磷限制條件下單胞藻胞內(nèi)磷儲量差異機理研究

魏曉雪，田 晨，馮劍豐,2，朱 琳*

1. 南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300350

2. 天津市跨介質(zhì)復(fù)合污染環(huán)境治理技術(shù)重點實驗室，天津 300350

營養(yǎng)鹽濃度過高是造成水體富營養(yǎng)化的必要因素，然而研究發(fā)現(xiàn)，有害藻華形成后，水環(huán)境中某種營養(yǎng)鹽濃度反而處于較低水平，并形成營養(yǎng)鹽限制狀態(tài). 以N/P(摩爾比，下同)為營養(yǎng)鹽限制判斷標(biāo)準(zhǔn)，其大于16∶1 時，藻類生長受磷限制. 研究表明，中國長江口、遼東灣、大鵬灣、渤海灣等水域N/P 范圍為17～490，浮游植物生長主要受磷限制. 磷是浮游植物生長和繁殖必需的營養(yǎng)元素，參與有機體的化學(xué)組成和物質(zhì)傳遞，也是導(dǎo)致有害藻華形成過程中，是否產(chǎn)生營養(yǎng)限制的重要因子. 在磷限制條件下，有害藻華生態(tài)系統(tǒng)中磷元素的能量流和物質(zhì)流同浮游植物體內(nèi)的組分存在供需動態(tài)平衡關(guān)系，藻細(xì)胞內(nèi)的不同組分在磷限制環(huán)境中具有高度可變性. 研究表明，微藻存在磷儲存現(xiàn)象，以應(yīng)對營養(yǎng)匱乏的環(huán)境條件，而不同種類藻的磷儲存能力存在顯著差異. 這種差異可能與藻的生長速率、營養(yǎng)鹽吸收、細(xì)胞形態(tài)等密切相關(guān)，并且可能與有害藻華的形成存在重要聯(lián)系.

近年對長江口鄰近海域大規(guī)模赤潮的研究表明，營養(yǎng)鹽濃度和構(gòu)成的變化是導(dǎo)致赤潮大規(guī)模暴發(fā)和有害藻華優(yōu)勢類群演替的重要原因. Ji 等通過分析赤潮異灣藻()藻華前后的差異表達基因發(fā)現(xiàn)，赤潮異灣藻對磷的快速吸收和對溶解性有機磷的有效利用可能促進藻華的形成. 已有研究表明，微藻可以根據(jù)水體中磷濃度的改變，調(diào)整胞內(nèi)磷儲量及其代謝過程，以優(yōu)化其細(xì)胞的生長.

利用Droop 模型，可以計算細(xì)胞內(nèi)磷的最小配額(, the minimal cell quota for P)，以量化表征海洋微藻細(xì)胞內(nèi)磷儲量，并且設(shè)定為磷限制的研究條件. 有研究表明，與最大生長速率和營養(yǎng)鹽最大吸收速率相比，最小胞內(nèi)配額更易影響Droop 模型的輸出結(jié)果，且對微藻生長影響較大. Baklouti 等利用以為基礎(chǔ)建立的浮游生物功能類型(PET,Plankton Functional Type)模型，從細(xì)胞內(nèi)磷配額的角度深入解釋了地中海西北部藻華的發(fā)生.

綜上，研究不同微藻細(xì)胞內(nèi)磷最小配額的差異，可以更好地了解有害藻華的形成過程. 因而，該文選擇硅藻門的三角褐指藻()和多列擬菱形藻()、定鞭藻門的球等鞭金藻()以及甲藻門的海洋原甲藻()等4 種海洋藻華代表性種類為研究對象，在磷限制條件下分析其細(xì)胞內(nèi)磷儲量與生長速率的關(guān)系及種間差異性，探究胞內(nèi)磷的最小配額與藻類性狀的關(guān)系，以期為后續(xù)深入研究藻類生長狀態(tài)與有害藻華形成機制提供支持.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用藻種三角褐指藻購自中國科學(xué)院海藻種質(zhì)庫，藻種編號MASCC17，分離自中國黃海海域；多列擬菱形藻購自中國科學(xué)院淡水藻種庫，藻種編號FACHB-2584，分離自臺灣海峽；球等鞭金藻和海洋原甲藻購自上海光語生物科技有限公司，分別分離自中國廈門和東海海域. 用人工海水和f/2 改良培養(yǎng)基培養(yǎng)至指數(shù)期后饑餓3 d 開始試驗，所有藻種均以1 000 mL 錐形玻璃瓶為培養(yǎng)容器，并將其置于光照培養(yǎng)箱(KRG-250BP，上海柏欣儀器設(shè)備廠)內(nèi)培養(yǎng)，溫度設(shè)為(20±1) ℃，光照強度為110 μmol/(m·s)，光暗比為12 h:12 h，每天搖動3～4 次，每天在同一時間取樣.

