肉桂-丁香-百里香精油微膠囊的制備及表征

符麗雪, 陳明明, 章采東, 李殿威, 錢麗麗,2,3, 左 鋒,2

(黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院1，大慶 163319 )(國家雜糧工程技術(shù)研究中心2，大慶 163319)(黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點實驗室3，大慶 163319)

稻谷含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，是天然的微生物培養(yǎng)基質(zhì)。稻谷中常見的微生物類群為細菌、放線菌、酵母菌、霉菌等。其中，種類最為繁多、危害最為嚴重的菌系為霉菌。有研究顯示，從糧食中分離出的霉菌有200多種，其中曲霉屬占13%左右，青霉屬占33%左右，毛霉屬占15%左右。在侵染稻谷的過程中，黃曲霉[1,2]等霉菌分泌的強活性的酶系能夠分解稻谷中的有機物，引起稻谷的品質(zhì)劣變，甚至會產(chǎn)生強烈致癌的真菌毒素，危害人類健康。精油作為植物產(chǎn)生的天然抗菌劑，對多種病原微生物具有良好的抑制效果，在食品工業(yè)和農(nóng)業(yè)中防控病原微生物危害具有很大的潛力[3]。

肉桂精油、丁香精油和百里香精油具有優(yōu)異的抗菌性能，例如肉桂精油中的反式肉桂醛，具有強大的抗菌性能，甚至可以與醫(yī)院使用的殺菌消毒劑相提并論[4-6]。丁香精油作為一種用途廣泛的抗菌藥物成分，能夠顯著地抑制細菌、真菌的生長繁殖，不同種類丁香具有不同的抑菌能力，丁香與其他藥物組合具有一定的協(xié)同效應[7]。百里香精油中的主要成分是香芹酚和百里香酚，對大腸桿菌、炭疽菌等具有較強的抑菌作用[8]，但具有易降解、高揮發(fā)性和低殘留等特點[9]，直接使用時揮發(fā)較快，殺菌效果不持久，極大地限制了其應用。解決這些問題的措施之一就是微膠囊技術(shù)。微膠囊技術(shù)可以將液態(tài)的植物精油固態(tài)化，既能降低環(huán)境因素對芯材的影響，增強其穩(wěn)定性，還能延緩芯材釋放，延長植物精油作用時間，起到持續(xù)殺菌的效果[10,11]。這為微膠囊化的植物精油在抑制稻谷儲藏運輸中霉變的應用，提供了技術(shù)可行性。

本實驗研究肉桂-丁香-百里香精油微膠囊的制備及其性質(zhì)表征，評價了肉桂-丁香-百里香精油微膠囊對稻谷中霉菌的抑菌效果，并確定了復合精油微膠囊的最佳制作工藝，為天然精油微膠囊在儲藏運輸過程中抑制稻谷霉變的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉桂精油、百里香精油、丁香精油、明膠、阿拉伯膠、吐溫-80、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶、氯化鎂、硝酸鎂、硝酸鈉、硝酸鉀。

1.2 儀器與設(shè)備

JRJ300-SH高速均質(zhì)機，JJ-1攪拌機，DM750光學顯微鏡，HH-6水浴鍋，DY-80-880L恒溫恒濕箱實驗箱。

1.3 精油微膠囊芯材的配制

肉桂精油、百里香精油和丁香精油具有較好的抑菌效果，且存在一定的協(xié)同抑菌作用，是配制混合抑菌精油的良好原材料[13-15]。為了探究精油微膠囊的最佳抑菌效果，通過單因素法和響應優(yōu)化分析，采用混料設(shè)計配制的混合精油(肉桂精油、丁香精油和百里香精油)為55.2%、26.9%和17.9%的比例進行微膠囊的制備，從而獲得本實驗的研究結(jié)果。

