黃芩素和漢黃芩素抑制肝癌細(xì)胞能量代謝的作用機(jī)制差異研究

許珂嘉 張子蒙 付傳奎 陳志鵬 李偉東 吳麗

關(guān)鍵詞黃芩素;漢黃芩素;肝癌細(xì)胞;能量代謝;糖酵解代謝表型;線粒體能量代謝

以有氧糖酵解為代表的能量代謝重編程是腫瘤細(xì)胞的重要特征，常伴有不同程度的線粒體能量代謝異常[1]。這種代謝變化是腫瘤細(xì)胞為滿足快速增殖需要，在提供一定數(shù)量三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的同時(shí)，為蛋白質(zhì)、脂類和核酸等生物大分子的合成提供充足的中間體，并實(shí)現(xiàn)細(xì)胞能量代謝與物質(zhì)代謝相平衡的一種適應(yīng)性改變[1-5]。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)很多腫瘤細(xì)胞的能量代謝出現(xiàn)了糖酵解和氧化磷酸化均顯著增強(qiáng)的特點(diǎn)，且在不同條件下存在顯著的異質(zhì)性和可塑性，能夠影響疾病的進(jìn)展與轉(zhuǎn)歸[6-9]。這種能量代謝表型的改變?yōu)榭鼓[瘤治療提供了潛在的治療靶點(diǎn)。

現(xiàn)代研究表明，黃芩中的有效成分主要為黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等，其中黃芩素和漢黃芩素具有共同的母核，黃芩素含有3 個(gè)相鄰羥基，而漢黃芩素中的1 個(gè)羥基被甲氧基取代，兩者同為黃芩抗腫瘤作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[10-11]。作者團(tuán)隊(duì)前期的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果提示，黃芩素、漢黃芩素可通過抑制腫瘤細(xì)胞的能量代謝產(chǎn)生抗腫瘤作用[12]。本文旨在研究黃芩素和漢黃芩素影響肝癌細(xì)胞能量代謝的不同作用特點(diǎn)，分析兩者影響肝癌細(xì)胞能量代謝的構(gòu)效關(guān)系，以期為黃芩素和漢黃芩素的抗腫瘤作用機(jī)制研究提供新的思路。

1 材料

1.1 儀器

A1301026 型低溫高速離心機(jī)購(gòu)自上海艾測(cè)電子科技有限公司;SW-CJ-1G型雙人無菌操作臺(tái)購(gòu)自蘇州市蘇杭科技器材有限公司;INCO108 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)Memmert 公司;Seahorse XF96 生物能量檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)Seahorse Bioscience 公司;CKX-31 倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司;KQ5200DB臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司;BP121S 電子分析天平購(gòu)自瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 藥物與試劑

黃芩素（純度≥98%，批號(hào)H-018-170427）、漢黃芩素（純度≥98%，批號(hào)H-019-180823）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;MTT（批號(hào)23305-68-2）、線粒體酶復(fù)合物Ⅰ～Ⅴ（CⅠ～Ⅴ）抗體（批號(hào)分別為12444-1-AP、14865-1-AP、10894-1-AP、55070-1-AP、15999-1-AP）、己糖激酶（hexokinase，HK）抗體（批號(hào)22029-1-AP）、磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）抗體（批號(hào)55028-1-AP）、丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）抗體（批號(hào)15822-1-AP）、ATP5F1 抗體（貨號(hào)15999-1-AP）、NDUFS1 抗體（貨號(hào)12444-1-AP）、PK-Specific 抗體（貨號(hào)15822-1-AP）、CYB5R3 抗體（貨號(hào)10894-1-AP）、HK2抗體（貨號(hào)13105-1-AP）、MTCO2抗體（貨號(hào)55070-1-AP）、SDHA 抗體（貨號(hào)14865-1-AP）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體和羊抗兔IgG 二抗購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司;二甲基亞砜（批號(hào)BCBR6170V）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;2- 脫氧-D- 葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG，批號(hào)BCBC9986V）、寡霉素（ATP 合酶阻滯劑，批號(hào)089K7008V）、魚藤酮（CⅠ抑制劑，批號(hào)MKBZ2534V）、線粒體壓力測(cè)試試劑盒（貨號(hào)103015-100）、糖酵解壓力測(cè)試試劑盒（貨號(hào)103020-100）購(gòu)自美國(guó)Seahorse Bioscience公司;抗霉素A（C Ⅲ 抑制劑，貨號(hào)MS0070-10MG）購(gòu)自上海懋康生物科技有限公司;RIPA裂解液（貨號(hào)P0013K）、苯甲基磺酰氟（PMSF，貨號(hào)ST506）、TBST緩沖液（貨號(hào)P0231）、增強(qiáng)型ATP 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)112614170503）、BCA 蛋白質(zhì)分析試劑盒（批號(hào)102815160401）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)胞

