不同春生葉齡期追施氮肥對小麥粉蛋白致敏性的影響

姚亞亞， 王瀅穎， 周晨霞， 劉 爽， 郭愛良， 李慧靜

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院1，保定 071001)(北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心；北京工商大學(xué)2，北京 100048)

小麥蛋白含量是評價小麥粉品質(zhì)的重要指標(biāo)，然而，在過敏原易感人群中，特定的小麥蛋白會引發(fā)不良的免疫反應(yīng)和臨床表現(xiàn)，如小麥過敏、貝克哮喘和小麥依賴性運(yùn)動誘發(fā)過敏反應(yīng)(WDEIA)。目前，國家提倡小麥全產(chǎn)業(yè)鏈，從種植、收獲到生產(chǎn)加工一體化全過程，小麥品質(zhì)保障、安全生產(chǎn)應(yīng)從源頭抓起。

小麥籽粒蛋白質(zhì)的含量和組成是由遺傳和環(huán)境因素共同決定的[1, 2]。Monaghan等[3]指出在相同條件下，烘焙面包的小麥基因型比其他小麥基因型產(chǎn)生的小麥籽粒蛋白質(zhì)的含量高出2%。然而，與遺傳因素相比，Kindred等[4]指出氮的有效性或同化吸收速率對小麥籽粒蛋白質(zhì)含量的影響(高達(dá)2倍)較大。提高全氮量是改善小麥籽粒蛋白質(zhì)含量的有效措施。然而，由于氮利用效率降低、環(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn)增加等非預(yù)期的副作用，以及高氮應(yīng)用帶來的其他生態(tài)問題[5]，應(yīng)探索栽培條件來減少這些問題。為了在不增加施氮量的情況下保持對小麥籽粒蛋白質(zhì)含量的滿意，集約化小麥生產(chǎn)中普遍推薦采用施氮分施和改施時機(jī)。

蛋白質(zhì)組成作為影響加工功能、營養(yǎng)價值和免疫原性潛能的重要品質(zhì)性狀，也受到施氮的有效調(diào)控[6]。氮肥是影響小麥籽粒產(chǎn)量和品質(zhì)的重要管理因素之一[7, 8]。吳培金等[9]研究表明增施氮肥可提高小麥籽粒蛋白質(zhì)及其組分含量。施氮時間對小麥籽粒產(chǎn)量和品質(zhì)也有顯著影響。據(jù)報(bào)道，通過選擇與生育發(fā)育相適應(yīng)的氮素施用時間可以提高蛋白質(zhì)在谷物中的合成和儲存量，適當(dāng)推遲施氮肥時間會增加面筋蛋白的含量[10]，施氮時間過遲，可能會限制氮轉(zhuǎn)化為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的數(shù)量[11]。楊麗娟等[11]研究了起身期、拔節(jié)期、孕穗期和開花期4個時期追施氮肥對新麥26籽粒產(chǎn)量及小麥粉品質(zhì)的影響，其結(jié)果表明在孕穗開始時追施氮肥較好。Rossmann等[12]研究表明可通過后期施氮肥改變小麥粉蛋白組分組成使小麥粉具有良好的烘焙品質(zhì)。此外，Rossmann等[13]還研究表明花期葉面施氮是提高蛋白質(zhì)濃度和蛋白質(zhì)組成的常用方法?？偟膩碇v，通過改變施氮時間可獲得較好品質(zhì)小麥粉。