1.4 復凝聚法制備精油微膠囊壁材

結(jié)合岳淑麗等[16]和于紅紅等[17]采用飽和水溶液法分別制備桉葉精油微膠囊和百里香精油微膠囊及常大偉等[18]采用復合凝聚結(jié)合冷凍干燥制備紫蘇油微膠囊的研究。稱取一定質(zhì)量的明膠和阿拉伯膠，熱水溶解后混合，加入精油，均質(zhì)機混合乳化60 s，緩慢地滴加10%的醋酸溶液調(diào)節(jié)pH，再加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(加入量為明膠用量的1/4)，固化攪拌6 h，得到微膠囊分散液。濾紙過濾，洗滌多次，直至無明顯異味，得到濕囊。濕囊經(jīng)凍干即成為精油微膠囊產(chǎn)品。

1.5 精油微膠囊制備工藝參數(shù)

復凝聚體系pH對微膠囊成囊有著至關(guān)重要的作用。因此，首先確定復凝聚體系pH后，之后分別討論芯壁比、壁材濃度、壁材比和攪拌速度對精油微膠囊成囊形態(tài)的影響。

1.5.1 空白微膠囊復凝聚pH的確定

設(shè)定壁材質(zhì)量比為1∶1(明膠∶阿拉伯膠)，壁材質(zhì)量濃度為1%，緩慢地滴加10%的醋酸溶液調(diào)節(jié)pH分別為3.2、3.4、3.6、3.8、4.0，結(jié)合謝潔紅[19]以殼聚糖和阿拉伯膠為壁材制備姜黃素納米粒的研究，測定微膠囊復凝聚體系濁度。靜置后，分離平衡相和凝聚相，壁材利用度的計算公式為：

(1)

1.5.2 壁材比對微膠囊濕囊形態(tài)的影響

設(shè)定壁材比為2∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶2(明膠∶阿拉伯膠)，壁材質(zhì)量濃度為1%，芯壁比為1∶2，攪拌速度為300 r/min，緩慢地滴加10%的醋酸溶液調(diào)節(jié)pH為3.6，再加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(加入量為明膠用量的1/4)，固化攪拌6 h，得到微膠囊分散液。取1滴微膠囊分散液至顯微鏡下觀察。

1.5.3 壁材濃度對微膠囊濕囊形態(tài)的影響

設(shè)定壁材比為2∶3(明膠∶阿拉伯膠)，壁材質(zhì)量濃度為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，芯壁比為1∶2，攪拌速度為300 r/min，緩慢地滴加10%的醋酸溶液調(diào)節(jié)pH分別為3.6，同樣的操作按1.5.2方法進行實驗。

1.5.4 芯壁比對微膠囊濕囊形態(tài)的影響

設(shè)定壁材比為2∶3(明膠∶阿拉伯膠)，壁材質(zhì)量濃度為1%，芯壁比為1∶8、1∶4、1∶2、1∶1、2∶1(精油∶壁材)，攪拌速度為300 r/min，緩慢地滴加10%的醋酸溶液調(diào)節(jié)pH為3.6，同樣的操作按1.5.2方法進行實驗。

1.5.5 攪拌速率對微膠囊濕囊形態(tài)的影響

設(shè)定壁材比為2∶3(明膠∶阿拉伯膠)，壁材質(zhì)量濃度為1%，芯壁比為1∶1，攪拌速度為150、300、450、600 r/min，緩慢地滴加10%的醋酸溶液調(diào)節(jié)pH為3.6，同樣的操作按1.5.2方法進行實驗。

1.6 精油微膠囊物化指標分析

1.6.1 掃描電鏡分析

結(jié)合侯欽帥[20]采用噴霧干燥法制備南極磷蝦精油微膠囊的研究，測定精油微膠囊的表征形態(tài)。在導電膠條上均勻涂抹少量凍干微膠囊產(chǎn)品，輕輕吹去多余的微膠囊粉末，均勻噴金后在真空條件下進行掃描電鏡觀察，調(diào)節(jié)合適的視野并拍照。

