青海省野生中國沙棘根際解磷菌的初步研究

韓景浩

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院， 青海 西寧 810016)

沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)為落葉灌木，其根有根瘤，是非豆科木本固氮樹種，廣泛分布于我國華北、西北、西南等地，其具有良好的環(huán)境保護(hù)特性，能在惡劣環(huán)境下生存，具有防風(fēng)固沙以及能在缺水環(huán)境下正常生長發(fā)育。因此,被廣泛用于水土保持，作為改良土壤的優(yōu)良樹種，目前已成為水土流失治理的先鋒樹種，在我國西北部大量種植，具有極高的生態(tài)研究價值[1-3]。

植物根際的存在使得周圍環(huán)境在各種理化特性和生物學(xué)性質(zhì)上與土壤主體不一致[4，5]。根際土壤的存在與陸地微生物生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)系密切，決定了陸地微生物生態(tài)系統(tǒng)的多樣性，根際有益微生物與植物根系相互作用，通過寄生、異生和互生的方式與土壤共同組成了一個極其特殊的生態(tài)系統(tǒng)。根際有益微生物具有很好的優(yōu)勢，它們自身具有種類多、生長周期短、繁衍至下一代時間短、生化反應(yīng)相應(yīng)的代謝酶活力強(qiáng)勁，對土壤中各種有益但難以被植物吸收利用的營養(yǎng)物質(zhì)的分解轉(zhuǎn)化具有相對較強(qiáng)的促進(jìn)作用，既有利于植物保持活力，也有利于土壤環(huán)境的健康、維持土壤生態(tài)，對綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有相當(dāng)重大的意義[6-15]。PGPR對植物促生效果主要體現(xiàn)在解磷、解鉀、固氮等層面[16]。研究表明解磷菌解磷能力的發(fā)揮主要是解磷促生菌能夠通過自身發(fā)酵產(chǎn)生某些有機(jī)酸(如丙酸、乙酸和甲酸等)，酸性物質(zhì)的存在使植物根周圍土壤酸堿環(huán)境發(fā)生改變，使其pH值下降，使難以被植物吸收利用的難溶性或不溶性的無效磷能夠轉(zhuǎn)變?yōu)橐子诒恢参镂绽玫目扇苄缘乃傩Я?，達(dá)到促進(jìn)生長發(fā)育的效果[17]。解磷菌的存在能明顯改善根系對磷元素的吸收，為植物的生長發(fā)育提供更加充足的營養(yǎng)物質(zhì)，改良植物的營養(yǎng)狀況[18-22]?？梢钥闯銮叭说难芯恐饕窃谄渌参锷蠈饬拙芯枯^多，而關(guān)于沙棘根際解磷菌解磷能力的研究較為滯后。

因此，本研究對于青海省西寧市湟中區(qū)野生中國沙棘根際解磷菌進(jìn)行初步研究，旨在發(fā)現(xiàn)具有解磷效應(yīng)的優(yōu)勢菌株，為進(jìn)一步對整個西北地區(qū)解磷菌進(jìn)行更深層次的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 土樣與培養(yǎng)基

土樣：選擇青海省西寧市湟中區(qū)上臺村野生中國沙棘分布區(qū)的林區(qū)，采集野生中國沙棘的根際土壤作為試驗研究的初始材料。

培養(yǎng)基：有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基(含瓊脂或不含瓊脂；青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)用于解有機(jī)磷細(xì)菌的分離及解磷能力測定；無機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基(含瓊脂或不含瓊脂；青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)用于解無機(jī)磷細(xì)菌的分離和溶磷能力的測定；普通肉湯培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)用于細(xì)菌的增菌培養(yǎng)；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(上海索萊寶生物科技有限公司)用于細(xì)菌的純化。

1.2 試驗方法

樣點選擇：采樣前，選擇土質(zhì)相對肥沃的林區(qū)，利用X形采樣的方法，整個大區(qū)(涵蓋此區(qū)域所有的范圍)選擇5個大采樣點，每個大樣點涵蓋5-6個小樣點，每個小樣點采集的土壤約20-35g 左右。

采樣操作：在取土之前事先用酒精對鐵鍬進(jìn)行消毒處理，然后進(jìn)行土樣的采集，取表層20cm以下連同中國沙棘根系的陽面肥沃的土壤，裝入事先編好號的無菌自封袋中，帶回實驗室后充分混在一起，輕輕抖動根系以保證土壤充分從根系落下，過篩去掉土壤中較大的顆粒土，然后將處理好的中國沙棘根際土壤于4℃冰箱冷藏保存，用于后續(xù)根際促生菌的研究。

