甲醛與戊二醛固定劑對(duì)基于Ludox–QPS染色方法的研究結(jié)果對(duì)比

王苗勛 許媛

關(guān)鍵詞：多樣性;群落結(jié)構(gòu);微型底棲動(dòng)物;纖毛蟲(chóng);固定劑

0引言

微型底棲動(dòng)物個(gè)體微小且為單細(xì)胞，在海洋微食物環(huán)中扮演著重要的角色.其蟲(chóng)體脆弱，在離心分離過(guò)程中極易破碎.因此，如何有效地將其從沉積物中分離、固定并染色，成為微型底棲動(dòng)物生態(tài)學(xué)研究的技術(shù)瓶頸[1-3].徐奎棟等改進(jìn)的密度梯度離心結(jié)合定量蛋白銀染色法（LudoxDensityGradientCentrifugationCombinedwithQuantitativeProtargolStaining，Ludox–QPS）是研究微型底棲動(dòng)物生態(tài)學(xué)的重要手段[4-5]，并被納入了《海洋微型底棲生物調(diào)查規(guī)范》[6]中.

樣品固定是影響Ludox–QPS及后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析的重要因素.理想的固定方法應(yīng)盡可能少地引起細(xì)胞損失以及形態(tài)變化，能夠真實(shí)地反映微型底棲動(dòng)物的生活狀況[7].固定方法不當(dāng)，會(huì)導(dǎo)致部分物種丟失或形態(tài)破壞，不僅給鑒定造成困難，而且會(huì)導(dǎo)致對(duì)生物量的評(píng)估產(chǎn)生偏差，影響統(tǒng)計(jì)的準(zhǔn)確性及對(duì)群落組成和多樣性的分析[8-9].常見(jiàn)的固定劑類型有甲醛、戊二醛、魯哥氏液（Lugol’s）和波恩液（Bouin’s）等，種類繁多，性能也存在很大的差異[10].類彥立等[4]和Xu等[11]比較了2%戊二醛、4%甲醛、10%Lugol’s液與5%Bouin’s液，認(rèn)為酸性固定液（Lugol’s液與Bouin’s液）會(huì)引起Ludox膠體的凝結(jié)，降低固定液的固定效能，不適合Ludox–QPS研究[4，11]，pH值為中性的甲醛溶液與戊二醛溶液恰好滿足其條件.已有的《海洋微型底棲生物調(diào)查規(guī)范》建議使用終濃度為2%的戊二醛固定底棲纖毛蟲(chóng)樣品[6]，但由于戊二醛固定的樣品存在長(zhǎng)距離運(yùn)輸受限的問(wèn)題，使得在大地理尺度上進(jìn)行微型底棲動(dòng)物的研究受到限制.而經(jīng)甲醛固定的樣品在滿足一定條件下可以通過(guò)航空托運(yùn)運(yùn)輸，因此可滿足實(shí)驗(yàn)樣品的遠(yuǎn)距離運(yùn)輸要求[12].

前人針對(duì)浮游類群的研究，發(fā)現(xiàn)固定劑類型及濃度會(huì)引起部分個(gè)體的損失及形態(tài)變化，進(jìn)而影響對(duì)生物量的估計(jì)[13].Turley等[14]在研究中發(fā)現(xiàn)戊二醛固定的浮游生物的數(shù)目會(huì)隨時(shí)間減少，并進(jìn)一步證實(shí)了無(wú)論甲醛固定還是戊二醛固定均會(huì)引起細(xì)胞數(shù)量的損失.Choi等[15]發(fā)現(xiàn)戊二醛固定引起鞭毛蟲(chóng)蟲(chóng)體的收縮小于甲醛固定，而對(duì)于寡毛類纖毛蟲(chóng)而言，甲醛固定引起的收縮反而小于Lugol’s和戊二醛等固定劑.已有的文獻(xiàn)[10，16-18]也提到，甲醛是相對(duì)于其他固定劑（如戊二醛）對(duì)細(xì)胞體積影響最小的.曾鈺婷[19]對(duì)臺(tái)灣地區(qū)近海經(jīng)甲醛固定及室內(nèi)培養(yǎng)的浮游纖毛蟲(chóng)結(jié)合定量蛋白銀染色研究發(fā)現(xiàn)，甲醛固定不影響“屬”級(jí)的鑒定，部分能夠鑒定到“種”級(jí).上述研究均源自浮游樣品或室內(nèi)培養(yǎng)的有限種的分析結(jié)果，而對(duì)于底棲類群的報(bào)道甚少.迄今，國(guó)內(nèi)外針對(duì)固定劑類型對(duì)底棲類群影響的研究十分有限，僅有孟昭翠等[20]對(duì)采自黃海海域并經(jīng)甲醛固定的底棲生物樣品的研究，發(fā)現(xiàn)底棲鞭毛蟲(chóng)會(huì)隨固定時(shí)間延長(zhǎng)而造成一定數(shù)量的低估.

