周建松 簡潔 蔣家俊 劉小華 李婉宜
(1.貴陽市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科,貴州 貴陽 550000;2.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系,四川 成都 610000)
沙門氏菌是一種常見的革蘭陰性桿菌致病菌,截止至2007 年,全球已發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)超過2579 種沙門氏菌血清型[1]。根據(jù)致病沙門氏菌種類的不同,可引起傷寒、敗血癥和腸胃炎的不同癥狀[2]。據(jù)報道,全球每年由沙門氏菌引起的感染人數(shù)約9380 萬,感染者死亡的數(shù)量更是達(dá)到了15.5 萬,美國CDC2013 年的調(diào)查顯示,在引起食物中毒的致病菌中,沙門氏菌的數(shù)量占據(jù)首位[2-3]。在中國,食品安全的問題也很嚴(yán)峻,據(jù)資料顯示,細(xì)菌性食物中毒中約有70%~80%由沙門氏菌引起[4]。廣州、浙江、貴州多地均報道過由沙門氏菌引起的食物中毒事件[5-7]。
病原菌分型是疾病監(jiān)測及流行病學(xué)研究的基礎(chǔ),也是食物中毒事件污染源溯源的重要手段,目前對于沙門氏菌的分型主要分為血清分型和分子分型[8]。傳統(tǒng)血清分型具有操作難度低,高效快速等優(yōu)點(diǎn),但目前已知沙門氏菌血清型種類多達(dá)2500種以上,且存在不典型沙門氏菌與較多干擾菌,因此,單純的血清分型已不能滿足食源性疾病的診斷及對致病菌溯源。脈沖場凝膠電泳(Pulsed field gel electrophoresis,PFGE)技術(shù)是利用DNA 分子處于電場作用下,在凝膠中遷移率不同而達(dá)到分離DNA分子的目的,進(jìn)而通過比較條帶相似性確定其親緣關(guān)系,其具有可重復(fù)性好,分辨力高的特點(diǎn),是目前分子分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”,現(xiàn)已被廣泛用于多種病原體爆發(fā)流行的溯源分析中[9]。
發(fā)生食源性事故時,應(yīng)盡快結(jié)合血清與PFGE分型技術(shù)對沙門菌進(jìn)行型別鑒定,確定并追蹤其來源,避免事件進(jìn)一步惡化[10]。本研究擬通過對貴陽市2015 年至2020 年33 株食源性沙門氏菌進(jìn)行血清分型和PFGE 分子分型,評價不同血清型別的沙門氏菌親緣性,并為貴陽市沙門氏菌感染的防控提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)參考。
1.1.1 菌株來源
33 株沙門菌分離自貴陽市2015 年至2020 年的病例監(jiān)測、食物中毒和食品監(jiān)測。PFGE 標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812 來自貴州省疾病預(yù)防控制中心。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材
緩沖蛋白胨水、營養(yǎng)瓊脂等(北京路橋),沙門氏菌顯色培養(yǎng)基(法國科瑪嘉),SKG 瓊脂糖精(美國LONZA),1M Tris-HCL 緩沖液、0.5M EDTA、5×TBE(北京Solarbio),限制性內(nèi)切酶Xba1、10×Buff 緩沖液(美國BioLabs),蛋白酶K(德國Merck),PFGE 用梳子、模具(美國Bio-Rad),Gelred染液(美國Biotium),恒溫恒濕培養(yǎng)箱、水浴恒溫振蕩器(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司),脈沖凝膠電泳儀、成像儀(美國Bio-Rad)。
1.2.1 菌株復(fù)核鑒定
參照《GB 4789.4-2016 沙門氏菌檢驗(yàn)》進(jìn)行。將貴陽市疾控中心保存的目標(biāo)菌株的磁珠接種于緩沖蛋白胨水(Buffered peptone water,BPW),36℃培養(yǎng)16 h 后接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基中,繼續(xù)36℃培養(yǎng)18 h,通過其產(chǎn)生的顏色進(jìn)行初步篩選,挑取紫紅色可疑單獨(dú)菌落接種于三糖鐵瓊脂進(jìn)行二次判斷。
若生長結(jié)果有異,可接種營養(yǎng)瓊脂(Nutrient agar,NA)36℃培養(yǎng)18 h 后,挑取單個菌落配置菌懸液進(jìn)行Vitek-2 生化鑒定。
1.2.2 血清型分型
將目標(biāo)菌株接種于NA,36℃培養(yǎng)19 h,取一個干凈無劃痕的培養(yǎng)皿,將診斷血清滴一滴于其上并挑取單個菌落與之混勻,在燈光下觀察其是否凝集。
凝集順序?yàn)椋合饶齇 血清,根據(jù)其凝集的O 血清的不同,參照對比表選擇H 血清,進(jìn)而確定其血清型。
1.2.3 PFGE 分子分型
該實(shí)驗(yàn)步驟以標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812 為對照。挑取目標(biāo)菌株單個菌落接種于NA 36℃培養(yǎng)18 h。稱取適量Seakem Glod(SKG)瓊脂糖,配置適量1% SKG瓊脂糖,熔化后放入55℃的恒溫箱備用。使用細(xì)胞懸浮液(Cell Suspension Buffer,CSB)制備麥?zhǔn)媳葷釢舛葹? 的菌懸液,取400 μL 菌懸液加入無菌1.5 mL 離心管中,加入25 μL 蛋白酶K,使用制膠模具制成膠塊。在50 mL 離心管中加入5 mL 細(xì)胞裂解液(Cell lysis buffer,CLB)與25 μL 蛋白酶K,放入膠塊后置于55℃轉(zhuǎn)速150 rpm 的震蕩水浴鍋裂解2 h。裂解結(jié)束后倒出液體,