解磷菌的分離：采用張晶晶[16]研究中的梯度稀釋法得到不同梯度的土壤混懸液。采用其分離方法得到解磷菌單菌落，選擇帶有菌圈、個頭較大的菌落利用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進(jìn)行劃線純化培養(yǎng)(劃線3代以上)。按著其方法獲得的單菌落制備菌懸液，具體操作為取一環(huán)已純化的待測菌株單菌落接種在7-10ml的肉湯培養(yǎng)液中，在37℃、170rpm下，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)，待菌液混濁既可[16]。

解磷能力測定(初篩)：采用張晶晶[16]的方法，利用打孔器在解磷菌班上打孔，將菌懸液植入到孔中，培養(yǎng)1d和3d，通過比較菌圈半徑，確定解磷能力大小，具體見相應(yīng)的文獻(xiàn)。

解磷能力檢測(復(fù)篩)：(1)采用張晶晶[16]的方法進(jìn)行搖管培養(yǎng)，具體步驟見相應(yīng)的文獻(xiàn)。(2)菌發(fā)酵液中磷含量的測定：培養(yǎng)結(jié)束后，取培養(yǎng)1d、3d和6d磷細(xì)菌發(fā)酵液3ml，于4℃、5000rpm下離心15min，吸取上清液，解無機(jī)磷菌吸2.5ml，解有機(jī)磷菌吸2.5ml，經(jīng)濾膜過濾至檢測杯中，采用吳丹丹等方法[23]，運用AA3全自動流動分析儀進(jìn)行總磷的測定，每個樣品測量3個重復(fù)，通過分析總磷含量，確定菌株解磷能力強(qiáng)弱。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗數(shù)據(jù)處理采用的軟件為Microsoft Excel 2010 。利用其對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷菌的分離

通過對采集到的中國沙棘根際土菌液的分離共得到72株待測解無機(jī)磷菌和24株待測解有機(jī)磷菌，分別進(jìn)行編號，具體為WP1-WP72和YP1-YP24。

2.2 解磷菌的初篩結(jié)果與分析

對分離得到的72株待測解無機(jī)磷菌和24株待測解有機(jī)磷菌進(jìn)行解磷圈法試驗，這些待測菌的菌圈結(jié)果相對較小，解無機(jī)磷菌圈效果相對較好的有18株菌，解有機(jī)磷菌圈效果較好的有12株菌。結(jié)果見表1、表2和圖1、圖2。

圖2 解磷菌的解有機(jī)磷能力測定Figure.2 Solution of organic phosphorus ability test of phosphate-solubilizing bacteria

表1 解無機(jī)磷菌菌圈半徑Table.1 Inorganic phosphate solubilizing bacteria circle radius

表2 解有機(jī)磷菌菌圈半徑Table.2 Radius of organophosphate solubilizing bacteria circle

圖1 解磷菌的解有機(jī)磷能力測定Figure.1 Solution of organic phosphorus ability test of phosphate-solubilizing bacteria

從表1和圖1可以看出，培養(yǎng)1d后，解磷菌在解無機(jī)磷平板上形成了透明圈，其半徑為1.02-3.15mm；培養(yǎng)3d后，各菌株都形成了明顯的透明圈，其半徑為1.66-7.22mm。其中WP1、WP3、WP4、WP5和WP7-WP12這10株菌相對來說解磷初篩效果較好。

從表2和圖2可以看出，培養(yǎng)1d后，解磷菌在解有機(jī)磷平板上均形成了菌圈，其半徑為0.97-2.01mm；培養(yǎng)3d后，各菌株都形成了明顯的渾濁圈，其半徑為2.56-5.05mm。其中，解有機(jī)磷效果相對較好的菌株有：YP1、YP2、YP3、YP4、YP5、YP6和YP7。

2.3 解磷菌的復(fù)篩結(jié)果與分析

流動分析儀檢測磷含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖3 流動分析儀的磷標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure.3 The phosphorus standard curve of flow analyzer

圖3表明，流動分析儀標(biāo)準(zhǔn)曲線符合檢測規(guī)定，檢測數(shù)據(jù)可靠。將初篩得到的18株解無機(jī)磷菌株和12株解有機(jī)磷菌株與CK(加入等量滅活培養(yǎng)液)一起進(jìn)行液體搖瓶復(fù)篩，解磷菌用流動分析儀進(jìn)行檢測，其發(fā)酵液在1d、3d、6d的可溶性磷含量測定結(jié)果見表3、表4和圖4、圖5。

表4 解有機(jī)磷菌株可溶性磷含量的測定Table.4 Determination of the soluble phosphorus content of organophosphate decomposing strains

