山西堡子酒大曲菌群結(jié)構(gòu)及多樣性分析

鄭同慶

（山西堡子酒業(yè)有限公司生產(chǎn)部，山西 晉中 030600）

釀酒大曲含有物種豐富的微生物菌群，在釀酒過程中作為微生物發(fā)酵劑使用［1］.這種微生物菌群可將釀酒原料分解成白酒中的前體風(fēng)味物質(zhì)，它們的結(jié)構(gòu)和數(shù)量直接決定著酒體的風(fēng)格和產(chǎn)品質(zhì)量［2］.對釀酒大曲中微生物菌群結(jié)構(gòu)進行解析，是了解釀酒過程中微生物作用的重要方法［3］［4］.分析釀酒大曲中優(yōu)勢菌群及其功能關(guān)系，對于釀造工藝的改進和產(chǎn)品質(zhì)量的提升具有重要的意義［5］.在微生物研究的早期，多采用分離培養(yǎng)法進行研究，這種方法所受限制頗多，得到的結(jié)果容易受多種因素影響，且操作繁瑣，所用時間較長，獲得的可培養(yǎng)微生物種類不足樣品中的1%，無法對其進行微生物結(jié)構(gòu)的解析［6］.近年來，基于DNA 分子標記技術(shù)在微生物菌群結(jié)構(gòu)的研究中得到了迅速的發(fā)展，特別是高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)與廣泛應(yīng)用，使其成為微生物研究領(lǐng)域的主要分析工具.高通量測序相比傳統(tǒng)實驗優(yōu)點突出，對于樣品中復(fù)雜的微生物菌群可輕松、實時、快速地進行測序讀取，測序結(jié)果更準確、更全面［7］.

關(guān)于酒曲的研究國內(nèi)多集中于研究酒曲中微生物組成結(jié)構(gòu)、酒曲理化性質(zhì)及對酒曲中功能菌群的分析.施安輝等對山東梁山徐坊大曲進行研究，得出大曲中細菌、酵母、霉菌在全部培養(yǎng)微生物中所占比重和優(yōu)勢菌種類存在差異［8］. 徐瑾等較不同理化條件下，得出樣品細菌群落PCR-DGGE 最優(yōu)分析條件，研究了樣品菌群構(gòu)成的動態(tài)變化規(guī)律［9］.雷震河對大曲和酒醅中的微生物構(gòu)成進行研究，得出大曲中優(yōu)勢細菌門包括厚壁細菌門、變形菌門等，優(yōu)勢真菌包括曲霉菌屬、熱子囊菌屬、根霉菌屬等［10］.曹苗文等對清香型白酒中功能型曲的應(yīng)用進行研究，發(fā)現(xiàn)在釀造過程中加入功能性曲，酒體中物質(zhì)成分發(fā)生極大改變［11］.目前在清香型大曲研究中，對釀造工藝的研究較多，而對清香大曲菌群結(jié)構(gòu)解析鮮有報道，采用高通量測序全面解析清香大曲細菌和真菌多樣性的研究未見報道.

本文以山西榆次堡子酒（清香型白酒）大曲為研究對象，對大曲中真菌、細菌的總DNA 進行了提取，通過高通量測序技術(shù)，全面解析大曲微生物菌群結(jié)構(gòu)，并對微生物功能基因進行預(yù)測. 本研究對全面了解堡子酒大曲微生物菌群結(jié)構(gòu)提供科學(xué)依據(jù)，對傳統(tǒng)白酒釀造改造升級具有廣泛的應(yīng)用前景.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究中的實驗材料（清香型堡子酒釀酒大曲）采自山西堡子酒業(yè)有限公司.

取樣方法：取酒廠粉碎后貯存期為7 天的堡子酒大曲，隨機抽取酒曲袋，取袋中上部、中部、下部酒曲混合，編號為DQ.

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA 提取及高通量測序

取采集到的樣品釀酒大曲10 g，迅速密封于無菌袋中，-20 ℃保存?zhèn)溆?