人肝癌HepG2細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

2 方法

2.1 HepG2 細(xì)胞活力檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞接種至96 孔板中，每孔含1×104 個(gè)細(xì)胞，于37 ℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。根據(jù)作者團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[12]，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組（不給藥）、黃芩素不同劑量組和漢黃芩素不同劑量組（均為1.25、2.5、5、10、20 μmol/L），分別加入相應(yīng)劑量的黃芩素和漢黃芩素培養(yǎng)24 h，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入0.5% MTT 溶液20 μL，37 ℃孵育4 h后，每孔加入100 μL 二甲基亞砜振蕩10 min，在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度（A）值，計(jì)算得6 個(gè)復(fù)孔的平均A值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-給藥組平均A 值/空白對(duì)照組平均A 值）×100%，利用SPSS 軟件計(jì)算2 種藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.2 HepG2 細(xì)胞中ATP濃度檢測(cè)

采用增強(qiáng)型ATP 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。將HepG2 細(xì)胞接種至48 孔板中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，每孔含2.5×104個(gè)細(xì)胞。根據(jù)“2.1”項(xiàng)下篩選結(jié)果，以不影響細(xì)胞活力為前提，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組（不給藥）、黃芩素組、漢黃芩素組，分別加入相應(yīng)劑量的黃芩素和漢黃芩素培養(yǎng)12 h，每組6 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，檢測(cè)細(xì)胞中ATP 濃度，再通過BCA 蛋白分析試劑盒將細(xì)胞內(nèi)的ATP濃度標(biāo)準(zhǔn)化為蛋白質(zhì)含量。

2.3 HepG2 細(xì)胞糖酵解壓力測(cè)試和線粒體壓力測(cè)試

將HepG2 細(xì)胞接種至96 孔板中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，每孔含5×103個(gè)細(xì)胞。根據(jù)“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行細(xì)胞分組、給藥，培養(yǎng)12 h，每組6 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，采用帶有糖酵解和線粒體壓力測(cè)試試劑盒的生物能量檢測(cè)儀分別檢測(cè)細(xì)胞外酸化率和細(xì)胞耗氧率，評(píng)價(jià)細(xì)胞糖酵解及線粒體能量代謝水平。細(xì)胞使用測(cè)定培養(yǎng)基洗滌后，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h。在糖酵解壓力測(cè)試中，于22 min時(shí)加入10 mmol/L葡萄糖，檢測(cè)基礎(chǔ)細(xì)胞外酸化率;于44 min時(shí)加入1 μmol/L寡霉素，檢測(cè)細(xì)胞最大酸化率，即細(xì)胞的最大糖酵解水平;于72 min 時(shí)加入50 mmol/L 2-DG，檢測(cè)細(xì)胞非糖酵解的酸化率。在線粒體壓力測(cè)試中，基礎(chǔ)耗氧率為加入寡霉素前的細(xì)胞耗氧率;于22 min 時(shí)加入0.5 μmol/L寡霉素;于44 min 時(shí)加入試劑盒自帶的氧化磷酸化解偶聯(lián)劑FCCP（0.5 μmol/L），檢測(cè)最大細(xì)胞耗氧率，呼吸儲(chǔ)備功能為最大細(xì)胞耗氧率與基礎(chǔ)細(xì)胞耗氧率之間的差異;于72 min 時(shí)加入0.5 μmol/L魚藤酮和0.5 μmol/L抗霉素A，檢測(cè)細(xì)胞非線粒體呼吸水平。