1.6.2 熱重分析

結(jié)合向殷豐等[21]采用復合凝聚沙棘籽油微膠囊制備及其特性的研究，對精油微膠囊樣品進行熱重分析。N2流速：30 mL/min，程序升溫：40～600 ℃，升溫速率為10 ℃/min。

1.6.3 精油裝載量(LC)、包埋率(EE)和微膠囊產(chǎn)率(MY)

結(jié)合徐子淇[22]采用殼聚糖-阿拉伯膠復凝聚制備芳樟醇微膠囊的研究，測定精油裝載量(LC)、包埋率(EE)和微膠囊產(chǎn)率(MY)。

精油微膠囊裝載量(LC)的計算見式(2)。

(2)

精油微膠囊包埋率(EE)式(3)為：

(3)

式中：m1為微膠囊內(nèi)包埋的精油質(zhì)量/g；m2為初始使用精油的質(zhì)量/g。

精油微膠囊產(chǎn)率(MY)式(4)為：

(4)

式中：M1為凍干微膠囊產(chǎn)品質(zhì)量/g；M0為初始使用壁芯和壁材的質(zhì)量/g。

1.6.4 精油微膠囊的緩釋性能

結(jié)合劉萬龍[23]采用復凝聚法制備薰衣草精油微膠囊的研究，測定精油微膠囊的緩釋性能。取3～5 g精油微膠囊產(chǎn)品平鋪于培養(yǎng)皿中，敞口放置于干燥器，常溫避光儲藏。分別于0、10、20、40、80 d進行熱重分析，繪制精油微膠囊的精油裝載量隨時間的變化曲線，以此表征精油微膠囊在常溫條件下的緩釋性能。

1.6.5 精油微膠囊的抑菌效果

結(jié)合張珊珊[24]采用乳液模板-層層自組裝法制備精油微膠囊的研究，比較精油微膠囊的抑菌效果，并稍作修改。準確稱取1 g的精油微膠囊，紫外線滅菌30 min后，均勻分散于5 mL無菌生理鹽水，備用。當復合精油使用量為3 μL時，根據(jù)精油裝載量計算，精油微膠囊分散液使用量為25 μL。用十字交叉法測得抑菌圈直徑，并求其平均值。

1.6.6 精油微膠囊在稻谷儲藏運輸中的抑菌效果

參照GB/T 4789.15—2010[25]檢測稻谷樣品的霉菌菌落總數(shù)的方法，比較精油微膠囊在稻谷儲藏運輸中的抑菌效果，并稍作修改。按1∶5(水∶稻谷)的比例將無菌水接入稻谷中，拌勻，分裝并密封后置于40 ℃培養(yǎng)箱中。在不同的霉變階段取樣，取樣時間為0、2、4、6、8、10 d(0 d為未結(jié)露)，測定稻谷的霉菌菌落總數(shù)(以每個取樣中稻谷霉菌菌落總數(shù)平均值為準)以確定霉變程度，置于4 ℃保藏，備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 精油微膠囊的制備

2.1.1 復凝聚體系pH的確定

復凝聚體系pH是誘發(fā)反應進行的最關(guān)鍵因素[26]。pH對反應體系的濁度和壁材利用度的影響結(jié)果見圖1。反應體系最初的pH大約為5，隨著pH下降，反應體系的濁度呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，在pH 3.6時，反應體系濁度和壁材利用度達到最高，說明pH 3.6時，凝聚相體系中的正電荷和負電荷處于相對平衡的狀態(tài)，當pH繼續(xù)降低，電荷平衡被打破，導致濁度下降。

注：標有不同字母表示復凝聚體系濁度和壁材利用度在不同pH的差異顯著(P<0.05)。圖1 復凝聚體系pH對復凝聚體系的濁度和壁材利用度的關(guān)系

2.1.2 壁材比的確定

圖2 微膠囊壁材比例對其形態(tài)的影響(100×)