對樣品進行預(yù)處理后，使用E.Z.N.ATM Mag-Bind DNA Kit（OMEGA）試劑盒進行基因組DNA 的提取. 對得到的樣品DNA 進行擴增，PCR擴增所用引物見表1.對經(jīng)過擴增的產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測文庫大小，檢測合格后的擴增產(chǎn)物送到測序公司（上海生工）進行高通量測序.

表1 16S PCR 與ITS PCR 引物

1.2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采 用R 3.6.0、Fasttree 2.1.7、Python 2.7.3、PICRUSt 1.1.4、FUNGuild 1.0 等軟件，對高通量測序結(jié)果進行處理與分析.本文使用RDP 16S 數(shù)據(jù)庫、Unite 數(shù)據(jù)庫等.

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測序結(jié)果預(yù)處理

數(shù)據(jù)預(yù)處理：首先需將得到的雙端測序數(shù)據(jù)拼接成一條完整的序列，并對所有樣品的原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量過濾，以獲得有效標簽.主要包括以下步驟：去除引物接頭，進行拼接、過濾，得到高質(zhì)量的序列數(shù)據(jù).

表2 為樣品測序的雙端序列經(jīng)過拼接得到的原始序列信息和經(jīng)過濾后的序列信息.對比可以看出，樣品原始序列經(jīng)過濾后，有效序列數(shù)得到降低；最短序列長度和最長序列長度發(fā)生變化，說明異常長度的序列被去除；同時平均序列長度發(fā)生改變，過濾后的平均序列長度與測序目的片段的長度范圍更接近，提高了后續(xù)處理結(jié)果的準確性.

表2 樣品序列數(shù)據(jù)信息統(tǒng)計

2.2 樣品測序結(jié)果分析

2.2.1 OTU 統(tǒng)計

將質(zhì)控后的序列以97%的相似度閾值聚類為操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU），獲得OTUs 序列數(shù)信息. 樣本16S 測序獲得的OTUs 序列數(shù)為57 402 條，ITS 測序獲得的OTUs 序列數(shù)為70 631 條；對16S 測序結(jié)果進行聚類得到126 個OTUs，對ITS 測序結(jié)果進行聚類得到48 個OTUs.

2.2.2 微生物物種注釋及分類學(xué)分析

使用QIIME 和SILVA 數(shù)據(jù)庫對OTUs 的代表性序列進行物種注釋和分析，以獲得各分類水平上的類群信息（由于16S 和ITS 的高通量測序?qū)τ谟H緣關(guān)系較近的種分辨率不高，部分微生物在種水平未被分辨出，故種水平的物種信息未列出）.通過統(tǒng)計大曲樣品的群落組成，得出細菌類群共獲得了11 門、20 綱、33 目、71 科、103 屬；真菌類群共獲得了5 門、11 綱、21 目、35 科、54 屬.無論在哪個分類水平，得到的細菌數(shù)量均多于真菌，表明細菌在各水平的數(shù)量分布均高于真菌，大曲中細菌菌群的多樣性高于真菌菌群.

2.3 微生物群落多樣性分析

2.3.1 Alpha 多樣性指數(shù)分析

通過評估Alpha 多樣性指數(shù)，可以表征微生物群落的多樣性、豐富度和均勻程度.在97%相似度水平下，樣品Alpha 多樣性指數(shù)值如表3 所示.依據(jù)表3 對樣品的幾種指標進行分析對比，來分析樣品的復(fù)雜程度.與真菌相比，大曲中細菌的ACE、Chao 和Shannon 指數(shù)均較高，且Simpson 指數(shù)較低，表明細菌類群中物種的數(shù)量較多，細菌菌群豐富度大于真菌菌群，提示細菌可能在釀酒過程中發(fā)揮著重要的作用；樣品中細菌和真菌的Coverage 值均在0.99 以上，說明樣本中序列被測出的概率較高，樣本文庫的覆蓋率較高，反映出本次測序結(jié)果能夠代表樣品中菌群的真實情況.