由此可見，人們通過改變施氮時機(jī)和氮肥分施等措施提高蛋白質(zhì)的含量，從而提高小麥粉品質(zhì)。然而，小麥粉蛋白作為一種潛在的過敏原，對小麥粉過敏患者產(chǎn)生巨大的影響。目前，據(jù)研究表明，α-淀粉酶、非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白和胰蛋白酶抑制劑可引起面包師哮喘[14]，ω5-醇溶蛋白、高分子質(zhì)量麥谷蛋白和γ-醇溶蛋白可引起小麥依賴運(yùn)動誘發(fā)型(WDEIA)癥狀[15]，小麥中α/β-醇溶蛋白可導(dǎo)致小麥過敏患者乳糜瀉癥狀的發(fā)生，此外低分子質(zhì)量麥谷蛋白是作為獨(dú)立的過敏原可促進(jìn)局部炎癥的發(fā)生[16]。所以，一方面需要保證小麥籽粒產(chǎn)量和品質(zhì)，另一方面需要保證小麥粉有較弱的致敏性。Zhong等[17]研究對不同施氮時間調(diào)控的差異表達(dá)蛋白(DEPs)進(jìn)行鑒定，并在差異性表達(dá)蛋白中檢測了其中的過敏原相關(guān)蛋白，其結(jié)果表明，延遲施氮可降低致敏性相關(guān)蛋白的含量。到目前為止，施氮時間對蛋白質(zhì)組分的影響信息較少，對蛋白致敏性的影響較少涉及。

本研究在田間栽培了3個高筋含量小麥品種，根據(jù)葉齡不同和施氮肥時間不同，將成熟的小麥籽粒用LRMM-8040-3-D實(shí)驗(yàn)?zāi)シ蹤C(jī)磨成粉。評價不同葉齡期施氮肥對小麥總蛋白質(zhì)含量及蛋白質(zhì)組分的影響。此外，通過免疫印跡技術(shù)對小麥粉蛋白組分致敏性進(jìn)行分析。本研究目標(biāo)是揭示施氮肥時間對小麥粉蛋白組分及其致敏性的影響。研究結(jié)果可為通過不同施氮時間處理提高小麥粉安全性提供新的思路。另外，小麥過敏癥不易治愈[18]，所以選擇低敏小麥品種或者降低小麥過敏原的致敏性，對于患有過敏癥或者尚不知曉自身患病的消費(fèi)者是一種保護(hù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

小麥品種：石4366(SH4366)、科農(nóng)2009(KN2009)、藁優(yōu)2018(GY2018)。所用小麥品種原材料由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供，其大田種植實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為選用3個品種，樣品種植采用二因素裂區(qū)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，主區(qū)為3個，每個品種都設(shè)有副區(qū)為追氮時期，設(shè)春3葉露尖(N3)、春4葉露尖(N4)、春5葉露尖(N5)和春6葉露尖(N6)追氮4個水平。種植小區(qū)面積44 m2，3次重復(fù)，共36個小區(qū)。春季灌2次水，N3、N4、N5和N6分別在相應(yīng)追氮時期灌第1次水并追施氮肥(施底肥后旋耕2遍，15 cm等行距播種，總施肥量為純氮240 kg/hm2、磷(P2O5)為135kg/hm2、鉀(K2O)為150 kg/hm2，其中磷肥和鉀肥及50%的氮肥作底肥，其余50%氮肥按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的春生葉齡期追施)，開花期灌第2次水。將收獲后的小麥用LRMM-8040-3-D實(shí)驗(yàn)?zāi)シ蹤C(jī)磨成粉，取小麥粉作為本研究的實(shí)驗(yàn)材料。12例小麥過敏患者血清由中國解放軍白求恩國際和平醫(yī)院和北京軍區(qū)總醫(yī)院提供，過敏患者血清的sIgE水平已被發(fā)表[19]，3例小麥正常者血清由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)校醫(yī)院提供。

1.1.2 試劑

檸檬酸、磷酸三鈉、考馬斯亮藍(lán)(G-250)、丙烯酰胺(Acr)、甲叉丙烯酰胺(Bis)、過硫酸銨(AP)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、巰基乙醇、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、考馬斯亮藍(lán)(R-250)；牛血清白蛋白(BSA)；標(biāo)準(zhǔn)蛋白；小麥過敏原ELISA檢測試劑盒；聚偏氟乙烯(PVDF)膜；34079型ECL試劑盒；辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗人IgE；其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

ZNCL-S140X140磁力攪拌器，PHS-3C型pH計(jì)，DYCZ-28A型單板夾芯式垂直電泳儀，電熱恒溫培養(yǎng)箱，Multiskan FC型酶標(biāo)儀，LRMM-8040-3-D實(shí)驗(yàn)?zāi)シ蹤C(jī)，DYCZ-40B電轉(zhuǎn)儀。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)含量的測定

