長(zhǎng)鏈非編碼RNA DBH-AS1通過(guò)下調(diào)AKT1表達(dá)抑制胰腺癌進(jìn)展

李慧芬，程文英，陶元平，楊 樂(lè)，歐陽(yáng)柳，李小玲，汪珍光，曹晶珠

1. 海軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院肝外三科，上海 200433 2. 中國(guó)人民解放軍92493部隊(duì)醫(yī)院內(nèi)三科，葫蘆島 125003 3. 海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外三科，上海 200433 4. 海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200433

中國(guó)人群中胰腺癌發(fā)病率正逐年上升，2019年新發(fā)病例約占全世界總病例數(shù)的20%［1-2］。目前，手術(shù)切除和化療是胰腺癌的主要治療策略［3］。在過(guò)去的幾十年中，胰腺癌患者的總體生存時(shí)間未得到明顯改善，患者5年生存率仍低于5%［4-5］。因此，深入了解胰腺癌發(fā)生與進(jìn)展的詳細(xì)分子機(jī)制至關(guān)重要。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究證明，長(zhǎng)鏈非編碼RNAs（lncRNAs）是細(xì)胞正常生理和病理過(guò)程中的重要調(diào)控因子［6］。多種lncRNAs已被證實(shí)在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)或抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力［7-9］。本研究旨在檢測(cè)lncRNA DBH-AS1在胰腺癌中的表達(dá)情況，探討DBH-AS1在胰腺癌進(jìn)展中潛在的分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究樣本 選擇2015年7月至2017年12月海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外三科收治的原發(fā)胰腺癌患者45例，收集患者經(jīng)手術(shù)切除的胰腺癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織（距離腫瘤組織邊緣至少大于2 cm）。所有樣本離體后于液氮保存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。所有組織樣本均經(jīng)病理證實(shí)為胰腺癌。本研究經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2017-148-06），所有患者均知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要材料及試劑 本研究所用細(xì)胞均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。LncRNA DBH-AS1干擾慢病毒和空白（陰性）對(duì)照均購(gòu)自上海吉瑪基因。CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天。Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司。AKT1、p-mTOR、mTOR以及β-actin抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和病毒轉(zhuǎn)染 正常永生化人胰腺上皮細(xì)胞株（HPDE6C7）和4株人胰腺癌細(xì)胞株（CFPAC-1、Mia-capa2、L3.6pl和PANC1）均用添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。依照病毒試劑轉(zhuǎn)染說(shuō)明，構(gòu)建敲低DBH-AS1的胰腺癌細(xì)胞株。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR） TRIzol法提取組織和細(xì)胞的總RNA，用Nanodrop 2000測(cè)定RNA濃度并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用ViiATM 7實(shí)時(shí)qRT-PCR系統(tǒng)（美國(guó)Applied Biosystems公司）進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系為10 μL，包括2×SYBR Premix ExTaqTM試 劑5 μL、ROX校 正 染 料Ⅱ 0.2 μL、上游和下游引物各0.4 μL、cDNA模板 2 μL、雙蒸水2 μL。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因，應(yīng)用2－ΔΔCT法計(jì)算DBH-AS1和AKT1基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 細(xì)胞增殖 將細(xì)胞接種于96孔板，加入CCK-8溶液采用酶標(biāo)儀分別在0 h、24 h、48 h和72 h測(cè)定450 nm波長(zhǎng)的光密度值。

1.6 克隆形成 將各組處理細(xì)胞消化計(jì)數(shù)并分別接種在6孔板中，于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，棄去上清，PBS清洗后用4%多聚甲醛固定，隨后結(jié)晶紫染色，采用Image J軟件進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)。

1.7 侵襲和遷移 將細(xì)胞密度調(diào)整至1.5×104個(gè)/mL，取100 μL細(xì)胞懸液加入鋪有稀釋的基質(zhì)膠的transwell小室的上室，將加有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基加入下室，孵育24 h，底部細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色后，顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)在上室中不添加基質(zhì)膠，其余同前。