1.2 試驗設(shè)計

預(yù)試驗中設(shè)計N/P 為50:1、100:1、150:1、200:1，結(jié)果表明，當(dāng)N/P 為150:1 時Droop 模型能較好地擬合海洋微藻比生長速率和其胞內(nèi)磷含量之間的關(guān)系，因而后續(xù)試驗磷限制培養(yǎng)條件N/P 為150:1，即f/2改良培養(yǎng)基中NaNO濃度為75 mg/.L，NaHPO·HO濃度為0.811 mg/.L，其他營養(yǎng)元素濃度不變.

該研究采用光密度法測定并計算微藻干質(zhì)量，以計算比生長速率()；利用Droop 模型計算胞內(nèi)磷的最小配額(). 試驗采用批次培養(yǎng)的方式，分兩個批次進行.

a) 第一批次：確定光密度曲線. 4 種微藻的接種密度均為1×10cells/mL. 以正常f/2 改良培養(yǎng)基培養(yǎng)，每組設(shè)3 個平行. 每日取100 mL 搖勻后的藻液(三角褐指藻、多列擬菱形藻和球等鞭金藻，共計8 d，海洋原甲藻共計10 d)，用0.22 μm 醋酸纖維膜過濾，濾得藻樣品經(jīng)真空冷凍干燥后在恒溫干燥器中放至恒重并稱量；同時用UV755B 紫外分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)測定藻液在680 nm(預(yù)試驗結(jié)果表明該波長下微藻光密度曲線線性最佳，其＞0.9，＜0.01)下的吸光度，繪制藻液干質(zhì)量(Mass)-吸光度(Abs)標(biāo)準(zhǔn)曲線.

b) 第二批次：確定Droop 模型參數(shù). 4 種海洋單胞藻的初始接種密度均為1×10cells/mL. 以磷限制條件(N/P=150:1)培養(yǎng)，每組設(shè)3 個平行. 每天取40 mL藻液在5 000下離心10 min(共計12 d)，棄去上清液，用去離子水洗滌并再次離心、棄去上清液，如此反復(fù)3 次. 所得樣品采用鉬酸鹽分光光度法測定其胞內(nèi)磷含量(均以正磷酸鹽計)，即加入4 mL 50 g/L 的過硫酸鉀后將其置于溫度為120 ℃、壓力為1.08×10Pa的高壓滅菌鍋(HVE-50，日本HIRAYAMA 公司)內(nèi)消解30 min，冷卻后加入鉬酸鹽等顯色劑，顏色穩(wěn)定后測定其在700 nm 下的吸光度. 用UV755B 紫外分光光度計測定過濾前藻液在680 nm 下的吸光度，并用顯微鏡(HFX，日本Nikon 公司)和圖像分析系統(tǒng)觀察藻類生長狀態(tài)，測定細(xì)胞長()、寬().

1.3 光密度曲線與Droop 模型

a) 第一批次試驗結(jié)果. 三角褐指藻(Pt)、多列擬菱形藻(Pnm)、球等鞭金藻(Ig)、海洋原甲藻(Pm)的光密度曲線擬合結(jié)果分別為Mass=476.53×Abs、

Mass=851.23×Abs、 Mass=363.29×Abs、 Mass=1 232.84×Abs，其相關(guān)性系數(shù)均大于0.95，表明這4 種單胞藻樣品干質(zhì)量與吸光度均為顯著線性相關(guān)，所得光密度曲線可用于磷限制條件下藻類比生長速率計算，其計算公式：

式中：為藻類比生長速率，d；為某一時間間隔終結(jié)時的藻類生物量，μg/mL；為某一時間間隔開始時的藻類生物量，μg/mL；—為某一時間間隔，即1 d.

b) 第二批次試驗結(jié)果. 用Droop 模型作-1/線性分析，得到線性回歸方程.

式中：為藻類最大比生長速率，d；為胞內(nèi)磷的最小配額，μg/g；為微藻胞內(nèi)磷含量(以干質(zhì)量計)，μg/mg.

