響皖西白鵝繁殖性能分子作用機(jī)制。