1.8 Western印跡 用RIPA緩沖液進(jìn)行細(xì)胞和組織裂解提取蛋白質(zhì)，提取過(guò)程保持低溫，用碧云天BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，用5×loading buffer和PBS調(diào)整蛋白濃度并加熱變性。用10% SDS-PAGE凝膠電泳分離，然后將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜，在4℃條件下一抗孵育過(guò)夜（AKT1、p-mTOR、mTOR以 及Actin），洗 膜 后室溫下二抗孵育2 h，洗滌，顯影。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料均以±s表示，所有實(shí)驗(yàn)均至少完成3次以上生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。2組組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。計(jì)數(shù)資料以n(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier生存曲線比較DBH-AS1表達(dá)量與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。采用Pearson相關(guān)分析檢測(cè)兩變量之間的相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）為0.05。

2 結(jié)果

2.1 DBH-AS1在胰腺癌組織中的表達(dá)情況 在線數(shù)據(jù)庫(kù)GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,http://gepia.cancer-pku.cn/）結(jié)果顯示（圖1A），lncRNA DBH-AS1在胰腺癌腫瘤組織的表達(dá)明顯低于癌旁組織，差異倍數(shù)＞2（P＜0.05）。應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)lncRNA DBH-AS1在45例胰腺癌患者腫瘤組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況，結(jié)果（圖1B）顯示：DBH-AS1在胰腺癌組織中的表達(dá)水平低于對(duì)應(yīng)的癌旁組織（0.0372±0.0032vs0.0792±0.0070），差異倍數(shù)＞2（P＜0.01）。結(jié)果（圖1C）顯示：與正常胰腺細(xì)胞系（HPDE6C7）相比，DBH-AS1在胰腺癌細(xì)胞系（Mia-capa2、CFPAC-1、L3.6pl和PANC1）中的表達(dá)水平也下調(diào)，差異倍數(shù)＞2（P＜0.001）。

圖1 DBH-AS1在胰腺癌腫瘤組織和胰腺癌細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)A：GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中胰腺癌組織和正常胰腺組織中DBH-AS1的表達(dá)水平；B：qRT-PCR分析胰腺癌腫瘤組織和胰腺癌旁組織中DBH-AS1的表達(dá)水平（n＝451）；C：qRT-PCR分析正常胰腺細(xì)胞系（HPDE6C7）和胰腺癌細(xì)胞（CFPAC-1、Mia-capa2、L3.6pl和PANC1）中DBH-AS1的表達(dá)水平。每組3個(gè)重復(fù)孔，*P＜0.05，***P＜0.001。

2.2 DBH-AS1在胰腺癌腫瘤組織中的表達(dá)水平與患者惡性臨床特征的相關(guān)性 根據(jù)lncRNA DBH-AS1在胰腺癌患者腫瘤組織中的中位表達(dá)量（0.0380），將45例患者分為DBH-AS1低表達(dá)組 （n＝23）和DBH-AS1高表達(dá)組（n＝22）。結(jié)果（表2）顯示，DBH-AS1在胰腺癌組織中的低表達(dá)與腫瘤分化（P＝0.038）、TNM分期（P＝0.029）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＝0.006）相關(guān)。

表2 lncRNA DBH-AS1表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床特征的關(guān)系n(%)

2.3 DBH-AS1在胰腺癌患者腫瘤組織中表達(dá)水平與患者預(yù)后的相關(guān)性 以DBH-AS1在胰腺癌組織中表達(dá)水平的中位數(shù)為分界線，將176例胰腺癌患者分為DBH-AS1高表達(dá)組（n＝88）和DBH-AS1低表達(dá)組（n＝88）。結(jié)果（圖2）顯示，與胰腺癌腫瘤組織DBH-AS1高表達(dá)組患者相比，DBH-AS1低表達(dá)組患者的無(wú)瘤生存率（P＝0.013）和總體生存率（P＝0.009）較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 數(shù)據(jù)庫(kù)中DBH-AS1在胰腺癌腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)與患者預(yù)后較差相關(guān)

