結(jié)直腸癌患者血清5'-核苷酸酶、氧化三甲胺與腫瘤惡性進(jìn)展和預(yù)后的關(guān)系

何麗彩 苗金魚 劉媛 張建鋒 王春艷 王敬然 丁秋蕾

結(jié)直腸癌（colorectal cancer,CRC）是臨床上常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率分別占惡性腫瘤的第三位和第四位，且呈上升趨勢[1-2]，嚴(yán)重威脅人類的健康和生命安全。盡管近年來CRC的手術(shù)治療、放化療及靶向治療均取得了較大的進(jìn)展，但患者預(yù)后依然欠佳[3-4]。因而探索影響CRC患者預(yù)后的相關(guān)因素及臨床標(biāo)志物仍是目前研究的熱點(diǎn)，已有研究表明在CRC的病理生理改變過程中，相應(yīng)的標(biāo)志物在血清中的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生異常改變[5]。5'-核苷酸酶（5'-nucleotidase,NT5E）是由哺乳動(dòng)物的肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞表達(dá)的一種糖蛋白，可催化核苷酸去磷酸化，是核苷酸分解代謝的關(guān)鍵酶之一[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，circNT5E靶向調(diào)控miR-506-3p，miR-506-3p表達(dá)水平降低逆轉(zhuǎn)沉默circNT5E表達(dá)，對CRC細(xì)胞的遷移、侵襲和凋亡發(fā)揮作用[7]。氧化三甲胺（trimethylamine oxide,TMAO）是一種腸源性菌群的代謝產(chǎn)物，有研究表明腸道菌群的改變通過影響上皮細(xì)胞增殖、上皮細(xì)胞慢性炎癥及免疫系統(tǒng)等參與CRC的病理過程[8-9]。筆者通過測定CRC患者的血清NT5E、TMAO水平，探討兩項(xiàng)單獨(dú)及聯(lián)合檢測與CRC惡性進(jìn)展和預(yù)后的關(guān)系，以期為CRC的臨床治療和預(yù)后評估提供參考依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2014年6月至2016年7月石家莊市人民醫(yī)院收治的CRC患者150例（CRC組）和良性大腸息肉患者93例（良性息肉組）。CRC組男79例，女 71 例，年齡 27～65（46.36±4.32）歲；結(jié)腸癌 61 例，直腸癌89例；腫瘤直徑≥5 cm 38例，＜5 cm 112例；TNM分期Ⅰ期20例，Ⅱ期61例，Ⅲ期56例，Ⅳ期13例；低分化81例，中分化48例，高分化21例。良性息肉組男 48 例，女 45 例，年齡 25～61（45.93±6.28）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）CRC組、良性息肉組經(jīng)病理學(xué)檢查明確診斷；（2）CRC組、良性息肉組均為初診病例。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并嚴(yán)重心腦血管疾病及肝腎疾病者；（2）有傳染病、免疫系統(tǒng)疾病者；（3）近期使用抗菌藥物或免疫抑制劑者。選擇同期在本院健康體檢者93例作為健康對照組，男 47 例，女 46 例，年齡 22～60（45.27±6.49）歲。3組對象性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)石家莊市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批準(zhǔn)號(hào)：201403-21），所有對象均知情同意。

1.2 方法 CRC組、良性息肉組于入院后第2天、健康對照組于體檢當(dāng)天早晨空腹抽取外周靜脈血5 ml，于0.5 h內(nèi)在3 000 r/min下離心10 min，離心半徑10 cm，分離并留取血清置于EP管，保存于-80℃恒溫冰箱待測。