根據(jù)壁材比的增加，精油微膠囊的形態(tài)也隨之發(fā)生了明顯的變化。微膠囊壁材比例對其形態(tài)的影響結(jié)果見圖2。壁材比為2∶1，微膠囊粒徑大小不均，相互粘連，說明明膠含量過高會導致復凝聚體系黏度過高，易發(fā)生微膠囊的粘連；當壁材比為1∶2時，形成的微膠囊形態(tài)不飽滿，有未利用空間，說明明膠含量過低會導致成囊效果差。因此，壁材比為1∶1.5時，微膠囊不易粘連且圓潤飽滿。

2.1.3 壁材濃度的確定

不同的壁材濃度對微膠囊產(chǎn)品具有顯著的影響。壁材濃度對微膠囊形態(tài)的影響結(jié)果見圖3。壁材質(zhì)量濃度為0.5%時，形成的微膠囊粒徑不均，體系中產(chǎn)生過多廢水，說明壁材濃度過低不利于形成良好形態(tài)的微膠囊。當壁材質(zhì)量濃度增加到2.5%時，已不能形成圓潤微膠囊球，說明壁材濃度過高會導致囊壁變厚，體系黏度過高，壁材粒子發(fā)生粘連，從而形成不規(guī)則的團狀。因此，確定壁材質(zhì)量濃度為1%較適合。

2.1.4 芯壁比的確定

芯壁比的增加對精油微膠囊形態(tài)的影響結(jié)果見圖4。當芯壁比為1∶8時，囊心存在未利用空間，說明芯壁比過低會導致裝載效率低，浪費壁材。當芯壁比增加為2∶1時，壁材無法完全包裹，表面含油量增加，說明芯壁比過高又會導致微膠囊外壁變薄，微膠囊易發(fā)生破裂。因此，芯壁比為1∶1時芯材和壁材可得到充分利用。

圖4 芯壁比對微膠囊形態(tài)的影響(400×)

2.1.5 攪拌速率的確定

機械攪拌對微膠囊的大小和形態(tài)的影響結(jié)果見圖5。當攪拌速率為150 r/min時，大小分布不均，含油量很高，說明攪拌速率過低會導致微膠囊嚴重黏結(jié)，不利于形成規(guī)則的球狀。當攪拌速率增加至600r/min時，形成的粒徑很小，液滴聚集困難，說明攪拌速率過高會導致微膠囊嚴重變形，不利于包埋芯材。因此，450 r/min是較為合適的攪拌速率。

圖5 攪拌速率對微膠囊形態(tài)的影響(40×)

2.2 精油微膠囊的理化性質(zhì)

2.2.1 精油微膠囊的形態(tài)與結(jié)構(gòu)

通過復凝聚法制備復合精油微膠囊樣品的結(jié)果見圖6。通過掃描電鏡SEM觀察的微膠囊凍干產(chǎn)品，制成的精油微膠囊是由球形結(jié)構(gòu)組成的片狀物，球體表面較光滑且存在少數(shù)凹陷，說明冷凍干燥過程微膠囊內(nèi)部的水分揮發(fā)，造成壁材的皺縮，但此時由明膠和阿拉伯膠構(gòu)成的囊壁并未破裂，結(jié)構(gòu)保持完整，具有很強的剛性。

圖6 精油微膠囊的掃描電鏡圖像

2.2.2 精油、精油微膠囊和空白微膠囊的熱重分析

測定復凝聚法制備的精油微膠囊樣品的變化過程，結(jié)果見圖7。溫度自常溫升高，混合精油快速揮發(fā)，說明此溫度范圍微膠囊結(jié)構(gòu)被破壞，其中包埋的精油快速損失。