因此，為對(duì)比甲醛固定與戊二醛固定經(jīng)Ludox–QPS染色后的微型底棲動(dòng)物群落的研究結(jié)果是否具有可比性，本研究于2019年4月在上海南匯邊灘采集了3種生境的微型底棲動(dòng)物樣品，并分別采用甲醛和戊二醛作為固定劑，后期進(jìn)行Ludox–QPS染色實(shí)驗(yàn)并對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果.這為以后采用何種固定劑進(jìn)行微型底棲動(dòng)物生態(tài)學(xué)研究及采用不同固定劑的研究結(jié)果是否具有可比性提供相應(yīng)的研究依據(jù).

1材料與方法

1.1 采樣區(qū)域、方法及固定方式

本研究于2019年4月在上海市南匯邊灘（30°51′39″N，121°55′06″E）選取光灘、海三棱藨草灘以及沙灘3種生境（圖1），每種生境隨機(jī)選取兩個(gè)樣點(diǎn)作為平行樣.

使用直徑約1.5cm的自制采樣器，在每個(gè)樣點(diǎn)隨機(jī)采集6個(gè)表層平行芯樣（0～2cm，約24mL），隨機(jī)分成2組（每組3個(gè)芯樣），一組使用終濃度1%的甲醛溶液固定，另一組使用終濃度2%的戊二醛溶液固定.

1.2 Ludox–QPS及物種鑒定

Ludox–QPS實(shí)驗(yàn)過(guò)程參照《海洋微型底棲生物調(diào)查規(guī)范》，依次對(duì)樣品進(jìn)行稀釋降鹽、密度梯度離心、真空抽濾、瓊脂包埋、蛋白銀染色、脫水與封片等過(guò)程，獲得永久裝片[6].

使用光學(xué)顯微鏡（BX53，OLYMPUS，日本）在200～1000倍下進(jìn)行鏡檢，對(duì)目標(biāo)生物測(cè)量長(zhǎng)（L）和寬（D）[6].參照宋微波等[21]、Carey[1]和Lynn[22]等分類文獻(xiàn)對(duì)纖毛蟲(chóng)進(jìn)行鑒定，并根據(jù)各自特征進(jìn)行類群劃分.

1.3 纖毛蟲(chóng)生物量的計(jì)算

通過(guò)鏡檢測(cè)量纖毛蟲(chóng)個(gè)體的長(zhǎng)（L）和寬（D），并根據(jù)蟲(chóng)體最接近的幾何形狀計(jì)算體積（V），通過(guò)轉(zhuǎn)換系數(shù)對(duì)纖毛蟲(chóng)的生物量進(jìn)行估算.一般每種纖毛蟲(chóng)隨機(jī)選取20只個(gè)體（如果個(gè)體不足20只則全部計(jì)數(shù)）進(jìn)行測(cè)量，最后取平均值[5，23].甲醛固定樣品的轉(zhuǎn)換系數(shù)為0.14pg/μm3，戊二醛固定樣品的轉(zhuǎn)化系數(shù)為0.20pg/μm3[5，24].

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Primer–E7.0軟件對(duì)纖毛蟲(chóng)豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行平方根轉(zhuǎn)換，并計(jì)算Bray–Curtis相似性矩陣，在DIVERSE模塊中計(jì)算物種數(shù)（S）、個(gè)體數(shù)（N）、香農(nóng)–維納多樣性指數(shù)（H'）和均勻度指數(shù)（J'）.公式如下：

對(duì)底棲纖毛蟲(chóng)群落的物種組成、多樣性參數(shù)及生物量數(shù)據(jù)在0.05水平上進(jìn)行ANOSIM（AnalysisofSimilarities）雙因素（生境類型和固定劑類型）交叉分析[25].并根據(jù)Bray–Curtis相似性矩陣進(jìn)行NMDS（NonmetricMultidimensionalScaling）分析，以顯示不同固定劑、不同生境采集的底棲纖毛蟲(chóng)群落物種組成的相似性.

2結(jié)果

2.1 物種組成

本研究中共檢獲底棲纖毛蟲(chóng)26科33屬39種，分別屬于側(cè)口類、前口類、小胸類、盾纖類、核殘跡類、鉤刺類、腹毛類、寡毛類、膜口類及管口類10個(gè)類群.其中，甲醛固定的樣品中檢獲9類26種，戊二醛固定的檢獲10類26種（圖2），剛毛刺葉蟲(chóng)（Kentrophyllumsetigerum，屬于側(cè)口類）為優(yōu)勢(shì)種.