從式(2)可知，該回歸方程在軸的截距為藻細(xì)胞生長所能達到的最大比生長速率()，回歸系數(shù)為與乘積的負(fù)值，由此可知磷限制條件下4種藻的和.

1.4 細(xì)胞體積

根據(jù)Hillebrand 等方法，假設(shè)三角褐指藻、球等鞭金藻、海洋原甲藻的相似幾何形狀分別為橢圓底棱鏡、球形、橢圓體，以此計算細(xì)胞體積，計算公式：

式中：、、分別為三角褐指藻、球等鞭金藻、海洋原甲藻的細(xì)胞體積，μm；為藻細(xì)胞長度，μm；為藻細(xì)胞寬度，μm；為三角褐指藻細(xì)胞中心寬度，μm；為三角褐指藻細(xì)胞最小寬度，μm；為海洋原甲藻高度，μm.

多列擬菱形藻的細(xì)胞體積計算公式根據(jù)Hillebrand 等和Lundholm 等的描述修改為

式中：為多列擬菱形藻的細(xì)胞體積，μm；為藻細(xì)胞長度，μm；為藻細(xì)胞寬度，μm.

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Pearson 相關(guān)性分析，4 種微藻與、與藻細(xì)胞體積的關(guān)系. 采用線性回歸分析(linear regression analysis)構(gòu)建上述指標(biāo)之間的線性回歸方程. 在線性回歸分析前，對和藻細(xì)胞體積進行對數(shù)轉(zhuǎn)換，與不做對數(shù)轉(zhuǎn)換.

2 結(jié)果與討論

2.1 藻類胞內(nèi)磷含量隨時間的變化

如圖1 所示，4 種藻的隨時間均呈先升后降的趨勢. 三角褐指藻在第2 天達(3.02±0.08) μg/mg，增加了18.43%，隨后迅速下降；多列擬菱形藻和球等鞭金藻的在第3 天分別增至(4.20±0.06)和(5.37±0.25) μg/mg，分別增加了117.62%和25.17%；其中球等鞭金藻在第4 天降至(4.88±0.23) μg/mg，而后迅速下降，多列擬菱形藻在第4 天逐漸降低；海洋原甲藻在10 d 內(nèi)逐漸增至(100.70±4.99) μg/mg 且呈S 型生長趨勢，增加了319.06%，而后迅速降低. 不同微藻隨時間變化的差異可能與其生物量隨時間變化不同有關(guān).

圖 1 磷限制條件下不同海洋微藻胞內(nèi)磷含量(Q)隨時間的變化Fig.1 Temporal variation of phosphorus content in different marine microalgae (Q) under phosphorus limitation

由圖2 可知，三角褐指藻和球等鞭金藻的生長趨勢呈近S 型，其最大生物量分別為196.01 和126.97 μg/mL，三角褐指藻和球等鞭金藻的生物量分別增加了28 和32 倍；多列擬菱形藻和海洋原甲藻的生物量隨時間逐漸增加，分別增加了6 和3 倍，其最大生物量分別為129.10 和44.79 μg/mL.

圖 2 磷限制條件下不同海洋微藻生物量隨時間的變化Fig.2 Temporal variation in the biomass of different marine microalgae under phosphorus limitation

易文利等研究發(fā)現(xiàn)，磷限制條件下處于饑餓狀態(tài)的微藻會快速吸收并儲備磷，但細(xì)胞內(nèi)磷含量會隨微藻的生長而逐漸降低；這可能是該試驗中微藻出現(xiàn)先升后降的原因. 與其余3 種微藻相比，海洋原甲藻生長緩慢，其生物量較低(見圖2)，對外部磷需求量較小，這可能導(dǎo)致海洋原甲藻胞內(nèi)磷增長時間較長. 與其余3 種微藻相比，海洋原甲藻的對磷限制響應(yīng)不明顯，可能與其胞內(nèi)磷儲量較大，對磷脅迫耐受力較強有關(guān). 研究表明，藻細(xì)胞的磷儲存能力與其對磷脅迫的耐受能力相關(guān)，并且不同微藻磷儲存能力的差異對種群的競爭能力具有重要作用. 該文研究結(jié)果與野外調(diào)查結(jié)果類似，如中國東海長江口和舟山海域連續(xù)3 年赤潮的監(jiān)測結(jié)果表明，在磷限制條件下，甲藻門具有比其他門類更強的種間競爭力，這對解釋藻華的誘發(fā)和維持具有重要意義.