2.4 黃芩素和漢黃芩素影響能量代謝的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

以糖酵解、線粒體能量代謝關(guān)鍵酶（表1）為研究對(duì)象，使用分子對(duì)接技術(shù)分析黃芩素和漢黃芩素影響能量代謝的可能作用靶點(diǎn)。從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（PDB，http：//www.pdb.org）下載三維晶體結(jié)構(gòu)[13]。將受體的晶體結(jié)構(gòu)坐標(biāo)加載到Discovery Studio 4 軟件，默認(rèn)格式為線性結(jié)構(gòu)模型，優(yōu)化處理后保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肅hemBioDrawUltra 12.0 軟件制備黃芩素和漢黃芩素的配體分子，并進(jìn)行能量最小化優(yōu)化[14]。采用Discovery Studio 4 軟件的CDOCKER模塊對(duì)黃芩素和漢黃芩素與8 種能量代謝關(guān)鍵酶的蛋白質(zhì)分子對(duì)接，使用Compute 模塊下的3D質(zhì)子化功能，可自動(dòng)優(yōu)化氫原子并對(duì)其質(zhì)子化[15-16]。按照上述方法將蛋白質(zhì)的能量進(jìn)行最小化優(yōu)化，選擇分子對(duì)接結(jié)果顯示最有利的結(jié)合模式和負(fù)CDOCKER相互作用的最高能量值。目標(biāo)蛋白（能量代謝關(guān)鍵酶）和不同化學(xué)成分結(jié)合力的強(qiáng)度通過能量值的大小來評(píng)估，以能量值的絕對(duì)值7 為劃分親和力強(qiáng)弱的界限，其絕對(duì)值越大，表示兩者間親和力越強(qiáng)，是藥物作用靶點(diǎn)的可能性越大[17]。

2.5 HepG2 細(xì)胞中能量代謝關(guān)鍵酶表達(dá)的檢測(cè)

采用Western blot 法檢測(cè)。將HepG2 細(xì)胞接種至6孔板中，每孔含0.5×106～1.0×106個(gè)細(xì)胞。根據(jù)“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行細(xì)胞分組、給藥，培養(yǎng)24 h，每組6 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，PBS 洗滌細(xì)胞2 次，裂解后采集細(xì)胞提取物。采用裂解緩沖液（由RIPA裂解液、PMSF 以100 ∶1比例組成）冰上采集細(xì)胞提取物，以12 000 r/min 于4 ℃離心5 min，取上清液，采用BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。將5×加樣緩沖液與標(biāo)本蛋白按1 ∶4 比例混勻，沸水浴10 min，以12 000 r/min 于4 ℃離心10 min，取上清液，根據(jù)檢測(cè)的蛋白濃度確定上樣量，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（10%分離膠）。上樣后先用40mA跑120 min，再以100 V轉(zhuǎn)膜100 min，然后用5%BSA封閉液在4 ℃環(huán)境下封閉2 h;加入內(nèi)參抗體β-actin 和各一抗（ATP5F1、NDUFS1、PK-Specific、CYB5R3、HK2、MTCO2、SDHA、PKM2，稀釋度均為1 ∶ 100），4 ℃孵育過夜;1×TBST 洗膜6 次，每次5 min，加入二抗（稀釋度1 ∶200），4 ℃孵育1 h;1×TBST洗膜6 次，每次5 min。利用暗室顯影技術(shù)采集化學(xué)發(fā)光圖像。用Image Lab 軟件進(jìn)行圖像分析，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以x±s 表示，多組間比較采用方差分析，多重比較采用Scheffe檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果與分析

3.1 黃芩素和漢黃芩素對(duì)HepG2 細(xì)胞活力的影響

MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在2.5～20 μmol/L 劑量范圍內(nèi)，黃芩素和漢黃芩素均能抑制HepG2 細(xì)胞增殖（P<0.05），且呈劑量依賴趨勢(shì)。進(jìn)一步計(jì)算IC50值，其中黃芩素的IC50值為12.84 μmol/L、漢黃芩素為24.09 μmol/L，提示黃芩素對(duì)HepG2 細(xì)胞活力的抑制作用較漢黃芩素更強(qiáng)。為排除細(xì)胞活力過低對(duì)能量代謝相關(guān)指標(biāo)的影響，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用對(duì)細(xì)胞活力無顯著影響的劑量開展研究，即黃芩素1.25 μmol/L 為黃芩素組劑量，漢黃芩素2.5 μmol/L為漢黃芩素組劑量。結(jié)果見圖1。

3.2 黃芩素和漢黃芩素對(duì)HepG2 細(xì)胞中ATP 濃度的影響

ATP檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組[（148.10±12.48）nmol/mg pro]比較，黃芩素組[（127.74±6.05）nmol/mgpro]、漢黃芩素組[（122.65±4.71）nmol/mg pro] HepG2細(xì)胞中ATP 濃度顯著降低（P<0.05），提示黃芩素和漢黃芩素均能明顯降低HepG2細(xì)胞中的ATP濃度。