由表3和圖4可知，隨著接種天數(shù)的增加，解無機(jī)磷菌株發(fā)酵液中可溶性磷含量在1-3d全部呈上升趨勢，大部分在3-6 d呈下降趨勢，只有WP-6、WP-8、WP-9和W17菌株的發(fā)酵液中可溶性磷含量呈上升趨勢，這說明全部待測菌株，前3d的解無機(jī)磷能力相對較強(qiáng)，除了上述4株菌株外，其他菌株3-6d解無機(jī)磷能力變?nèi)?根據(jù)可溶性磷含量檢測的趨勢)。但是與CK相比較，除了第1d WP-4菌株可溶性磷含量的值略微大于CK值，其它所有菌株所有天數(shù)的可溶性磷含量的檢測值都小于CK值，表明這些待測菌株解磷效果相對較低。

表3 解無機(jī)磷菌株可溶性磷含量的測定Table.3 Determination of the soluble phosphorus content of inorganic phosphorus solubilizing strains

圖4 解無機(jī)磷菌株可溶性磷含量的測定Figure 4.Determination of the soluble phosphorus content of inorganic phosphorus solubilizing strains

由表4和圖5可知，隨著接種天數(shù)的遞增，解有機(jī)磷YP-1—YP-6菌株發(fā)酵液中可溶性磷含量在1-3d呈上升趨勢，YP-7、YP-9、Y-10和YP-12呈下降趨勢，而在3-6d中，所有菌株都呈下降趨勢。此外，與CK相比，YP-4、YP-6、YP-7和YP-10在第1d的解磷能力均大于CK，其中Y-7和Y-10相對較好，Y-4和Y-6略微大于CK，但在第3d，所有菌株的可溶性磷含量都小于CK值，表明在第3d，所有待測菌株幾乎沒有解磷能力，而在第6d，除了菌株YP-5的可溶性磷含量略大于CK外(YP-5在第6d的可溶性磷含量為0.4098mg/L)，其他所有菌株可溶性磷含量都等于0。這表明除了第1d的YP-7和YP-10的解有機(jī)磷的能力相對較好，其他菌株其他天數(shù)的所有菌株的解有機(jī)磷能力相對較弱。

圖5 有機(jī)磷菌株解磷能力測定Figure.5 Determination of Phosphate Solubilization Ability of Organophosphate Strains

3 討論與結(jié)論

張晶晶等[24]在新疆核桃根際解磷菌的研究中分析解磷菌的解磷效果明顯都高于CK值，有14株解磷效果較好的解磷菌；郭藝鵬等[25]在棗樹根際解磷菌的研究發(fā)現(xiàn)了2株比較好的解無機(jī)磷菌以及2株比較好的解有機(jī)磷菌株；趙樹棟等[26]在高原早熟禾根際促生菌的研究中發(fā)現(xiàn)了4株解無機(jī)磷菌株和3株解有機(jī)磷菌株。而本研究的結(jié)果與以上學(xué)者的研究結(jié)果相比較，所研究的青海省西寧市湟中區(qū)野生中國沙棘根際土壤細(xì)菌中根際解磷菌菌種解有機(jī)磷和解無機(jī)磷活性相對較低，解磷能力比較弱。

造成以上結(jié)論的原因是：(1)研究方法的局限性。通常利用有無解磷圈菌圈和大小作為判定解磷微生物是否具有解磷能力的指標(biāo)，但是此方法不是對全部的解磷微生物解磷能力檢測都有成效。由于微生物對難溶性磷存在特異性、非特異性及選擇性，降解難溶解磷的種類以及數(shù)量受微生物本身和培養(yǎng)環(huán)境條件的影響。Shekhar等[27]研究表明，以解磷圈來判定菌株是否具有解磷能力及能力大小作為指標(biāo)是不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)摹１狙芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，如待測菌株的解磷圈大小結(jié)果都相對較好，但是其在液體培養(yǎng)上的解磷能力檢測卻表現(xiàn)很差，解磷效果不好或幾乎沒有解磷效果。因此，僅僅通過解磷圈的有無和大小來判定菌株解磷能力的大小的方法是片面的，本研究結(jié)合解磷菌液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果，通過比較菌上清液可溶性磷含量檢測結(jié)果，來確定菌株是否具有解磷能力，這種方法是科學(xué)有效的。(2)實驗材料及采樣地環(huán)境因素。由于根際促生菌具有選擇差異性，此研究采樣進(jìn)行研究的樹種不同，會造成與其他研究的結(jié)果差異，同時采樣地環(huán)境因素(土壤濕度、土壤溫度、土壤酸堿度、氣溫、海拔和空氣氧含量等)也會造成結(jié)果的不同[16，28，29]。通過對以上因素的綜合分析可見，要在野生中國沙棘根際土壤中篩選出高效解磷菌，有必要從溫度適宜、土壤肥沃的環(huán)境中進(jìn)行采樣，研究方法也有必要進(jìn)行不斷優(yōu)化，使研究結(jié)論的獲得更加科學(xué)有效。