2.2 不同藻類Qmin 與μmax 的差異分析

磷限制條件下，4 種微藻的-1/線性曲線如圖3 所示. 4 種微藻的與呈正相關(guān). Droop 模型認(rèn)為藻細(xì)胞的生長速率與細(xì)胞配額有關(guān)，并且適用于硝酸鹽、磷酸鹽和硅酸鹽等營養(yǎng)鹽限制條件，與該研究的結(jié)果一致. 海洋原甲藻樣品間平行性較差，可能與其個體較大、生長速率慢、生物量較小有關(guān).

圖 3 磷限制條件下不同海洋微藻的Droop 模型曲線Fig.3 Droop model of different marine microalgae under phosphorus limitation

磷限制條件下，4 種微藻1/曲線擬合結(jié)果、與(以干質(zhì)量計)如表1 所示. 由表1 可知，4種微藻的與1/顯著相關(guān)(＜0.01).和存在種間差異，即不同門間和差異明顯，同門不同種間和也存在較大差異. Sterner 等提出的生長速率假說認(rèn)為，細(xì)胞的生長速率對胞內(nèi)元素含量變化起決定性作用，即微藻的與1/存在相關(guān)性，與該研究的結(jié)果一致. 而不同藻種間與表現(xiàn)出的差異可能是因生物種類生長策略的不同，或不同微藻對環(huán)境變化生理響應(yīng)的差異.

表 1 磷限制條件下不同海洋微藻的主要試驗結(jié)果Table 1 Main experimental results of different marine microalgae under phosphorus limitation

浮游植物在不同營養(yǎng)鹽濃度中存在不同生理響應(yīng)策略. Kilham 等認(rèn)為微藻r-策略者具有較高的最大生長速率和死亡率，不能長時間維持種群的高密度；而k-策略者則具有較低的最大生長速率和死亡率，其將資源用于非增殖性活動中，如獲得并儲存資源、產(chǎn)生藻毒素、增大藻細(xì)胞體積和共生等，以保證個體的生存機會最大化. 研究表明，硅藻屬于r-策略者，具有較高的，吸收的營養(yǎng)物質(zhì)主要用于細(xì)胞增殖；海洋卡盾藻()、東海原甲藻()、鏈狀亞歷山大藻()等鞭毛藻多屬于k-策略者，其較低，對營養(yǎng)鹽限制環(huán)境具有較強的耐受能力；而這種生態(tài)策略的差異可能導(dǎo)致二者在赤潮發(fā)生過程中的種類演替. 該研究的海洋原甲藻屬于k-策略者，該藻個體較大，其主要將磷酸鹽用于非增殖性活動中，因而小且大. 而其他3 種藻因為個體小而將資源主要用于細(xì)胞分裂增殖，具有較高的，是典型的r-策略者. r-策略者在營養(yǎng)鹽較為充足時會迅速吸收資源用于生長，使其胞內(nèi)磷儲量較低，因而三角褐指藻與球等鞭金藻高而小. 但多列擬菱形藻與之相反，其生長速率較小而胞內(nèi)磷儲量較大，可能與Droop 模型對該藻細(xì)胞形狀的適用性較差有關(guān).

藻種間與出現(xiàn)差異的原因可能與藻細(xì)胞最適生長條件及其對各理化指標(biāo)的響應(yīng)有關(guān). 與相關(guān)研究比較可知，該研究試驗條件中除磷含量外，其他元素含量均滿足各藻種最適生長條件對應(yīng)含量.但N/P 均小于最適生長條件，使試驗藻種生長處于磷限制條件. 此外，與最適生長條件相比，三角褐指藻和球等鞭金藻的培養(yǎng)條件與其較為相近，海洋原甲藻與其相差較大.

此外，各藻種性質(zhì)的差異也可能是、不同的原因. 已有研究顯示：球等鞭金藻生長速率快，受環(huán)境影響較??；三角褐指藻和多列擬菱形藻生長速率均較快，且由于其外層的硅質(zhì)外殼，在自然界中生命力較強；海洋原甲藻個體較大，生長較緩慢. 因此，不同藻種間與出現(xiàn)較大差異.