3.3 黃芩素和漢黃芩素對(duì)HepG2 細(xì)胞糖酵解的影響

糖酵解壓力測(cè)試結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，黃芩素組、漢黃芩素組HepG2 細(xì)胞基礎(chǔ)酸化率均顯著降低（P<0.05），表明其能明顯降低細(xì)胞糖酵解水平;且給予寡霉素抑制ATP 合成酶的活性后，2 個(gè)給藥組細(xì)胞最大酸化率均較空白對(duì)照組顯著降低（P<0.01），提示黃芩素和漢黃芩素不僅能直接抑制糖酵解，還能抑制細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下能量代謝表型的轉(zhuǎn)變。進(jìn)一步比較黃芩素組、漢黃芩素組的結(jié)果顯示，漢黃芩素組細(xì)胞基礎(chǔ)酸化率較黃芩素組顯著降低（P<0.05），提示漢黃芩素對(duì)糖酵解的抑制作用較黃芩素更強(qiáng)。結(jié)果見圖2。

3.4 黃芩素和漢黃芩素影響糖酵解能量代謝關(guān)鍵酶的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

分子對(duì)接評(píng)估黃芩素和漢黃芩素與糖酵解能量代謝關(guān)鍵酶HK、PFK、PKM2 相互作用的結(jié)合能量值，結(jié)果顯示，黃芩素和漢黃芩素與PKM2 對(duì)接的最大能量值分別為-7.904、-7.626 kJ/mol，親和力較強(qiáng);黃芩素和漢黃芩素與HK、PFK 對(duì)接的最大能量值的絕對(duì)值均小于7，親和力較弱。

進(jìn)一步分析黃芩素和漢黃芩素與PKM2 的作用力發(fā)現(xiàn)，黃芩素與PKM2 的作用以氫鍵、范德華力為主，而漢黃芩素與PKM2 之間的作用力主要為范德華力。分析原因?yàn)椋狐S芩素有2 個(gè)芳香環(huán)、3 個(gè)相鄰羥基，在分子結(jié)構(gòu)上共軛程度強(qiáng)，電子傳遞能力強(qiáng)，易與糖酵解關(guān)鍵酶形成穩(wěn)定氫鍵，結(jié)合力更強(qiáng);而漢黃芩素只有2 個(gè)相鄰羥基，與糖酵解關(guān)鍵酶形成穩(wěn)定氫鍵的結(jié)合力較弱[18]。該結(jié)果部分解釋了黃芩素和漢黃芩素對(duì)糖酵解的抑制機(jī)制。

3.5 黃芩素和漢黃芩素對(duì)HepG2 細(xì)胞糖酵解能量代謝關(guān)鍵酶表達(dá)的影響

Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，漢黃芩素組HepG2 細(xì)胞中HK、PFK、PKM2 的蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05 或P<0.01），提示下調(diào)糖酵解關(guān)鍵酶表達(dá)是漢黃芩素抑制HepG2 細(xì)胞能量代謝的重要機(jī)制;黃芩素組糖酵解關(guān)鍵酶的蛋白表達(dá)水平雖有下降趨勢(shì)，但與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），綜合分子對(duì)接結(jié)果，提示黃芩素可能通過抑制PKM2 蛋白活性進(jìn)而抑制糖酵解。結(jié)果見圖3。

3.6 黃芩素和漢黃芩素對(duì)HepG2 細(xì)胞線粒體能量代謝的影響

線粒體壓力測(cè)試結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，黃芩素組、漢黃芩素組細(xì)胞的基礎(chǔ)耗氧率均顯著降低（P<0.05 或P<0.01），提示這2 種成分能干預(yù)線粒體呼吸鏈的氧化還原反應(yīng)，降低細(xì)胞的線粒體能量代謝水平。給予寡霉素后，黃芩素組、漢黃芩素組細(xì)胞耗氧率均明顯下降，但與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

給予FCCP后，細(xì)胞耗氧率顯著增加，迅速達(dá)到最大耗氧率;與空白對(duì)照組比較，黃芩素組、漢黃芩素組均能降低HepG2 細(xì)胞的最大耗氧率，其中黃芩素組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示黃芩素和漢黃芩素能不同程度地抑制線粒體能量代謝的呼吸儲(chǔ)備功能。結(jié)果見圖4。

黃芩素和漢黃芩素對(duì)HepG2 細(xì)胞線粒體能量代謝均有不同程度的影響，分析原因如下：（1）在肝癌細(xì)胞中，線粒體能量代謝被激活，氧化磷酸化作用異常強(qiáng)烈，導(dǎo)致藥物作用明顯[19];（2）氧化磷酸化的關(guān)鍵酶均集中在線粒體膜上，而細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量多（每個(gè)細(xì)胞約含1 000 個(gè)線粒體），導(dǎo)致藥物作用靶點(diǎn)較多且集中[20]。