1.3 血清NT5E水平檢測 采用夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測血清NT5E水平。采用NT5E試劑盒（上海瑞番生物科技有限公司，規(guī)格：96T，批號(hào)：20140612），嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出在室溫下平衡15～30 min，計(jì)算檢測樣本所需酶標(biāo)條；用標(biāo)準(zhǔn)洗滌緩沖液300 μl洗滌酶標(biāo)板（上海晶安生物科技有限公司，96孔全白板）3次并拍干，加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣本，100 μl/孔，15 min內(nèi)完成點(diǎn)樣，室溫下孵育2 h；去除孔中液體后加入標(biāo)準(zhǔn)洗滌緩沖液300 μl洗板3次并拍干酶標(biāo)板；加入預(yù)先配制好的檢測抗體加入酶標(biāo)板，100 μl/孔，混勻后再室溫下孵育 1 h；去除孔中液體后加入標(biāo)準(zhǔn)洗滌緩沖液300 μl洗板3次并拍干酶標(biāo)板；將預(yù)先配制好的顯色液加入酶標(biāo)板，200 μl/孔，混勻后室溫避光孵育 20 min，加入 50 μl/孔終止液，輕輕晃動(dòng)至酶標(biāo)板顯色均勻，20 min內(nèi)讀取450 nm處的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本血清NT5E水平。

1.4 血清TMAO水平檢測 采用穩(wěn)定同位素稀釋液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（ID-LC-MS）檢測血清TMAO水平。采用Agilent6410型質(zhì)譜儀（美國安捷倫科技公司）和Agilent1260型快速高分離液相色譜（美國安捷倫科技公司）。溶液配制：（1）混合血清：將分離出來EP管內(nèi)的血清取2 ml，混勻后保存?zhèn)溆?。?）標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液：用超純凈水將0.003 8 g的TMAO配制成10 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，保存于-20℃冰箱備用；檢測前用PBS 10倍稀釋的混合血清配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。（3）除蛋白液：將超純凈水加入5 mg的d9-TMAO試劑（儀器的配套試劑）中配制成100 mmol/L的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，保存于-20℃冰箱備用；使用時(shí)用乙腈將儲(chǔ)備液稀釋為10 μmol/L的內(nèi)標(biāo)應(yīng)用液。（4）流動(dòng)相：精確稱取適量甲酸銨，用超純凈水配制成10 mmol/L的甲酸銨溶液，采用甲酸將pH值調(diào)至3.0，超聲脫氣處理。取30 μl血清或標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，加入3倍體積的除蛋白液，混勻后在4℃下以13 200 r/min離心15 min，取上清液轉(zhuǎn)移至密封的進(jìn)樣瓶后上機(jī)檢測。色譜質(zhì)譜條件：固定相為Ultimate SiO2column；流動(dòng)相為：乙腈∶甲酸銨=70%∶30%（v/v），等度洗脫；流速：0.4 ml/min；進(jìn)樣量：5 μl；柱溫：30 ℃；離子源：電噴霧離子源；母離子：76.1 emu；定性離子對：42.0 emu；定量離子對：58.1 emu；去簇電壓：40 V；干燥氣溫度：300℃；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式；霧化氣流速：8 L/min；碰撞能量：9 eV。

1.5 隨訪及生存資料分析[10]所有CRC患者出院后按計(jì)劃進(jìn)行隨訪，隨訪方式包括回院復(fù)查和電話隨訪。電話隨訪：出院后第1年每月電話回訪1次，之后每3個(gè)月回訪1次?；卦簭?fù)查：出院后第1年每3個(gè)月回院復(fù)查1次，之后每6個(gè)月回院復(fù)查1次。隨訪截止時(shí)間為2021年7月。采用ROC曲線計(jì)算血清NT5E、TMAO水平對CRC患者預(yù)后的預(yù)測閾值，根據(jù)閾值分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，分析血清NT5E、TMAO高/低表達(dá)患者預(yù)后的差異。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier生存曲線分析血清NT5E、TMAO高/低表達(dá)CRC患者的生存情況，生存率比較采用log-rank檢驗(yàn)；采用ROC曲線分析血清NT5E聯(lián)合TMAO預(yù)測CRC患者死亡的預(yù)測效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組 對象血清NT5E、TMAO水平的比較 CRC組血清NT5E、TMAO水平高于良性息肉組、健康對照組，良性息肉組高于健康對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05），見表1。