根據(jù)GB 5009.5—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》，采用微量凱氏定氮法測定不同葉齡期追施氮肥及不同品種小麥粉蛋白質(zhì)的含量。

1.2.2 小麥粉過敏原粗提取

稱取0.2 g小麥粉，分別以1∶20的質(zhì)量體積比加入30 mmoL/L，檸檬酸磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)，恒溫22 ℃下攪拌4 h。3 000×g離心20 min，收集上清，提取物在-20 ℃下儲存，以備后用。采用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford)測定不同品種小麥粉蛋白質(zhì)的含量，使用牛血清白蛋白配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，量取一定體積的樣品處理液，用酶標(biāo)儀測量其吸光度值，測定波長定為595 nm，使其測定結(jié)果保持在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線找出與其等值的標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度，從而計(jì)算出樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(mg/mL)，進(jìn)而得出樣品蛋白質(zhì)的含量。

1.2.3 過敏原含量的測定

采用商用試劑盒生物素雙抗體夾芯式酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定小麥粉過敏原含量，從冷藏室取出試劑盒，平衡至室溫。根據(jù)說明首先稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，然后設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本反應(yīng)孔，空白孔中不加樣品、鼠抗小麥過敏原(OVA)單克隆抗體、鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(HRP)，其各步驟操作相同；標(biāo)準(zhǔn)品孔根據(jù)試劑盒說明書依次加入試劑，標(biāo)準(zhǔn)品和鏈霉親和素-HRP各50 μL，樣本反應(yīng)孔加入已經(jīng)處理的樣本40 μL，然后各加入OVA抗體10 μL，鏈霉親和素-HRP 50 μL。蓋上封板膜，輕輕混勻，放置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃溫育60 min。溫育結(jié)束，取出樣品板小心揭掉封板膜，棄去液體，拍干。向各孔中加入洗滌液250 μL，靜置30 s后棄去，拍干，上述洗滌過程重復(fù)5次。洗滌后每孔先加入50 μL顯色劑A，后加入50 uL顯色劑B，振蕩混勻，置于恒溫箱中37 ℃進(jìn)行10 min的避光顯色。每孔加入50 μL終止液，終止反應(yīng)，樣品顏色立刻由藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色，此時用酶標(biāo)儀進(jìn)行測定450 nm波長的吸光度值(顯色及測量過程不超過10 min，故終止液添加要迅速)。

1.2.4 不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)垂直電泳，采用12%的分離膠和5%的濃縮膠，使用微型加樣針進(jìn)樣，將處理好的樣品沸水浴加熱5 min，樣品上樣量為10 μg。用導(dǎo)線將電泳模具與電泳儀鏈接，啟動電壓為80 V，待樣品進(jìn)入分離膠時，將電壓調(diào)至160 V，待染料前沿遷移至橡膠框底邊1 cm處，停止電泳并記錄好時間。取下凝膠，將凝膠置于固定液(含50%乙醇和10%冰乙酸的水溶液)中固定2 h，傾去固定液，置于考馬斯亮藍(lán)(R-250)染色液(用固定液配制體積分?jǐn)?shù)為0.25%的染色液)染色2～5 h，傾去染色液，加入脫色液(含20%乙醇和7%冰乙酸的水溶液)，幾小時更換1次脫色液，直到凝膠的藍(lán)色背景完全褪去，蛋白質(zhì)的電泳條帶清晰為止。