近年來，中國近岸海域不斷爆發(fā)大規(guī)模有害藻華. 已有研究證明，長江口春夏季出現(xiàn)甲藻、硅藻藻華優(yōu)勢種演替的原因是二者不同的磷競爭能力. 不同藻種間和較大的差異可能是造成藻類具有不同磷競爭能力的原因，也可能是不同種類微藻伴生赤潮出現(xiàn)長時間持續(xù)的原因.

2.3 胞內(nèi)磷的最小配額Qmin 與藻種性狀差異的關(guān)系

在試驗過程中鏡檢4 種海洋微藻的細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，其與正常培養(yǎng)下的藻細(xì)胞均無明顯差異. 由此可知，磷限制不會導(dǎo)致4 種微藻形態(tài)發(fā)生明顯變化.

試驗所用海洋微藻在性狀方面差異較大，這些差異可能反映不同種的不同. 由表2 可知，在物理性狀方面，微藻體積表現(xiàn)為海洋原甲藻＞多列擬菱形藻＞三角褐指藻＞球等鞭金藻，表現(xiàn)為海洋原甲藻＞多列擬菱形藻＞球等鞭金藻＞三角褐指藻.Edwards 等研究表明，不同種類海洋微藻的隨藻體積的增加而增加，且的差異源于細(xì)胞體積的不同. 藻細(xì)胞體積越大，具有合成磷元素功能的細(xì)胞組件的可利用空間增加，因而其越大. 該研究(也包括Edwards 等的研究，即選取相同門類藻種的文獻數(shù)據(jù))分析表明，藻類細(xì)胞的與細(xì)胞體積呈顯著正相關(guān)(＜0.01，R=0.82)(見圖4).

表 2 不同海洋微藻的物理性質(zhì)指標(biāo)Table 2 The physical properties of different marine microalgae

圖 4 藻細(xì)胞體積與Qmin 的線性關(guān)系Fig.4 The linear regression results between Qmin and cell volume

在生長方面，由表1 可知，微藻表現(xiàn)為三角褐指藻＞球等鞭金藻＞多列擬菱形藻＞海洋原甲藻；而表現(xiàn)為海洋原甲藻＞多列擬菱形藻＞球等鞭金藻＞三角褐指藻. Edwards 等研究證明，海洋微藻的細(xì)胞體積與呈顯著負(fù)相關(guān)，而該試驗的藻細(xì)胞體積與呈顯著正相關(guān)；因而，該試驗微藻的和可能存在相關(guān)性，即較大的藻種其較小.這可能是微藻在磷限制條件下為了維持較高的生長速率，利用非磷膜脂(如硫脂)代替磷脂以降低細(xì)胞內(nèi)磷含量. Yamaguchi 等研究發(fā)現(xiàn)，在營養(yǎng)鹽濃度較低的環(huán)境中，卵圓卡盾藻()以較小的實現(xiàn)較高的細(xì)胞密度，可能是其成為日本瀨戶內(nèi)海有害藻華優(yōu)勢種的原因.

藻細(xì)胞的體積和生長速率等性狀影響其對營養(yǎng)鹽的吸收能力，而藻對營養(yǎng)鹽的吸收能力與有關(guān). 該研究結(jié)果也證明，藻細(xì)胞的體積、生長速率等性狀可能影響，門的差異可能對其影響較小.Edwards 等研究發(fā)現(xiàn)，微藻的不同主要源于藻體積的差異，藻門類的影響可忽略，與該研究的結(jié)果一致. 這說明是影響微藻種間競爭的因素和赤潮出現(xiàn)持續(xù)時間長短的原因之一.

3 結(jié)論

a) 磷限制條件下，三角褐指藻、多列擬菱形藻、球等鞭金藻和海洋原甲藻的值隨時間分別增加了18.43%、117.62%、25.17%和319.06%，而后減小，且不同藻種間的變化響應(yīng)時間存在差異，響應(yīng)程度也不同.

b) 4 種微藻的與均呈顯著正相關(guān). 不同浮游植物具有不同的生長策略，其對環(huán)境變化的不同生理響應(yīng)或各藻種性質(zhì)的差異可能造成和不同門間及同門不同種間的差異.

c) 4 種微藻的與藻體積均呈顯著正相關(guān)，其與可能存在一定的相關(guān)關(guān)系，即較大的藻種其較小.

d) 與藻體積、相比，門水平上的差異可能對影響較??；而的差異可能是造成海洋微藻具有不同磷競爭力的原因，因而在赤潮中出現(xiàn)不同微藻優(yōu)勢種演替的現(xiàn)象.