2.4 敲低DBH-AS1對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖能力和克隆形成能力的影響 構(gòu)建敲低DBH-AS1慢病毒，轉(zhuǎn)染至DBH-AS1表達(dá)相對(duì)較高的2株胰腺癌細(xì)胞系（Mia-capa2和PANC1）中。結(jié)果（圖3A）顯示，轉(zhuǎn)染敲低DBH-AS1慢病毒后，Mia-capa2細(xì)胞中DBH-AS1的表達(dá)水平比對(duì)照組下降約6倍 （P＜0.001），PANC1細(xì) 胞 中DBH-AS1的 表 達(dá)水平較對(duì)照組下降約8倍（P＜0.001）。CCK-8檢測(cè)結(jié)果（圖3B、3C）顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染敲低DBH-AS1慢病毒后，Mia-capa2和PANC1細(xì)胞的增殖能力分別在48 h和72 h后提高（P＜ 0.05）。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3D～3E）顯示，干擾DBH-AS1表達(dá)后Mia-capa2和PANC1細(xì)胞的克隆形成能力較對(duì)照組顯著增強(qiáng)（Mia-capa2：207±11.55vs86.0±2.309，P＜0.001；PANC1：228.7±14.53vs84.0±2.887，P＜0.001）。

圖3 敲低DBH-AS1表達(dá)可增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞增殖和克隆形成能力A：qRT-PCR檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染前后DBH-AS1的表達(dá)水平；B,C：CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染si-NC或si-DBH-AS1后PANC1 （B）和Mia-capa2 （C）細(xì)胞增殖情況；D：集落形成法檢測(cè)轉(zhuǎn)染si-NC或si-DBH-AS1對(duì)Mia-capa2和PANC1細(xì)胞克隆形成能力的影響。每組3個(gè)重復(fù)孔，*P＜0.05，***P＜0.001。

2.5 遷移和侵襲 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4A）顯 示，干 擾DBH-AS1表 達(dá) 后，Mia-capa2和PANC1細(xì)胞的遷移能力較對(duì)照組增強(qiáng)（Miacapa2：222.7±2.603vs131.3±3.528，P＜0.001；PANC1：113.7±0.882vs88.3±0.333，P＜0.001）。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4B）顯示，Mia-capa2和PANC1細(xì)胞的侵襲能力較對(duì)照組顯著增強(qiáng)（Mia-capa2：241.7±2.333vs111.3±1.202，P＜0.01；PANC1： 73.3±1.333vs60.0±1.732，P＜0.001）。

圖4 敲低DBH-AS1表達(dá)可增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞遷移（A）和侵襲能力（B）Original magnification:×100; 每組3個(gè)重復(fù)孔，**P＜0.01，***P＜0.001。

2.6 DBH-AS1調(diào) 控AKT1/mTOR信 號(hào) 通 路 在 線 數(shù) 據(jù) 庫(kù)GEPIA結(jié)果（圖5A）顯 示，lncRNA DBH-AS1在胰腺癌腫瘤組織中的表達(dá)水平與AKT1 mRNA的表達(dá)水平負(fù)相關(guān)（r＝－0.18，P＝ 0.016）。qRT-PCR結(jié)果（圖5B）顯 示，干 擾DBH-AS1表 達(dá) 后，Mia-capa2細(xì) 胞 和PANC1細(xì)胞的AKT1 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組顯著提高（Mia-capa2：4.057±0.180vs1.000±0.505，P＜0.001；PANC1：5.425±0.896vs1.000±0.706，P＜0.001）。Western印跡結(jié)果（圖5C、5D）表明，干擾DBH-AS1表達(dá)后Mia-capa2和PANC1細(xì)胞的AKT1蛋白（Mia-capa2：2.541±0.182vs1.000±0.121，P＜0.001；PANC1：2.392±0.252vs1.000±0.243，P＜0.001）和p-mTOR/mTOR蛋白（Mia-capa2：2.023±0.102vs1.000±0.289；PANC1：2.171±0.153vs1.000±0.228，P＜0.001）表達(dá)水平較對(duì)照組顯著提高。

圖5 LncRNA DBH-AS1通過(guò)調(diào)控AKT1表達(dá)抑制mTOR信號(hào)通路A：利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)GEPIA數(shù)據(jù)分析lncRNA DBH-AS1在胰腺癌腫瘤組織中的表達(dá)水平與AKT1 mRNA的表達(dá)水平的相關(guān)性；B：qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染si-NC或si-DBH-AS1后Mia-capa2和PANC1細(xì)胞中AKT1 mRNA的表達(dá)水平；C,D：Western 印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染si-NC或si-DBH-AS1后，Mia-capa2和PANC1細(xì)胞AKT1/mTOR通路分子的蛋白表達(dá)水平。***P＜0.001。

