蘆薈大黃素通過EGF/EGFR/HER2信號通路對乳腺癌內分泌耐藥的作用

孫星，趙得堡，劉越，劉揚帆，盛晶，劉麗娜，屈中玉，萬里新，李剛

（1.南陽市中心醫(yī)院腫瘤內科，河南 南陽 473000；2.南陽市第二人民醫(yī)院腫瘤內科，河南 南陽 473009）

乳腺癌是世界范圍內常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)基因的臨床分型包括多種亞型，其中多數(shù)是雌激素受體陽性患者[1]。內分泌治療是激素依賴性乳腺癌的重要治療手段，他莫西芬（tamxifen,TAM）是一種雌激素受體的競爭性抑制劑，常用于乳腺癌內分泌治療，它可通過與雌激素競爭性結合雌激素受體，阻礙雌激素的生物學活性，對雌激素受體陽性乳腺癌患者具有療效，但癌細胞獲得耐藥性常導致治療效果欠佳，因此解決內分泌耐藥是治療乳腺癌的關鍵[2]。蘆薈大黃素是一種提取于蘆薈的蒽醌類化合物，具有抗腫瘤活性。研究發(fā)現(xiàn)，蘆薈大黃素能增強乳腺癌細胞對順鉑的敏感性，降低癌細胞增殖、遷移和侵襲能力[3]。此外，蘆薈大黃素通過誘導癌細胞凋亡，對宮頸癌Hela 細胞具有放射增敏作用[4]。表皮生長因子（epidermal growth factor,EGF）與其特異性受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）結合激活一系列信號轉導通路，對細胞增殖和分化起到重要作用。人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）在正常組織中表達較低，其與EGF 受體家族的成員結合及配體形成復合物后參與細胞增殖信號的轉導[5]。本研究以耐藥細胞MCF-7/TAM 為研究對象，探討蘆薈大黃素是否能通過EGF/EGFR/HER2 信號通路逆轉MCF-7/TAM耐藥性。

1 材料與方法

1.1 細胞系

人乳腺癌MCF-7細胞株購自美國ATCC公司。

1.2 試劑和儀器

蘆薈大黃素（質量分數(shù)≥80%）購自南京澤朗生物科技有限公司（批號：481-72-1）；TAM購自美國Sigma公司（批號：T5648-5G）；細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD 公司（批號：556507）；兔抗人HER2、EGF、p-EGFR、EGFR、B 淋巴細胞瘤-2 基因（B-cell lym‐phoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體購自美國Abcam公司（批號分別為ab134182、ab206106、ab97613、ab52894、ab32124、ab243140）；胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司（批號：16000-044、25200-056）；山羊抗兔二抗購自美國Abcam 公司（批號：ab97051）；SynergyHTX 多功能酶標儀購自美國Bio-Tek 公司；CytoFLEX 流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司。

1.3 建立TAM耐藥細胞株[6]（MCF-7/TAMR）

將MCF-7 細胞培養(yǎng)于含10%（φ）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期的MCF-7細胞制成單細胞懸液，接種于培養(yǎng)皿，更換為含1×10-6mol/L的TAM、5%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)21 d，收集細胞，將細胞在無TAM 的培養(yǎng)基中擴增7 d，之后將細胞培養(yǎng)在含1×10-7mol/L 的TAM 培養(yǎng)液中維持其耐藥性。

MCF-7 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素各200 u/mL的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%（φ）CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換1 次培養(yǎng)基，細胞融合度達到80%以上時，胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.4 MTT 法檢測MCF-7 和MCF-7/TAMR 細胞的增殖活性

離心收集MCF-7 和MCF-7/TAMR 細胞，制成單細胞懸液，以6×103個/孔的密度將細胞接種于96孔板，細胞貼壁生長后，分別用含0、0.1、1、10、20 和50 μmol/L 的TAM 的培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，之后每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，置于酶標儀上測定490 nm 波長處的吸光度（A）值，計算細胞增殖抑制率[細胞增殖抑制率=（1-實驗組A 值/對照組A 值）×100%]，求出半數(shù)抑制濃度（IC50），計算耐藥指數(shù)（RI）（RI=耐藥細胞IC50/誘導前細胞IC50）。實驗重復3次。

1.5 細胞分組與培養(yǎng)