3.7 黃芩素和漢黃芩素影響HepG2 細(xì)胞線粒體能量代謝關(guān)鍵酶的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

分子對(duì)接評(píng)估黃芩素和漢黃芩素與線粒體能量代謝關(guān)鍵酶CⅠ～Ⅴ相互作用的結(jié)合能量值，結(jié)果顯示，黃芩素具有最有利的構(gòu)象，易與CⅠ、CⅡ、CⅣ蛋白上的活性位點(diǎn)結(jié)合，其對(duì)接的最大能量值分別為-7.786、-7.030、-7.693 kJ/mol;而漢黃芩素可與CⅠ、CⅡ、CⅣ蛋白結(jié)合，但親和力較弱，其最大能量值的絕對(duì)值均小于7。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，黃芩素可與CⅠ（氫鍵、共價(jià)鍵）、CⅡ（氫鍵、共價(jià)鍵）、CⅣ（氫鍵、共價(jià)鍵）相互作用。分析原因?yàn)椋狐S芩素和漢黃芩素均有2 個(gè)芳香環(huán);黃芩素有3 個(gè)相鄰羥基，易與受體蛋白的氨基酸殘基形成穩(wěn)定的氫鍵，與線粒體能量代謝關(guān)鍵酶親和力強(qiáng)，易形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu);漢黃芩素有1 對(duì)間位羥基，且相鄰1 個(gè)甲氧基，具有較大的空間位阻，影響氫鍵的形成[21]，故與受體蛋白的親和力較弱。該結(jié)果部分解釋了黃芩素和漢黃芩素對(duì)線粒體能量代謝的抑制機(jī)制。

3.8 黃芩素和漢黃芩素對(duì)HepG2 細(xì)胞線粒體能量代謝關(guān)鍵酶表達(dá)的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，漢黃芩素組細(xì)胞中CⅠ、CⅡ、CⅣ的蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05 或P<0.01），而黃芩素組細(xì)胞中線粒體能量代謝關(guān)鍵酶的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示黃芩素主要與關(guān)鍵酶結(jié)合，通過影響關(guān)鍵酶的催化活性來調(diào)節(jié)HepG2細(xì)胞的能量代謝。結(jié)果見圖5。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，黃芩素和漢黃芩素均能降低HepG2細(xì)胞糖酵解和線粒體能量代謝水平，抑制細(xì)胞能量代謝。更重要的是，兩者均能降低HepG2 細(xì)胞線粒體能量代謝的儲(chǔ)備能力，抑制細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下糖酵解和線粒體能量代謝的轉(zhuǎn)化功能，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)惡劣環(huán)境的適應(yīng)能力減弱。

進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，黃芩素與PKM2、CⅠ、CⅡ、CⅣ蛋白的親和力強(qiáng)，但對(duì)其蛋白表達(dá)水平無顯著影響，推測(cè)這可能與黃芩素具有3 個(gè)相鄰羥基有關(guān)：一方面黃芩素容易與蛋白上的活性位點(diǎn)形成穩(wěn)定的氫鍵，表現(xiàn)出強(qiáng)親和力，結(jié)合力更高;另一方面黃芩素易失去氫質(zhì)子使區(qū)域內(nèi)電負(fù)性增強(qiáng)，而線粒體具有雙層膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)膜向內(nèi)折入形成嵴，內(nèi)膜外側(cè)帶正電，內(nèi)膜內(nèi)側(cè)帶負(fù)電，形成約-180 mV的膜電位[22-24]，且黃芩素易溶于脂溶性溶劑，故黃芩素可能更容易進(jìn)入線粒體，從而干預(yù)能量代謝關(guān)鍵酶的功能，抑制細(xì)胞能量代謝。漢黃芩素只與PKM2 蛋白的結(jié)合力較強(qiáng)，這可能與漢黃芩素除含有2個(gè)羥基外還引入了甲氧基有關(guān)，較大的空間位阻阻礙了較多氫鍵的形成，故與蛋白的親和力較弱[24]。Westernblot 結(jié)果提示，漢黃芩素可顯著下調(diào)HK、PFK、PKM2、CⅠ、CⅡ、CⅣ蛋白的表達(dá)，其抑制能量代謝的機(jī)制與下調(diào)能量代謝關(guān)鍵酶的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，黃芩素和漢黃芩素均能抑制肝癌細(xì)胞能量代謝，但作用機(jī)制不同：黃芩素的作用與影響關(guān)鍵酶活性有關(guān)，而漢黃芩素的作用與抑制能量代謝關(guān)鍵酶表達(dá)有關(guān)。