表3 Alpha 多樣性指數(shù)統(tǒng)計

2.3.2 稀釋性曲線特征分析

采用對測序序列進行隨機抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表的OTU 數(shù)目構(gòu)建稀疏性曲線.圖1 為所構(gòu)建的持續(xù)抽樣下新OTUs 出現(xiàn)的稀疏性曲線：起初，曲線隨測序條數(shù)的增多而急劇升高，表明樣品中出現(xiàn)了大量的物種；隨后稀疏性曲線趨于平坦，則表示測序數(shù)據(jù)接近飽和，說明所取樣品量足以覆蓋所有細菌和真菌；且圖1（a）曲線平緩后的高度較圖1（b）高，進一步說明樣品中細菌豐富度較真菌高.

圖1 樣品稀釋曲線

2.4 物種組成分析

2.4.1 門水平物種組成分析

對樣本在門水平進行物種多樣性組成分析可知，大曲樣本細菌在門水平主要有五大門類：變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、藍細菌門（Cyanobacteria_Chloroplast）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）. 清香型白酒大曲中細菌在門水平上還存在所占一定比例的未分類菌群和其他菌群（占比小于1 %）. 其中變形菌門占43.8%、厚壁菌門占37.3 %和藍細菌門占13.5%為細菌門類的優(yōu)勢菌群.清香型白酒大曲真菌在門水平主要有三大門類：子囊菌門（Ascomycota）、毛霉菌門（Mucoromycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）. 其中子囊菌門在真菌中占絕對優(yōu)勢，占總豐度的99.1%.與真菌群落相比，堡子酒大曲中的細菌在門類水平上的菌群數(shù)量更為豐富，且各細菌門之間的相對豐度比例相差較小；而真菌群落中的各門類所占比重相差較大，主要以子囊菌門占主導(dǎo).對比張雙燕［12］關(guān)于清香型大曲微生物組成的研究，樣品大曲中菌群種類組成與其所用大曲相似，但各個菌群所占比重存在差異.

2.4.2 屬水平物種組成分析

對樣本在屬水平進行物種多樣性組成分析可知，清香型白酒大曲細菌在屬水平的菌群分布主要包括：泛菌屬（Pantoea）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、鏈霉菌屬（Streptophyta）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、片球菌屬（Pediococcus）、短桿菌屬（Brevibacterium）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、根瘤菌屬（Rhizobium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、黃桿菌屬（Chryseobacterium）、鹽單胞菌屬（Halomonas）等，未分類的菌群和其他菌群豐度占總菌群的17.7%.其中泛菌屬、乳酸桿菌屬、鏈霉菌屬為細菌屬水平的優(yōu)勢菌屬，分別占35.4%、17.5%和13.5%；乳酸菌能夠產(chǎn)生乳酸等白酒風(fēng)味的前體物質(zhì)和影響發(fā)酵環(huán)境，作為優(yōu)勢菌群具有重要作用，其在大曲中的含量決定著大曲的質(zhì)量［13］.乳酸可減少酒體刺激、延長白酒后味，在清香型白酒入口綿柔中得到體現(xiàn)，但乳酸含量過多會使口感酸澀，嚴重影響白酒風(fēng)味［14］［15］.

清香型白酒大曲真菌在屬水平的菌群分布：有孢圓酵母屬（Torulaspora）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、畢赤酵母（Pichia）、生絲畢赤酵母屬（Hyphopichia）、根霉屬（Rhizopus）、雙足囊菌屬（Dipodascus）、曲霉（Aspergillus）、橫梗霉屬（Lichtheimia）、念珠菌（Candida）、酵母菌（Saccharomyces）、絲孢酵母屬（Trichosporon）等，其他菌群豐度占總菌群的0.7 %.真菌在屬水平不存在未得到分類注釋的菌群.其中孢圓酵母屬、伊薩酵母屬、畢赤酵母為真菌屬水平的優(yōu)勢菌屬，分別占52.6%、33.5%和9.7%，孢圓酵母屬在真菌菌群屬水平占有絕對優(yōu)勢.從真菌屬水平菌群結(jié)構(gòu)上看，大多菌屬為酵母菌、根霉和曲霉等，其中酵母菌發(fā)酵能力較強，根霉和曲霉系主要糖化菌，可為釀造過程提供發(fā)酵動力［16］［17］，這些真菌在提高高粱的利用率和白酒出酒率方面具有重要的作用.