2.2 群落結(jié)構(gòu)

2.2.1ANOSIM雙因子交叉分析

ANOSIM雙因子（生境類型與固定劑類型）交叉分析結(jié)果表明：雖然不同生境（光灘、沙灘和海三棱藨草灘）中的底棲纖毛蟲(chóng)群落之間存在顯著性差異（p<0.05，表1），但兩種固定方式獲得的底棲纖毛蟲(chóng)群落物種組成、多樣性參數(shù)（物種數(shù)、個(gè)體數(shù)、均勻度和香農(nóng)-維納多樣性指數(shù)）以及生物量均無(wú)顯著性差異（p>0.05，表1）.

2.2.2NMDS分析

NMDS分析結(jié)果（stress=0.11）顯示，兩種固定方式固定的群落結(jié)構(gòu)之間區(qū)分不明顯，海三棱藨草灘與其他生境（光灘和沙灘）之間的群落結(jié)構(gòu)存在明顯區(qū)分（圖3）.

2.3 底棲纖毛蟲(chóng)生物量

甲醛固定與戊二醛固定獲得的平均生物量分別為（0.32±0.11）μgC/mL與（0.35±0.07）μgC/mL.兩種固定方式獲得的底棲纖毛蟲(chóng)生物量在不同生境（海三棱藨草灘、光灘和沙灘）中的分布狀況趨同（圖4），通過(guò)ANOSIM雙因子交叉分析結(jié)果（表1）可知，底棲纖毛蟲(chóng)群落的生物量在不同生境間存在顯著性差異（p<0.01），但在兩種固定方式之間不存在顯著性差異（p>0.05）.

2.4 兩種固定方式的Ludox–QPS染色效果

甲醛固定與戊二醛固定的樣品經(jīng)過(guò)Ludox–QPS染色后獲得的纖毛蟲(chóng)染色圖式如圖5所示.兩種方法獲得的蟲(chóng)體形態(tài)均基本完整，無(wú)明顯收縮;纖毛圖式染色尚可;細(xì)胞內(nèi)質(zhì)著色均勻，且多數(shù)個(gè)體細(xì)胞核清晰可見(jiàn).可根據(jù)其纖毛排列、口區(qū)位置及細(xì)胞核形狀與數(shù)目等結(jié)構(gòu)，將其鑒定到“屬”級(jí)甚至“種”級(jí)的水平（圖5）.

3討論

3.1 固定劑的性質(zhì)

甲醛溶液與戊二醛溶液都是微型底棲生態(tài)學(xué)中常見(jiàn)的固定劑，兩者在性能上存在較大差異[26-30].甲醛穿透能力較弱，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)保存效果不佳，僅能夠滿足普通光學(xué)顯微鏡觀察的需求;而戊二醛對(duì)細(xì)胞核以及膜系統(tǒng)的保存能力優(yōu)于甲醛，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)能夠很好地保存，可滿足分辨率更高的電鏡觀察[31].甲醛與戊二醛作為固定劑均會(huì)在一定程度上引起目標(biāo)生物的形態(tài)發(fā)生變化[13，15]，但也有學(xué)者認(rèn)為，甲醛固定能夠減少蟲(chóng)體的收縮程度，更能夠客觀地反映實(shí)際生物量狀況[15].甲醛溶液與戊二醛溶液不會(huì)造成Ludox硅膠液凝結(jié)，均適合LudoxHS–40硅膠液對(duì)微型底棲動(dòng)物進(jìn)行提取[2]，但采用戊二醛固定的樣品還需在冷凍條件下保存.

3.2 兩種固定方式對(duì)物種鑒定的影響

本研究采用甲醛固定與戊二醛固定兩種方式結(jié)合Ludox–QPS染色獲得的纖毛蟲(chóng)圖式（圖5），與前人研究中（均由戊二醛固定）采用Ludox–QPS染色獲得的底棲纖毛蟲(chóng)圖式效果一致[2，5，32]，均可根據(jù)體表纖毛結(jié)構(gòu)、口區(qū)結(jié)構(gòu)等特征鑒定到“屬”級(jí)或“種”級(jí).前人對(duì)浮游類群纖毛蟲(chóng)利用甲醛或戊二醛固定，同樣可以通過(guò)形態(tài)特征辨別至“屬”和“種”級(jí)水平[33-34]，可見(jiàn)兩種固定方式對(duì)纖毛蟲(chóng)種類的辨別無(wú)明顯影響.相關(guān)研究結(jié)果不僅能提供底棲纖毛蟲(chóng)形態(tài)方面的信息，還能計(jì)算生態(tài)學(xué)分析所需的豐度、豐富度、物種數(shù)等生物群落數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)可用于后續(xù)的ANOSIM分析和NMDS分析等過(guò)程，為開(kāi)展微型底棲動(dòng)物生態(tài)學(xué)研究提供便利.