1.2.5 免疫印跡

采用免疫印跡技術(shù)對小麥粉蛋白組分進(jìn)行免疫學(xué)特性分析。首先采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)垂直電泳，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，進(jìn)行電泳，電泳后再將膠放入電轉(zhuǎn)液浸泡30 min，電轉(zhuǎn)時，按照墊片、濾紙、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、膠、濾紙、墊片的順序組裝在一起，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；將PVDF膜放置于3%BSA中封閉60 min；之后進(jìn)行洗膜，用1×TBST溶液洗滌5次，每次3 min；用3%BSA將血清按照1∶400的比例進(jìn)行稀釋，加入血清，37 ℃孵育2 h；同上洗膜，用1×TBST溶液洗滌5次，每次3 min；再加入用3%BSA將血清按照1∶5 000的比例進(jìn)行稀釋的二抗，置于搖床上37 ℃孵育1 h，同上洗膜5次后將ECL試劑盒中A液和B液按照1∶1比例混合取1 mL置于PVDF膜上；顯影、定影后攝像分析相對分子質(zhì)量。以3例正常人的血清和血清池為陰性對照，采用免疫印跡技術(shù)進(jìn)行免疫學(xué)特性分析鑒定小麥粉中存在的小麥非過敏原，操作步驟同上所述。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS Statistics 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Duncan進(jìn)行多重比較(P<0.05)，采用Quantity One 4.6.2對電泳圖譜和免疫印跡圖進(jìn)行分析，采用Origin 2021軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同葉齡期追施氮肥對小麥粉蛋白質(zhì)含量的影響

小麥中含有8%～15%的蛋白質(zhì)，主要是由清蛋白(albumin)、球蛋白(globulin)、醇溶蛋白(gliadin)和麥谷蛋白(glutenin)組成，其中麥醇溶蛋白和麥谷蛋白為面筋蛋白，也合稱儲藏蛋白，占小麥蛋白干基的80%[20]。蛋白質(zhì)含量與組分是小麥籽粒品質(zhì)形成機(jī)制的重要組成部分，其主要包含前期小麥開花前氮素和花后氮素的同化和吸收，形成蛋白質(zhì)底物，進(jìn)而利用蛋白質(zhì)合成關(guān)鍵酶合成蛋白質(zhì)[21]。小麥粉中蛋白質(zhì)的含量可反映不同施氮時期小麥的氮吸收和轉(zhuǎn)化效果。由表1分析可知，從不同葉齡期追施氮肥期對小麥粉中蛋白質(zhì)含量來看，KN2009小麥在春3葉露尖(N3)、春4葉露尖(N4)、春5葉露尖(N5)和春6葉露尖(N6)等不同時期追氮，隨著春葉露尖期追施氮肥期的延遲，小麥粉中蛋白質(zhì)含量先增加后減少，當(dāng)處于N4期追施氮肥，小麥粉中蛋白質(zhì)含量最高。SH4366小麥品種在N3、N4、N5和N6等不同時期追氮，小麥粉中蛋白質(zhì)含量先減少后增加，N3、N4和N6期蛋白質(zhì)的含量均高于N5期。GY2018小麥品種在在N3、N4、N5和N6等不同時期追氮，隨著春葉露尖期追施氮肥期的延遲，小麥粉中蛋白質(zhì)含量先增加后減少再增加，N4和N6時期小麥粉中蛋白質(zhì)含量均高于N3和N5時期小麥粉中蛋白質(zhì)含量。由此可見，隨著施氮時間的改變，不同品種中小麥粉中蛋白質(zhì)含量變化不穩(wěn)定。因此只考慮蛋白質(zhì)含量指標(biāo)無法對施氮期小麥品質(zhì)和安全性做出準(zhǔn)確的評價，故進(jìn)一步對其總過敏原含量及其蛋白組分進(jìn)行評價和分析。

表1 不同葉齡期追施氮肥小麥粉中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%

2.2 過敏原含量測定結(jié)果

小麥粉過敏原含量是對易感小麥過敏人群安全性評價的重要指標(biāo)。在種植過程中，除了考慮小麥籽粒的加工品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)外，小麥安全性也應(yīng)該被考慮在內(nèi)。由圖1可知，KN2009小麥品種在春3葉露尖(N3)、春4葉露尖(N4)、春5葉露尖(N5)和春6葉露尖(N6)等不同時期追氮，隨著春葉露尖期追施氮肥期的延遲，小麥粉中過敏原的含量增加，當(dāng)處于N4期追施氮肥，小麥過敏原的含量最低，相較于N3、N5和N6時期，小麥過敏原含量分別降低了2.75%、13.11%和9.40%，N3和N4期變化不顯著。SH4366小麥品種在N3、N4、N5和N6等不同時期追氮，隨著春葉露尖期追施氮肥期的延遲，小麥粉中過敏原的含量逐漸減少，當(dāng)處于N6期追施氮肥，小麥過敏原含量最低，相較于N3、N4和N5時期，小麥過敏原含量分別降低了28.68%、12.38%和18.58%。GY2018小麥品種在N3、N4、N5和N6等不同時期追氮，隨著春葉露尖期追施氮肥期的延遲，小麥粉中過敏原的含量先減少后增加，當(dāng)處于N4期追施氮肥，小麥過敏原含量最低，相較于N3、N5和N6時期，小麥過敏原含量分別降低了22.22%、2.00%和15.52%。Zhong等[17]通過參照葉齡調(diào)整追施氮肥的時機(jī)，發(fā)現(xiàn)延緩施氮處理可降低過敏蛋白含量。