使用超純水及TE 緩沖液(Tris :EDTA buffer,TE)進(jìn)行清洗。清洗完成后,加入常溫10 mLTE 放入4℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用XbaⅠ 酶37℃酶切2.5 h,電泳19 h 后,用GelRed 染色,于凝膠成像儀觀察結(jié)果。
所有數(shù)據(jù)通過Excel軟件和SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。運(yùn)用 BioNumerisc 7.6 軟件進(jìn)行處理和聚類分析,相似度系數(shù)設(shè)置為Dice,容許度設(shè)置1.5%,采用非加權(quán)平均法(Unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGM)行聚類分析并且繪制聚類圖。
在33 株食源性沙門氏菌中,鼠傷寒沙門氏菌有15 株,占比46%,德爾卑沙門氏菌有7 株,占比21%,嬰兒沙門氏菌有5 株,占比15%,腸炎沙門氏菌4 株,占比12%,肯塔基沙門氏菌2 株,占比6%。
本次實(shí)驗(yàn)菌株數(shù)量占比最高的為鼠傷寒沙門氏菌(15 株)與德爾卑沙門氏菌(7 株),屬于本次實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢菌株。
2.2.1 食源性沙門氏菌PFGE 分子分型結(jié)果
33 株食源性沙門氏菌經(jīng)過PFGE 分子分型,僅有29 株條帶可經(jīng)BioNumerics 軟件進(jìn)行分析,剩余菌株共得出24 種條帶類型,對其用P1-P24 編號。
通過聚類分析菌株總相似度為56.4%,其中完全相同的有4 組,分別是P5 條帶(11、12,血清型均為嬰兒沙門氏菌)、P15 條帶(8、9、10,血清型均為鼠傷寒沙門氏菌)、P20 條帶(1、4,血清型均為德爾卑沙門氏菌)以及P24 條帶(13、16,血清型均為腸炎沙門氏菌),如圖1 所示。
圖1 29 株沙門氏菌聚類分析
優(yōu)勢帶型P15 包含3 株菌,P5、P20 以及P24均包含2 株菌,其余20 種帶型各包含1 株菌(若相似度高達(dá)100%,則視為同一PFGE 型,即PFGE圖譜完全一致,同一帶型在圖譜中呈現(xiàn)相對較多的菌株帶型稱為優(yōu)勢帶型)。在相似度100%的條帶中,P5 帶型的11 與12 號均為2017 年檢出,且血清型結(jié)果均為嬰兒沙門氏菌,推測其來源為同一株菌,同理P15 帶型,P20 帶型也均來源于同一株菌。P24帶型的腸炎沙門氏菌,一株于2015 年(16)檢出,一株于2016 年(13)檢出。推測造成2015 年食源性事故的污染源并未完全清除,傳播途徑未切斷,導(dǎo)致其在2016 年再次造成危害。
2.2.2 優(yōu)勢血清型鼠傷寒沙門氏菌PFGE 聚類結(jié)果分析
15 株鼠傷寒沙門氏菌分型分為10 種帶型(其中3 株菌所出條帶顏色對比暗淡,難以上機(jī)分析,原因可能是此次使用的Xba 1 酶不適用或者是所用蛋白酶K 存放時間過長,效能減退),其中優(yōu)勢帶型P15 占25%(3/12),剩余9 種帶型占75%(9/12)。
2.2.3 優(yōu)勢血清型德爾卑沙門氏菌PFGE 聚類結(jié)果分析
7 株德爾卑沙門氏菌分型為5 種帶型(其中1株菌所出條帶顏色暗淡,難以上機(jī)分析,原因可能與無法分析的3 株鼠傷寒沙門氏菌一致),其中優(yōu)勢帶型P20占33.3%(2/6),其余帶型占66.7%(4/6)。
本次實(shí)驗(yàn)鼠傷寒沙門氏菌與德爾卑沙門氏菌為優(yōu)勢菌株,與江西優(yōu)勢菌株為鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、德爾卑沙門氏菌的結(jié)論基本相同[11],與聊城市的結(jié)果存在一定差別[12],表明不同來源的菌株血清型別存在一定差異。
通過PFGE 技術(shù)對2015 年至2020 年貴陽市29株食源性沙門氏菌進(jìn)行分子分型,所獲條帶經(jīng)BioNumerics 軟件進(jìn)行處理,根據(jù)條帶數(shù)量以及位置的不同將29 株沙門氏菌分出24 種帶型。聚類顯示條帶總相似度為56.4%~100%,結(jié)果呈現(xiàn)多態(tài)性。優(yōu)勢血清型存在明顯優(yōu)勢帶型,12 株鼠傷寒沙門氏菌有10 種帶型,優(yōu)勢帶型為P15 型;6 株德爾卑沙門氏菌有5 種帶型,優(yōu)勢帶型為P20。相同帶型中,腸炎沙門氏菌(13,16)分別為2015 年與2016 年檢出,提示貴陽市可能存在對部分沙門氏菌傳播源清除不徹底,傳播途徑并未完全切斷的問題,應(yīng)加強(qiáng)對所有已發(fā)生沙門氏菌傳播源進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控,做好防控措施。
此外,因沙門氏菌引起的感染多以散發(fā)形式報告的,甚至很多情況下未對該致病菌進(jìn)行檢測,但通過本研究發(fā)現(xiàn)部分散發(fā)病例有一定的聚集傾向,因此及時做好食物中毒患者、醫(yī)院腹瀉患者和食品監(jiān)測中的病原菌分離鑒定工作并及時開展 PFGE分型有利于及時監(jiān)測發(fā)現(xiàn)并控制潛在食源性疾病暴發(fā)。