將MCF-7/TAMR 細胞用濃度為0、10、20、40 和60 mol/L 蘆薈大黃素處理細胞24 h，選擇細胞毒性較小的40 mol/L蘆薈大黃素進行后續(xù)實驗。對數(shù)生長期MCF-7/TAMR細胞分為對照組和EGF組，對照組細胞不做處理，EGF 組細胞用10 nmol/L EGF 處理24 h，蘆薈大黃素組細胞用40 mol/L 蘆薈大黃素處理24 h，蘆薈大黃素+EGF 組細胞先加入10 nmol/L EGF 處理24 h 后再加入40 mol/L 蘆薈大黃素處理24 h。

1.6 MTT法檢測細胞存活率

根據(jù)實驗方法“1.3”測定各組細胞吸光度（A）值，計算細胞存活率（細胞存活率=實驗組A值/對照組A值×100%）。

1.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡率

預冷PBS 清洗細胞2 次，胰蛋白酶消化，PBS 將細胞重懸，離心后加入Binding buffer 500 μL將細胞重懸，分別加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，振蕩混勻，避光孵育10 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.8 蛋白印跡法檢測各蛋白表達情況

預冷PBS清洗細胞2次，裂解液裂解，離心取上清液，BCA 法檢測蛋白濃度，煮沸變性。電泳2 h，濕轉2 h，TBST 洗膜3 次，室溫封閉1 h，Bax、Bcl-2、Ki67、EGF、p-EGFR、EGFR、HER2 和GAPDH 抗體（1∶1000）4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次，二抗（1∶5000）室溫孵育2 h，TBST 洗膜3 次，ECL 法顯色，Image J 分析灰度值。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS21.0 統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料均以表示，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩樣本比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MCF-7/TAMR耐藥細胞株建立

給予MCF-7 和MCF-7/TAMR 細胞不同濃度TAM 處理后，細胞增殖抑制率隨TAM 濃度的升高而上升，等濃度TAM 下MCF-7 細胞增殖抑制率明顯高于MCF-7/TAMR 細胞。MCF-7/TAMR 細胞的IC50為（36.29±2.04）μmol/L，高于MCF-7 細胞的IC50（11.37±1.74）μmol/L，MCF-7/TAMR 的耐藥指數(shù)為（3.76±0.27）。提示成功建立MCF-7/TAMR 細胞株。見表1。

表1 MCF-7細胞和MCF-7/TAMR細胞增殖抑制率比較Table 1 Comparison of the proliferation inhibition rates between MCF-7 cells and MCF-7/TAMR cells(±s,n=3)

表1 MCF-7細胞和MCF-7/TAMR細胞增殖抑制率比較Table 1 Comparison of the proliferation inhibition rates between MCF-7 cells and MCF-7/TAMR cells(±s,n=3)

與0.1 μmol/L組比較：*P<0.05；與1 μmol/L組比較：#P<0.05；與10 μmol/L組比較：@P<0.05；與20 μmol/L組比較：&P<0.05。

細胞類型MCF-7細胞MCF-7/TAMR細胞c(TAM)/(μmol/L-1)0--0.115.52±0.993.28±0.88139.42±1.02*9.12±0.52*1048.21±0.69#17.92±0.34#2064.10±0.88@28.64±1.20@5082.95±0.61&36.28±0.76&

2.2 不同濃度蘆薈大黃素對MCF-7/TAMR 細胞增殖活性的影響

MCF-7/TAMR 細胞存活率和Ki67 蛋白相對表達量隨蘆薈大黃素濃度的升高而降低，且具有濃度依賴性。提示蘆薈大黃素能抑制MCF-7/TAMR 細胞增殖活性。見表2，圖1。

圖1 蛋白印跡法檢測不同濃度蘆薈大黃素對Ki67 蛋白表達的影響Figure 1 Effects of aloe emodin on Ki67 protein expression detected by Western blot

表2 不同濃度蘆薈大黃素對細胞存活率和Ki67表達的影響Table 2 Effects of different concentrations of aloe emodin on the cell viability and Ki67 expression(±s,n=3)

表2 不同濃度蘆薈大黃素對細胞存活率和Ki67表達的影響Table 2 Effects of different concentrations of aloe emodin on the cell viability and Ki67 expression(±s,n=3)

與0 mol/L 比較：*P<0.05；與10 mol/L 比較：#P<0.05；與20 mol/L 比較：@P<0.05；與40 mol/L比較：&P<0.05。

c（蘆薈大黃素)/(mol·L-1）010204060細胞存活率/%10092.13±1.13*82.71±1.98*#70.26±1.27*#@61.50±0.75*#@&Ki671.08±0.030.99±0.02*0.75±0.02*#0.48±0.02*#@0.10±0.02*#@&