表1 3組對象血清NT5E、TMAO水平的比較

2.2 血清NT5E、TMAO水平與CRC患者臨床特征的關(guān)系 血清NT5E、TMAO水平與CRC患者性別、年齡、腫瘤位置、病理類型、腫瘤直徑均無關(guān)（均P＞0.05）。分化程度越低、TNM分期越高的CRC患者血清NT5E、TMAO 水平越高（均 P＜0.05），見表2。

表2 血清NT5E、TMAO水平與CRC患者臨床特征的關(guān)系

2.3 血清NT5E、TMAO高/低表達(dá)CRC患者預(yù)后的比較 隨訪5年，150例CRC患者中失訪4例，不納入統(tǒng)計(jì)分析。CRC患者5年生存率為70.6%（103/146）。NT5E閾值為8 mg/ml，NT5E高表達(dá)組為79例，NT5E低表達(dá)組為67例。血清NT5E高表達(dá)組5年生存率為60.8%（48/79），低于低表達(dá)組的 82.1%（55/67），經(jīng)log-rank 檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.089，P＜0.05），見圖1。TMAO閾值為10 μmol/L，TMAO高表達(dá)組為76例，TMAO低表達(dá)組為70例，血清TMAO高表達(dá)組5年生存率為60.5%（46/76），低于低表達(dá)組的81.4%（57/70），經(jīng)log-rank檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.290，P＜0.05），見圖2。

圖1 血清NT5E高/低表達(dá)CRC患者Kaplan-Meier生存曲線

圖2 血清TMAO高/低表達(dá)CRC患者Kaplan-Meier生存曲線

2.4 血清NT5E、TMAO單獨(dú)及聯(lián)合檢測對CRC患者死亡的預(yù)測效能 進(jìn)一步探討血清NT5E聯(lián)合TMAO檢測對CRC患者死亡的預(yù)測效能：以43例死亡患者為陽性樣本，以103例生存患者為陰性樣本，建立ROC診斷分析模型。結(jié)果顯示，兩指標(biāo)聯(lián)合檢測時(shí)的AUC高于兩指標(biāo)單獨(dú)檢測，預(yù)測效能較高（表3），ROC曲線見圖3。