2.5 微生物功能基因預(yù)測分析

2.5.1 細菌功能基因預(yù)測

PICRUSt 是一種利用16S rDNA 預(yù)測功能基因組成及含量的生物信息學(xué)工具，其能夠更好地分析樣本的功能信息. 在COG（Clusters of Orthologous Groups，直系同源簇數(shù)據(jù)庫）功能數(shù)據(jù)庫進行預(yù)測，得出預(yù)測結(jié)果.

從樣品細菌中注釋到了4 167 個COG，如表4，這些COG 存在23 個功能類別中.其中氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝、碳水化合物運輸和代謝、轉(zhuǎn)錄、一般功能預(yù)測在樣品中均高表達，而RNA 的加工與修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動力學(xué)、真核細胞的細胞外結(jié)構(gòu)、核外結(jié)構(gòu)、細胞骨架的表達則相對較低.細菌中氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝、碳水化合物運輸和代謝的高表達，究其原因可能與清香型堡子酒大曲制作工藝有關(guān)，堡子酒大曲以大麥、豌豆等為主要原料，釀造過程中需微生物進行發(fā)酵分解［18］［19］.

表4 COG 二級分類功能預(yù)測結(jié)果

2.5.2 真菌功能基因預(yù)測

采用FUNGuild 預(yù)測清香型白酒大曲樣品真菌群落的營養(yǎng)型和功能群，預(yù)測結(jié)果如表5.樣品大曲被鑒定出三種營養(yǎng)型，分別為病理營養(yǎng)型（Pathotroph）、腐生營養(yǎng)型（Saprotroph）以及共生營養(yǎng)型（Symbiotroph），占比分別為34.2%、17.7%、14.3%，其余為FUNGuild 暫不可鑒別的功能群. 從營養(yǎng)型來說，樣品中真菌以病理營養(yǎng)型為主，占比顯著高于腐生營養(yǎng)型和共生營養(yǎng)型，反映出清香型白酒大曲有利于病理營養(yǎng)型真菌的生長.樣品大曲共有6 個功能群從真菌中鑒定出來，分別為動物病原 菌（Animal Pathogen）、 植 物 病 原 菌（Plant Pathogen）、未定義腐生真菌（Undefined Saprotroph）、土壤腐生真菌（Soil Saprotroph）、動物內(nèi)生真菌（Animal Endosymbiont）、內(nèi)生真菌Endophyte），其中動物病原菌和未定義腐生真菌在樣本大曲中活性較高.樣品中未被鑒別出的真菌占比38.3%，可見清香型白酒大曲真菌的功能存在一定的復(fù)雜性，對此部分真菌仍待深入研究.

表5 真菌功能分類

3 結(jié)論

本研究通過高通量測序技術(shù)分析了清香型白酒大曲微生物的菌群特征，闡明了樣品大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)，并對微生物進行了功能基因預(yù)測.通過測序?qū)Υ笄鷺悠愤M行分析，得出大曲中細菌和真菌在各水平的菌群分布情況存在差異性，細菌豐富度和均勻程度較真菌高；對樣品進行物種組成分析，得出在門水平細菌中變形菌門、厚壁菌門和藍細菌門為細菌門類的優(yōu)勢菌群，占比為43.8 %、37.7%、13.5%.

真菌中子囊菌門為門水平絕對優(yōu)勢菌群，占比為99.1%.在屬水平中泛菌屬、乳酸桿菌屬、鏈霉菌屬為細菌屬水平的優(yōu)勢菌屬，占比35.4%、17.5%和13.5%.孢圓酵母屬在真菌菌群屬水平占有絕對優(yōu)勢，占比為52.6%.對樣品進行功能基因預(yù)測分析，得出細菌中氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝、碳水化合物運輸和代謝、轉(zhuǎn)錄、一般功能預(yù)測表達水平高；真菌被鑒定出三種營養(yǎng)型和六個功能群.