圖7 精油、精油微膠囊和空白微膠囊的熱重分析

2.2.3 精油裝載量(LC)、包埋率(EE)和微膠囊產(chǎn)率(MY)的計算

通過正負電荷相互吸引形成的復合凝聚物，在最優(yōu)工藝條件下制備的微膠囊的裝載量為58.61%，包埋率為82.52%，產(chǎn)率為67.42%。這與石澤棟等[27]復合凝聚制備牛至精油微膠囊的研究中分析精油裝載量和包埋率對微膠囊形態(tài)的影響相似，其中肉桂-丁香-百里香精油微膠囊的載油量較低，產(chǎn)率較高，對壁材和壁芯的利用度較高。

2.2.4 精油微膠囊的緩釋性能測定

微膠囊產(chǎn)品的控釋或緩釋行為是對精油進行微膠囊化的主要目標之一，也是用來評價微膠囊產(chǎn)品實際應用可能性的重要指標。不同溫度下精油微膠囊的緩釋性能有明顯差異。在0～20 d時，精油的裝載量降低較快，說明新制備的微膠囊精油含量多，釋放快。在20 d后，釋放速率變得緩慢，說明微膠囊的

表1 精油和精油微膠囊對5株霉菌的抑制效果比較

表2 精油微膠囊在稻谷儲藏運輸中的抑菌效果比較

含油量降低，表面開始皺縮，微膠囊表面積減小，降低了精油的揮發(fā)速率。溫度越低，精油的釋放速度越慢，這說明精油微膠囊適合低溫保藏；而高溫條件下，精油的快速釋放將有利于其抑菌性能的發(fā)揮。

2.2.5 精油微膠囊的抑菌效果比較

精油和精油微膠囊對來自稻谷的5株霉菌的抑制效果的結(jié)果見表1。在第3天時，相比于精油，精油微膠囊對5株霉菌抑制效果降低；在第5天時，精油對霉菌的抑制效果顯著降低，而精油微膠囊對霉菌的抑制效果無顯著變化；當達到第10天時，精油微膠囊對5株霉菌的抑制效果均高于精油，這說明精油微膠囊為緩慢釋放精油的過程，對在儲藏運輸過程中霉變稻谷具備緩釋抑菌的效果。

2.2.6 精油微膠囊在稻谷儲藏運輸中的抑菌效果比較

在結(jié)露稻谷霉變過程中霉菌菌落總數(shù)呈現(xiàn)上升的趨勢，精油微膠囊在稻谷儲藏運輸中的殺菌效果比較結(jié)果見表2。在相同儲藏時間內(nèi)，精油、精油微膠囊實驗組的霉菌總數(shù)明顯均低于對照組，這表明精油、精油微膠囊具有明顯的抑菌效果。其中，復合精油微膠囊處理的稻谷霉變率最低。與單一精油處理的稻谷相比，復合精油微膠囊處理的稻谷有更顯著的抑菌效果，能夠更好地抑制微生物的增長，降低霉變率，延長稻谷的儲藏時間。

3 結(jié)論

本研究通過復凝聚法成功制備了以肉桂精油、丁香精油和百里香精油為芯材，以明膠、阿拉伯膠為壁材的肉桂-丁香-百里香精油微膠囊，分析并確定了肉桂-丁香-百里香精油微膠囊的理化特性和最佳工藝指標。通過肉桂、丁香、百里香3種精油復合制備而成的精油微膠囊，對在霉變稻谷中主要霉變的5種菌株(Aspergillus sydowii、Aspergillus candidus、Nigrospora oryzae、Aspergillus versicolor、Penicillium brocae)具有更高的熱穩(wěn)定性和緩釋性能，且在儲藏運輸過程中抑制稻谷的霉菌得到了很好的應用。然而，在稻谷運輸過程中，溫度、濕度和水分屬于無法控制的因素，還需要進一步深入研究更有效的抑菌劑控制霉菌的生長，為今后天然植物精油在不同運輸條件對稻谷中抑制霉菌的生長提供技術(shù)支持。另外，進一步降低應用成本也是要考慮的方面之一。