表3 血清NT5E、TMAO單獨(dú)及聯(lián)合檢測對CRC患者死亡的預(yù)測效能

圖3 血清NT5E、TMAO單獨(dú)及聯(lián)合檢測預(yù)測CRC患者死亡的ROC曲線

3 討論

近年來，隨著我國經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展，人們的生活方式、飲食習(xí)慣及我國人口年齡結(jié)構(gòu)都發(fā)生了巨大的變化，我國CRC的發(fā)病率呈上升趨勢，而在世界范圍內(nèi)，CRC已成為繼肺癌和乳腺癌之后嚴(yán)重危害人類健康的第三大常見惡性腫瘤[11-12]。目前對于CRC的治療方式包括外科治療、放射治療、化學(xué)治療及免疫治療，其中外科手術(shù)切除是根治CRC的首推方法[13]，無論何種治療方法，腫瘤惡性程度仍是影響CRC預(yù)后的關(guān)鍵因素[14]。目前臨床上對CRC的惡性程度判斷、預(yù)后評估主要依賴于結(jié)腸鏡檢查和組織學(xué)病理檢查，雖然檢查效果較理想，但其有創(chuàng)性給患者帶來巨大的困擾。隨著腫瘤標(biāo)志物的深入研究，血清學(xué)指標(biāo)檢測越來越受到廣大醫(yī)護(hù)人員及患者的青睞，因而探尋可以有效預(yù)測CRC惡性程度和預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物具有重要的臨床實(shí)際意義。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，膽囊癌細(xì)胞中外源性表達(dá)NT5E可以部分逆轉(zhuǎn)miR-30b和miR-340對細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用[15]。Bin等[16]發(fā)現(xiàn)在直腸腺癌組織中CD73（NT5E）的表達(dá)水平高于癌旁組織。Apsb等[17]研究表明，甲狀腺乳頭狀癌患者NT5E活性升高，其表達(dá)與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)有關(guān)。另有研究顯示，NT5E通過調(diào)節(jié)SYNCRIP的表達(dá)參與了胰腺癌的進(jìn)展過程，其表達(dá)水平與胰腺癌的不良預(yù)后有關(guān)[18]。有研究表明腸道細(xì)菌的改變與CRC的發(fā)生具有相關(guān)性，而TMAO是目前研究最為廣泛的腸道菌群代謝產(chǎn)物之一[19-20]。趙雨等[21]研究顯示，TMAO可能通過激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖。包瑩等[22]研究顯示，Wnt/β-catenin、HGF/c-MET、PI3K/Akt/Mtor、RAS-ERK/TGF-β/SMAD等信號(hào)通路及相關(guān)基因均參與了CRC轉(zhuǎn)移的過程。綜合分析可知，TMAO的作用機(jī)制與CRC病理改變存在共同的信號(hào)通路。因此筆者推測，NT5E、TMAO可能與CRC惡性進(jìn)展有密切關(guān)系，檢測血清NT5E、TMAO水平對CRC患者死亡可能具有一定的預(yù)測價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，血清NT5E、TMAO水平CRC組高于良性息肉組，良性息肉組高于健康對照組，且其水平與臨床分期、分化程度有關(guān)，TNM分期越高、分化程度越低的CRC患者，其血清NT5E、TMAO水平越高。這提示CRC患者血清NT5E、TMAO水平異常升高，且水平與腫瘤惡性程度有關(guān)，NT5E、TMAO可能參與了CRC的病理改變過程。CRC患者血清NT5E、TMAO水平異常升高的原因可能是：首先，NT5E基因的啟動(dòng)因子至少有一個(gè)缺血誘導(dǎo)因子1α，因而腫瘤微環(huán)境中的缺氧狀態(tài)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中血清NT5E水平上調(diào)[23]；其次，轉(zhuǎn)錄因子的甲基化可明顯下調(diào)NT5E的表達(dá)[24]，而癌細(xì)胞中NT5E甲基化缺失，因而導(dǎo)致其表達(dá)水平異常升高。而TMAO作為腸道菌群代謝產(chǎn)物之一，CRC患者腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致TMAO水平異常升高。本研究中采用Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，血清NT5E、TMAO高表達(dá)組5年生存率低于低表達(dá)組，提示血清NT5E、TMAO水平與CRC患者生存期有密切關(guān)系，低水平表達(dá)NT5E、TMAO的CRC患者其治療后生存期越長，預(yù)后越良好。其原因可能是：NT5E可水解生成腺苷，NT5E水平升高導(dǎo)致腺苷含量增加，刺激了癌細(xì)胞生長及抑制了機(jī)體對惡性腫瘤的免疫應(yīng)答，并通過腺苷的A2a受體促使內(nèi)皮細(xì)胞增殖[23]，而TMAO水平升高激活了PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路[21]，增強(qiáng)了癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移能力從而影響患者的生存期。本研究顯示，血清NT5E聯(lián)合TMAO檢測預(yù)測CRC患者生存的AUC為0.836，靈敏度和特異度也都在0.8以上，提示血清NT5E聯(lián)合TMAO檢測可作為預(yù)測CRC治療后生存期的敏感性指標(biāo)。王奇龍等[25]研究顯示，血清CEA、CA19-9、CA242單獨(dú)預(yù)測CRC患者術(shù)后轉(zhuǎn)移的AUC分別為0.799、0.678、0.750?？梢姡狙芯恐醒錘T5E聯(lián)合TMAO檢測預(yù)測CRC患者生存的效能優(yōu)于血清腫瘤標(biāo)志物，但仍需要后續(xù)大樣本量的研究進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，血清NT5E、TMAO水平與CRC患者腫瘤惡性進(jìn)展及預(yù)后有關(guān)，血清NT5E、TMAO有望成為輔助評估CRC預(yù)后的指標(biāo)。