從小麥粉過敏原含量的變化趨勢中，僅得出不同葉齡期追施氮肥對不同小麥品種在各個時期過敏原含量多少，而無法得出施氮時間的改變對小麥蛋白質(zhì)的某種具體組分存在影響，從而導(dǎo)致小麥粉過敏性的變化。因此，進(jìn)一步分析不同葉齡期追施氮肥對小麥粉蛋白質(zhì)組分以及其致敏性的影響。

注：同一品種標(biāo)有不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)。圖1 不同葉齡期追施氮肥對小麥粉過敏原含量的影響

2.3 小麥粉蛋白SDS-PAGE分析

注：M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1、2、3、4泳道分別為KN2009小麥品種的N3、N4、N5、N6施氮時期；5、6、7、8泳道分別為SH4366小麥品種的N3、N4、N5、N6施氮時期；9、10、11、12泳道分別為GY2018小麥品種的N3、N4、N5、N6施氮時期，下同。圖2 不同葉齡期施氮處理的小麥粉蛋白SDS-PAGE圖

采用SDS-PAGE方法分析了不同施氮時間對小麥粉蛋白質(zhì)亞基的影響。圖2顯示了追施氮肥對不同品種小麥粉蛋白質(zhì)亞基的影響結(jié)果，結(jié)果表明各品種小麥粉蛋白亞基組成未改變。蛋白質(zhì)亞基條帶的顏色深度改變表示蛋白質(zhì)亞基含量變化，使用Quantity One軟件分析SDS-PAGE電泳圖譜各泳道和條帶的灰度值，分析結(jié)果如圖3所示。如圖3a所示，隨著施氮時間的延遲，KN2009和SH4366小麥粉蛋白組分整體灰度均有所降低，GY2018小麥粉蛋白組分整體灰度逐漸增加。如圖3b所示，KN2009的小麥粉高分子質(zhì)量麥谷蛋白(HMW-GS)的含量隨施氮時間的延長逐漸增加；ω-麥醇溶蛋白含量的變化類似于高分子質(zhì)量麥谷蛋白的變化，但其變化不明顯；低分子質(zhì)量麥谷蛋白(LMW-GS)和α-和γ-麥醇溶蛋白的含量隨施氮時間的延長先增加后減少；在N4，N5和N6期間，清蛋白和球蛋白的含量降低，差異不明顯。如圖3c所示，SH4366小麥粉HMW-GS含量隨施氮時間的延長先降低后增加；ω-麥醇溶蛋白含量的變化不明顯；LMW-GS和α-和γ-麥醇溶蛋白的含量增加，而清蛋白和球蛋白的含量逐漸減少。如圖3d所示，GY2018小麥粉HMW-GS的含量隨施氮時間的延長先增加后減少；ω-麥醇溶蛋白的含量先降低后增加；此外，LMW-GS和γ-麥醇溶蛋白的趨勢與清蛋白和球蛋白相反，LMW-GS和α-和γ-麥醇溶蛋白逐漸增加，清蛋白和球蛋白逐漸減少，這表明施氮時間對氮肥的吸收利用效率有一定的調(diào)節(jié)作用。