2.3 EGF對MCF-7/TAMR耐藥細胞株的影響

2.3.1 EGF 對MCF-7/TAMR 細胞增殖的影響 EGF組細胞存活率和Ki67 蛋白相對表達量與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。EGF 組EGF 蛋白相對表達量高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3，圖2。

圖2 蛋白印跡法檢測Ki67和EGF蛋白表達情況Figure 2 Expression of Ki67 and EGF protein detected by Western blot

表3 EGF對細胞存活率、Ki67和EGF表達的影響Table 3 Effects of EGF on the cell viability, Ki67 and EGF expression(±s,n=3)

表3 EGF對細胞存活率、Ki67和EGF表達的影響Table 3 Effects of EGF on the cell viability, Ki67 and EGF expression(±s,n=3)

與對照組比較：*P<0.05。

組別對照組EGF組細胞存活率/%100.0097.96±1.15 Ki670.88±0.050.82±0.03 EGF 0.35±0.020.72±0.03*

2.3.2 EGF 對MCF-7/TAMR 細胞凋亡的影響 EGF組細胞凋亡率和Bax 蛋白相對表達量低于對照組，EGF 和Bcl-2 蛋白相對表達量高于對照組（P<0.05），提示EGF 能抑制MCF-7/TAMR 細胞凋亡。見表4，圖3。

圖3 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況以及蛋白印跡法檢測細胞凋亡相關蛋白和EGFFigure 3 Detection of cell apoptosis by flow cytometry and apoptosis related proteins and EGF by Western blot

表4 EGF對細胞凋亡率及凋亡相關蛋白和EGF表達的影響Table 4 Effects of EGF on the apoptosis rate and expressionof apoptosis-related proteins and EGF(±s,n=3)

表4 EGF對細胞凋亡率及凋亡相關蛋白和EGF表達的影響Table 4 Effects of EGF on the apoptosis rate and expressionof apoptosis-related proteins and EGF(±s,n=3)

與對照組比較：*P<0.05。

組別對照組EGF組細胞凋亡率/%5.63±0.491.57±0.24*Bax 0.72±0.050.36±0.06*Bcl-20.15±0.040.70±0.04*EGF 0.10±0.030.90±0.04*

2.3.3 EGF對MCF-7/TAMR細胞中蛋白的影響 EGF組p-EGFR、HER2和EGF 蛋白相對表達量高于對照組（P<0.05），而總EGFR 蛋白相對表達量兩組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表5，圖4。

圖4 蛋白印跡法檢測細胞中p-EGFR、EGFR、HER2 和EGF蛋白表達情況Figure 4 Expression of p-EGFR,EGFR,HER2 and EGF pro‐teins measured by Western blot

表5 EGF對p-EGFR和HER2蛋白相對表達量的影響Table 5 Effects of EGF on relative expression levels of p-EGFR and HER2 proteins(±s,n=3)

表5 EGF對p-EGFR和HER2蛋白相對表達量的影響Table 5 Effects of EGF on relative expression levels of p-EGFR and HER2 proteins(±s,n=3)

與對照組比較：*P<0.05。

組別對照組EGF組p-EGFR 0.38±0.030.59±0.03*EGFR 0.89±0.040.87±0.05 HER20.48±0.040.64±0.04*EGF 0.24±0.060.50±0.05*

2.4 EGF 逆轉蘆薈大黃素對MCF-7/TAMR 耐藥細胞株的影響

2.4.1 EGF逆轉蘆薈大黃素對MCF-7/TAMR細胞增殖活性的影響 細胞存活率、Ki67 和EGF 蛋白相對表達量組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與對照組比較，蘆薈大黃素組細胞存活率、Ki67和EGF蛋白相對表達量降低（P<0.05）；與蘆薈大黃素組比較，蘆薈大黃素+EGF組細胞存活率、Ki67和EGF蛋白相對表達量升高（P<0.05）。提示EGF可降低蘆薈大黃素對細胞增殖活性的抑制作用。見表6，圖5。

表6 各組細胞存活率、Ki67和EGF蛋白表達比較Table 6 Comparison of the cell survival rate, Ki67 and EGF protein expression in each group（±s,n=3）

表6 各組細胞存活率、Ki67和EGF蛋白表達比較Table 6 Comparison of the cell survival rate, Ki67 and EGF protein expression in each group（±s,n=3）

與對照組比較：*P<0.05；與蘆薈大黃素組比較：#P<0.05。

組別對照組蘆薈大黃素組蘆薈大黃素+EGF組細胞存活率/%100.0073.51±3.73*87.52±2.46*#Ki670.87±0.030.18±0.02*0.37±0.04*#EGF 0.77±0.030.10±0.04*0.23±0.02*#