3.3 不同固定方式獲得的底棲纖毛蟲(chóng)群落結(jié)構(gòu)對(duì)比

針對(duì)甲醛固定與戊二醛固定的采自3種生境的底棲纖毛蟲(chóng)群落，經(jīng)過(guò)ANOSIM分析（表1），結(jié)果表明，其群落的物種組成、4種群落多樣性參數(shù)（物種數(shù)、個(gè)體數(shù)、均勻度，香農(nóng)–維納多樣性指數(shù)）以及生物量方面均差異不顯著（p>0.05）.NMDS分析（stress=0.11，介于0.1到0.2之間）同樣表明，同一生境的兩種固定劑固定的底棲纖毛蟲(chóng)群落的物種組成相似.與Xu等[35]在相同區(qū)域的研究比較，優(yōu)勢(shì)種（Kentrophyllumsetigerum）未發(fā)生改變，但豐度和多樣性較低，其原因可能與樣品的采集時(shí)間或采集強(qiáng)度有關(guān).海三棱藨草灘、光灘和沙灘的多種環(huán)境因子存在明顯的差異[35]，是造成物種組成、均勻度、個(gè)體數(shù)和生物量間顯著性差異（表1，p<0.05）的主要原因.前人在浮游樣品的研究中認(rèn)為，無(wú)論何種固定劑（甲醛或戊二醛）細(xì)胞數(shù)目隨時(shí)間均會(huì)在一定程度上影響數(shù)據(jù)的呈現(xiàn)[36]，在底棲樣品中，孟昭翠等[20]研究發(fā)現(xiàn)，甲醛固定的微型底棲動(dòng)物（鞭毛蟲(chóng)）樣品保存4個(gè)月比保存1個(gè)月豐度降低47.4%，但短時(shí)間內(nèi)影響有限.本研究在樣品采集后4d內(nèi)即完成Ludox–QPS染色，在一定程度上減少了保存時(shí)間對(duì)定量研究的影響.目前，尚無(wú)直接證據(jù)表明甲醛與戊二醛兩種固定方式對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生差異，說(shuō)明甲醛可作為微型底棲動(dòng)物的固定劑用于固定Ludox–QPS實(shí)驗(yàn)所需的材料，并且可將其研究結(jié)果與戊二醛固定后的研究結(jié)果進(jìn)行比較.

3.4 特殊類群的比較

本研究中膜口類（Maritujapelagica，1種，占1.32%，圖2）僅出現(xiàn)在戊二醛固定的樣品中，未出現(xiàn)在甲醛固定的樣品中，該現(xiàn)象或許與固定劑的固定能力有關(guān).然而，與馬族航[32]對(duì)崇明東灘濕地的底棲纖毛蟲(chóng)群落和劉華雪等[37]對(duì)南海區(qū)域的微型動(dòng)物群落的研究對(duì)比，前者以戊二醛（終濃度2%）為固定劑，后者以甲醛（終濃度2%）為固定劑，均能固定到大量的膜口類纖毛蟲(chóng).本研究中前口類（占32.92%）、側(cè)口類（占19.88%）和腹毛類（占13.35%）等類群占極大優(yōu)勢(shì)，與已有的研究結(jié)果基本吻合[26，32，35，38]，膜口類在本次研究區(qū)域內(nèi)豐度極低，僅占0.64%.因此，該現(xiàn)象可能是膜口類纖毛蟲(chóng)在本區(qū)域內(nèi)豐度極低，僅被偶然采集到戊二醛固定的樣品中，而與甲醛的固定能力無(wú)關(guān).但也并不排除固定劑會(huì)對(duì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)存在一定程度的影響，這需要從細(xì)胞學(xué)角度進(jìn)一步研究.

4結(jié)論

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，甲醛作為固定劑可結(jié)合Ludox–QPS染色開(kāi)展微型底棲動(dòng)物生態(tài)學(xué)研究，這將為在較大地理尺度上開(kāi)展相關(guān)的研究提供便利.本研究表明，采用甲醛和戊二醛兩種固定劑進(jìn)行Ludox–QPS染色后的研究結(jié)果具有可比性.