注：1、2、3、4分別為HMW-麥谷蛋白、ω-醇溶蛋白、LMW-麥谷蛋白與α- 和γ-醇溶蛋白、清蛋白和球蛋白。圖3 小麥粉蛋白SDS-PAGE圖灰度值分析

因此，本研究表明不同施氮時間處理對小麥粉蛋白質(zhì)亞基組成未改變，但對小麥粉蛋白質(zhì)亞基含量造成改變，針對不同品種小麥粉蛋白質(zhì)亞基變化不一，不同施氮時間對小麥不同品種的蛋白質(zhì)組分調(diào)節(jié)效應(yīng)不同，這與張寶軍等[22]報(bào)道的一致，蛋白質(zhì)組分中清蛋白和谷蛋白隨施肥時期推后，呈遞增趨勢，但球蛋白以拔節(jié)期施肥含量最高，醇溶蛋白以拔節(jié)期或返青期施肥含量最高。石書兵等[23]在研究了不同施氮期對新疆冬小麥蛋白組分的影響，結(jié)果表明隨施氮時期延遲，小麥中的清蛋白和球蛋白含量減少，麥谷蛋白和麥醇溶蛋白的含量有所增加。劉尊英[24]研究表明推遲施氮時間，清蛋白含量變化不明顯，醇溶蛋白的含量在抽穗期追施氮肥時為最高，球蛋白和麥谷蛋白的含量在孕穗期追施氮肥含量最高。李姍姍等[25]得出了類似的結(jié)論，研究表明清蛋白與追氮時期的關(guān)系不大?？傊?，關(guān)于施氮時期和籽粒中蛋白質(zhì)亞基含量的關(guān)系問題，前人研究結(jié)果均存在一定差異，這可能是由于選用的小麥品種不同而造成的。因此，關(guān)于研究不同春生葉齡期施氮對小麥粉蛋白致敏性的影響，還需對不同施氮時間處理的不同小麥品種的小麥粉蛋白組分免疫表達(dá)還需進(jìn)一步分析。

2.4 小麥粉蛋白免疫印跡

小麥粉作為人類飲食的重要組成部分，有引發(fā)食物過敏的缺點(diǎn)，影響6%～8%的兒童和1%～3%的成人[26]。本研究以12例小麥粉過敏患者混合血清為一抗，3例非小麥粉過敏患者混合血清為陰性對照(圖4)，采用免疫印跡技術(shù)分析不同葉齡期追施氮肥對小麥粉蛋白致敏性的影響(圖5)。采用Quantity One軟件分析免疫印跡圖各泳道和條帶的光強(qiáng)度，用光強(qiáng)度表示小麥粉和組分致敏性的變化(圖6)。

圖4 不同葉齡期施氮處理的小麥粉與小麥非過敏患者血清反應(yīng)的免疫印跡圖

圖5 不同葉齡期施氮處理的小麥粉與小麥過敏患者血清反應(yīng)的免疫印跡圖

圖6 小麥粉免疫印跡光強(qiáng)度值分析

圖4表明亞基分子質(zhì)量在48 ku的蛋白為非致敏性蛋白，此外，非過敏患者免疫印跡圖中各泳道上端部分殘留有較深印跡，該部分為非致敏性蛋白，因此在分析小麥粉與過敏患者血清免疫印跡圖時，將此部分排除。如圖6所示，隨著施氮時間的延遲，3種小麥品種的小麥過敏原亞基致敏性發(fā)生了變化。KN2009小麥粉HMW-GS的致敏性先增高后降低，LMW-GS、α-和γ-麥醇溶蛋白，清蛋白和球蛋白的致敏性增加，ω-麥醇溶蛋白的致敏性變化不明顯，排除分子質(zhì)量在48 ku的蛋白，N3時期小麥粉各組分蛋白致敏性最低。SH4366小麥粉中，除了清蛋白和球蛋白致敏性增加之外，其余的致敏性先增加后減少，總的來看，N3時期施氮肥安全性較高。GY2018小麥粉致敏性的變化主要取決于高分子質(zhì)量麥谷蛋白和ω-麥醇溶蛋白的變化，高分子質(zhì)量麥谷蛋白的致敏性先降低后增高，ω-麥醇溶蛋白的致敏性逐漸降低，其他過敏原含量無明顯變化。因此從其各組分與過敏患者血清結(jié)合強(qiáng)度綜合分析，建議KN2009和SH4366小麥品種在N3時期施氮肥，GY2018小麥品種在N5時期施氮肥較適宜。