圖5 蛋白印跡法檢測Ki67和EGF蛋白表達Figure 5 Expression of Ki67 and EGF protein measured by Western blot

2.4.2 EGF 逆轉蘆薈大黃素對MCF-7/TAMR 細胞凋亡的影響 細胞凋亡率以及EGF、Bax 和Bcl-2 蛋白相對表達量組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與對照組比較，蘆薈大黃素組細胞凋亡率和Bax 蛋白相對表達量升高，EGF 和Bcl-2 蛋白相對表達量降低（P<0.05）；與蘆薈大黃素組比較，蘆薈大黃素+EGF 組細胞凋亡率和Bax 蛋白相對表達量降低，EGF 和Bcl-2 蛋白相對表達量升高（P<0.05）。提示EGF 可降低蘆薈大黃素對細胞凋亡的促進作用。見表7，圖6。

圖6 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況及蛋白印跡法檢測細胞中Bax、Bcl-2和EGF蛋白表達水平Figure 6 Detection of cell apoptosis by flow cytometry and the expression of Bax,Bcl-2 and EGF proteins by Western blot

表7 各組細胞凋亡率、Bax、Bcl-2和EGF蛋白相對表達量比較Table 7 Comparison of the cell apoptosis rate and relative expres‐sion of Bax,Bcl-2 and EGF proteins in each group（±s,n=3）

表7 各組細胞凋亡率、Bax、Bcl-2和EGF蛋白相對表達量比較Table 7 Comparison of the cell apoptosis rate and relative expres‐sion of Bax,Bcl-2 and EGF proteins in each group（±s,n=3）

與對照組比較：*P<0.05；與蘆薈大黃素組比較：#P<0.05。

組別對照組蘆薈大黃素組蘆薈大黃素+EGF組細胞凋亡率/%1.36±0.2513.46±0.46*6.94±0.45*#Bax 0.88±0.051.13±0.02*1.01±0.03*#Bcl-21.04±0.020.40±0.04*0.53±0.04*#EGF 1.12±0.030.12±0.03*0.43±0.04*#

2.4.3 EGF 逆轉蘆薈大黃素對EGF/EGFR/HER2 信號通路的影響 EGF、p-EGFR 和HER2 蛋白相對表達量組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與對照組比較，蘆薈大黃素組EGF、p-EGFR 和HER2 蛋白相對表達量降低（P<0.05）；與蘆薈大黃素組比較，蘆薈大黃素+EGF組EGF、p-EGFR和HER2蛋白相對表達量升高（P<0.05）。EGFR 蛋白相對表達量組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。提示EGF可降低蘆薈大黃素對EGF/EGFR/HER2 信號通路的抑制作用。見表8，圖7。

表8 各組p-EGFR、EGFR、EGF和HER2蛋白相對表達量比較Table 8 Comparison of the relative expression of p-EGFR,EGFR,EGF and HER2 proteins in each group（±s,n=3）

表8 各組p-EGFR、EGFR、EGF和HER2蛋白相對表達量比較Table 8 Comparison of the relative expression of p-EGFR,EGFR,EGF and HER2 proteins in each group（±s,n=3）

與對照組比較：*P<0.05；與蘆薈大黃素組比較：#P<0.05。

組別對照組蘆薈大黃素組蘆薈大黃素+EGF組p-EGFR 0.97±0.040.31±0.03*0.73±0.02*#EGFR 0.99±0.031.01±0.020.98±0.03 HER20.99±0.040.37±0.03*0.82±0.05*#EGF 0.87±0.030.35±0.02*0.64±0.03*#

圖7 各組細胞中各蛋白表達情況Figure 7 Protein expression in cells of each group

3 討論

內分泌治療因其低毒性以及耐受性好等特點，能顯著改善激素受體陽性乳腺癌患者預后，但是長期治療部分患者易出現(xiàn)耐藥性，導致患者生存率降低，因此尋找癌細胞產生耐藥性的具體機制對于提高乳腺癌患者生存率至關重要。本課題組前期預實驗發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素對乳腺癌MCF-7 細胞具有抑制作用，但是對其耐藥性的影響未進行探討，因此本研究主要探討蘆薈大黃素是否能逆轉乳腺癌細胞的耐藥性及其具體機制。