3 討論

目前，已有大量lncRNAs被證實(shí)參與胰腺癌的發(fā)生與進(jìn)展。例如，胰腺導(dǎo)管腺癌中l(wèi)ncRNA PANDAR表達(dá)異常上調(diào)，并且與胰腺癌腫瘤血管侵犯密切相關(guān)［10］。另有研究［11］發(fā)現(xiàn)，lncRNA LOXL1-AS1在胰腺癌腫瘤組織和胰腺癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，且LOXL1-AS1通過(guò)吸附miR-28-5p上調(diào)SEMA7A表達(dá)，促進(jìn)胰腺癌進(jìn)展。

此外，最新研究［12］表明，lncRNA XLOC通過(guò)與c-Myc結(jié)合并增強(qiáng)其蛋白穩(wěn)定性，從而促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生和谷氨酸代謝。LncRNA DBH-AS1從染色體9q34轉(zhuǎn)錄而來(lái)，既往研究發(fā)現(xiàn)DBH-AS1在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)并發(fā)揮重要的癌基因作用，例如肝癌［13］、非小細(xì)胞肺癌［14］、骨肉瘤［15］及彌 漫 大B細(xì)胞淋巴瘤［16］等。但是，lncRNA DBH-AS1在胰腺癌發(fā)病中的作用機(jī)制仍然尚未完全清楚。

本研究結(jié)合在線數(shù)據(jù)庫(kù)GEPIA以及qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lncRNA DBH-AS1在胰腺癌腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，同時(shí)qRT-PCR結(jié)果也表明DBH-AS1在胰腺癌細(xì)胞系中均表達(dá)下調(diào)。利用隊(duì)列樣本發(fā)現(xiàn)，lncRNA DBH-AS1在胰腺癌中的低表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而生存分析結(jié)果提示胰腺癌腫瘤組織中DBH-AS1低表達(dá)的患者預(yù)后較差。通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染，進(jìn)一步研究敲低DBH-AS1對(duì)胰腺癌細(xì)胞功能的影響，結(jié)果顯示，敲低DBH-AS1可顯著促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、克隆形成和遷移侵襲能力。上述結(jié)果提示，lncRNA DBH-AS1在胰腺癌中具有抑癌作用。

為了進(jìn)一步探究相關(guān)機(jī)制，首先利用在線GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析，發(fā)現(xiàn)DBH-AS1與AKT1在胰腺癌腫瘤組織中的表達(dá)負(fù)相關(guān)，提示在胰腺癌中DBH-AS1可能下調(diào)AKT1表達(dá)；進(jìn)一步通過(guò)qRTPCR和Western印跡實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了敲低DBH-AS1的表達(dá)可上調(diào)AKT1 mRNA和蛋白水平，同時(shí)，敲低DBH-AS1表達(dá)可上調(diào)mTOR蛋白表達(dá)。以上結(jié)果提示，lncRNA DBH-AS1在胰腺癌中可抑制AKT1/mTOR信號(hào)通路。

本研究存在一定的局限性：（1）DBH-AS1的表達(dá)與胰腺癌患者的預(yù)后以及病理特征之間的關(guān)系需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量研究，以進(jìn)一步證實(shí)DBH-AS1在胰腺癌中作為預(yù)后標(biāo)志物的潛力；（2）本研究?jī)H探究了敲低DBH-AS1對(duì)胰腺癌細(xì)胞惡性表型的影響，而缺乏對(duì)過(guò)表達(dá)DBH-AS1后胰腺癌細(xì)胞惡性表型變化的研究；（3）需要進(jìn)一步通過(guò)補(bǔ)充體內(nèi)試驗(yàn)，驗(yàn)證DBH-AS1對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響；（4）DBH-AS1調(diào)控AKT1表達(dá)的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究，其是否通過(guò)作為內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）來(lái)調(diào)控AKT1有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)DBH-AS1在胰腺癌組織中表達(dá)下調(diào)與患者不良預(yù)后相關(guān)，敲低DBH-AS1可顯著促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、克隆形成和遷移侵襲能力。機(jī)制研究結(jié)果提示，DBH-AS1/AKT1/mTOR軸可能是胰腺癌進(jìn)展的關(guān)鍵信號(hào)通路。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。