由圖5可知，3種小麥品種均表明施氮時間對小麥粉蛋白致敏性存在顯著影響，但不同小麥品種含有的小麥粉蛋白所表現(xiàn)出的致敏性不一致，這是由于小麥品種本身決定的，不同小麥籽粒中蛋白質(zhì)組分含量存在較大差異[14, 27, 28]。Pak等[29]通過比較8種不同種類小麥品種，結(jié)果表明不同品種小麥各蛋白組分致敏性不同且有顯著差異。Nakamura等[30]比較了321個小麥品種的致敏性，并篩選出相對較低致敏性的小麥品種。就所研究的3個小麥品種而言，不同小麥品種的主要致敏蛋白亞基是不同的。Tea等[31]研究表明，葉面施肥提供的氮主要存在于貯藏蛋白中。從研究的3種小麥品種來看，不同品種小麥所含主要的致敏蛋白組分不一樣。高分子質(zhì)量麥谷蛋白和ω-麥醇溶蛋白均是3種小麥品種的主要致敏蛋白，KN2009、 SH4366 和GY2018均含有分子質(zhì)量為29 ku的較強(qiáng)致敏性亞基蛋白，KN2009比SH4366 、GY2018小麥品種多了一種分子質(zhì)量為26 ku的較強(qiáng)致敏性亞基蛋白。此外，KN2009與SH4366、GY2018均含有分子質(zhì)量為43 ku的致敏性亞基蛋白，而GY2018含有與其相異的分子質(zhì)量為38 ku的致敏性亞基蛋白。

Kohno等[32]評估了低過敏性的面包小麥缺乏編碼ω-麥醇溶蛋白的基因。Zhong等[17]研究在小麥植株在上五葉(TL5)、上三葉(TL3)和上一葉(TL1)出現(xiàn)時，對不同施氮時間調(diào)控的差異表達(dá)蛋白(DEPs)進(jìn)行鑒定，在差異性表達(dá)蛋白中檢測了其中的過敏原相關(guān)蛋白，包括α-嘌呤硫素、二聚α-淀粉酶抑制劑0.19、奇異果甜蛋白和單體α-淀粉酶抑制劑，且α-嘌呤硫素在TL1時期的含量高于TL3時期，其結(jié)果表明，延遲施氮可降低致敏性相關(guān)蛋白的含量。

3 結(jié)論

通過分析不同葉齡期施氮對小麥粉蛋白質(zhì)含量、蛋白質(zhì)組分以及致敏性的影響，結(jié)果表明，施氮時間不僅對小麥粉蛋白質(zhì)含量有顯著影響，對其蛋白質(zhì)亞基含量及其免疫性表達(dá)也存在顯著性影響。不同小麥品種的小麥粉蛋白免疫性表達(dá)不同，這是由于小麥品種自身遺傳基因決定的。不同葉齡期施氮對小麥粉蛋白致敏性的影響表明，KN2009與SH4366小麥隨施氮時間的推遲，小麥粉蛋白的致敏性增強(qiáng)，GY2018小麥品種隨施氮肥時間的延遲，致敏蛋白含量逐漸降低，因此KN2009和SH4366小麥品種在N3時期施氮肥，GY2018小麥品種在N5時期施氮肥較適宜。26、29、38、43 ku的蛋白亞基是KN2009小麥的主要致敏蛋白，29、43 ku的蛋白亞基是SH4366小麥的主要致敏蛋白，29、38、43 ku的蛋白亞基是GY2018小麥的主要致敏蛋白。此外，施氮時間的延遲，主要影響的小麥粉的致敏蛋白包括高分子質(zhì)量麥谷蛋白，ω-麥醇溶蛋白以及分子質(zhì)量在26、29、38、43 ku的蛋白亞基。可以通過合理的改變施氮時間來降低小麥粉中致敏蛋白的含量。根據(jù)分析出的主要致敏蛋白，可通過改變小麥蛋白基因型或在不改變小麥品質(zhì)的情況下去除致敏蛋白。因此本研究有助于為后期通過改變栽培條件等減少這些蛋白質(zhì)的潛在有害影響，以獲得安全性較高的小麥粉加工原料。