近些年，蘆薈大黃素在抗腫瘤方面的作用受到廣泛關注，研究發(fā)現(xiàn)，蘆薈大黃素可誘導胃癌細胞凋亡，降低癌細胞增殖能力[7]。董錦忠等[8]研究發(fā)現(xiàn)，蘆薈大黃素可抑制肺癌A549 細胞增殖、遷移和侵襲。杜學峰等[9]研究表明蘆薈大黃素通過抑制肝癌細胞增殖，誘導癌細胞發(fā)生自噬和凋亡，從而發(fā)揮抗肝癌作用。為研究蘆薈大黃素對MCF-7 耐藥性的影響，本研究首先建立MCF-7/TAM 耐藥細胞株，通過檢測MCF-7/TAM 細胞的增殖抑制率和耐藥指數(shù)，確定成功誘導出MCF-7/TAM 耐藥細胞。給予MCF-7/TAM 細胞不同濃度蘆薈大黃素處理，結果顯示：隨著蘆薈大黃素濃度的升高，細胞存活率逐漸降低，且具有濃度依賴性，而且Ki67 蛋白表達量隨蘆薈大黃素濃度的升高逐漸降低。結果表明，蘆薈大黃素可降低MCF-7/TAM細胞增殖活性。

腫瘤細胞通過自分泌可產生大量生長因子，其中EGF 是促進上皮增生的重要因子，通過與其受體EGFR 結合，活化EGFR，激活細胞內一系列信號轉導通路，從而促進腫瘤細胞增殖、浸潤和侵襲。研究發(fā)現(xiàn)，EGF 通過激活EGFR/ROS 信號通路可增強人膠質母細胞瘤多形性細胞的侵襲潛能[10]。Zhang等[11]研究發(fā)現(xiàn)EGF 可誘導肝癌HepG2 細胞發(fā)生上皮間質轉化，而丹參酮降低EGF 表達可逆轉上皮間質轉化過程。Zhao 等[12]研究表明EGF 通過活化STAT3 誘導HIF-1 表達上調，從而促進結直腸癌SW480 細胞增殖和轉移。本研究用10 nmol/L EGF處理細胞，對MCF-7/TAM 細胞存活率和Ki67 蛋白表達量無顯著影響，而顯著降低細胞凋亡率和促凋亡蛋白Bax的表達量，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達量升高。結果表明，EGF 可促進MCF-7/TAM 細胞增殖，抑制其凋亡。為進一步研究蘆薈大黃素是否是通過調節(jié)EGF發(fā)揮抗癌作用，本研究先用10 nmol/L EGF 處理細胞后，再用蘆薈大黃素處理細胞，結果顯示，與蘆薈大黃素組比較，蘆薈大黃素+EGF 組細胞存活率和Ki67蛋白表達量升高，而細胞凋亡率和Bax 蛋白表達降低，Bcl-2 蛋白表達升高。結果表明，EGF 可降低蘆薈大黃素對MCF-7/TAM 細胞的促凋亡作用。

表皮生長因子系統(tǒng)（EGFs）由EGF 和EGFR 組成，EGFR 家族是跨膜受體酪氨酸激酶的一種，包括EGFR、HER2、HER3 和HER44 個成員，該家族通過調控多種與細胞生長相關的基因從而調節(jié)細胞周期影響細胞增殖、遷移和分化。EGFR 存在于所有細胞表面，對多條信號轉導通路具有調控作用。Dong 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，EGFR 在宮頸癌細胞中表達升高，circMYBL2 通過上調EGFR 可增強宮頸癌細胞對紫杉醇的耐藥性，降低其敏感性，促進癌細胞的惡性生物行為學。沉默非小細胞肺癌中CD44的表達可使EGFR 信號失活，從而降低癌細胞的增殖活性，增強癌細胞對順鉑的敏感性[14]。HER2 上調可促進胃癌細胞增殖、遷移和侵襲，抑制細胞凋亡[15]。PROM2 通過激活HER2 促進乳腺癌細胞遷移、侵襲和增殖[16]。本研究結果顯示，與對照組比較，EGF處理細胞后，p-EGFR 和HER2表達上調，蘆薈大黃素處理細胞可降低p-EGFR和HER2表達；而與蘆薈大黃素組比較，蘆薈大黃素+EGF 組p-EGFR和HER2 表達升高，結果提示蘆薈大黃素可抑制EGF/EGFR/HER2 信號通路，降低乳腺癌內分泌耐藥性。

綜上所述，蘆薈大黃素可降低乳腺癌內分泌耐藥性，其可能是通過抑制EGF/EGFR/HER2信號通路發(fā)揮作用，此機制為臨床治療乳腺癌提供了理論依據(jù)。