不同濃度二甲雙胍對丙泊酚所致斑馬魚神經(jīng)毒性的改善作用

楊廣慧 沈佳紅 於陽 黃婭琴 徐佳雯 程遠 孫建良

丙泊酚是目前臨床上最常用的靜脈麻醉藥之一，具有起效迅速、代謝快、蘇醒平穩(wěn)等特點，尤其適用于嬰幼兒手術麻醉。然而，和其他麻醉藥物具有神經(jīng)毒性類似，胎兒及嬰幼兒早期接觸丙泊酚可引起神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，出現(xiàn)學習能力及認知功能的下降[1]。二甲雙胍是雙胍類降糖藥，通過抑制肝糖原輸出、增加胰島素敏感性、抑制糖異生等途徑降低血糖，且?guī)缀鯚o乳酸酸中毒及低血糖等不良反應。近年來發(fā)現(xiàn)二甲雙胍不僅有突出的降低血糖功能，同時對神經(jīng)系統(tǒng)有保護作用[2-5]。斑馬魚是一種新型動物模型，其基因與人類基因序列同源度高，近年來廣泛應用于神經(jīng)科學研究，具有體外受精、胚胎透明而易于觀察及操作等特點，已成為篩查藥物的首選動物模型之一[6]。筆者通過建立丙泊酚所致斑馬魚胚胎神經(jīng)毒性模型，探討二甲雙胍對該模型的作用，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 野生型AB品系斑馬魚雌雄配比2∶1，自然成對交配收集受精后6 h（6 hpf）胚胎，胚胎放入養(yǎng)魚用水中培養(yǎng)，顯微鏡（日本 OLYMPUS公司，型號：SZX7）下確認發(fā)育處于相同階段后入組實驗，共300個。鹽酸二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司，國藥準字：H20023370，規(guī)格：0.5 g/片）；丙泊酚注射液（愛爾蘭Aspen Pharma Trading公司，注冊證號：H20171275，規(guī)格：10 mg/ml）；吖啶橙染料（美國 Sigma公司，批號：494-38-2）；電動聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡（日本Nikon公司，型號：AZ100）；行為學分析儀（法國ViewPoint Life Sciences公司，型號：V3.11）。斑馬魚胚胎均培養(yǎng)于28℃的養(yǎng)魚用水中（水質(zhì)：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導率為450～550 μS/cm，pH 為 6.5～8.5，硬度為 50～100 mg/L CaCO3）。

1.2 方法

1.2.1 分組及處理 將150個斑馬魚胚胎按隨機抽樣法分別置于6孔板中，30個/孔，每孔為一組，共5組。將二甲雙胍1.5、3、6 mg分別加入3 ml養(yǎng)魚用水中，濃度分別設置成二甲雙胍500 μg/ml（M1組）、1 000 μg/ml（M2組）和2 000 μg/ml（M3組），另外兩組分別為無二甲雙胍的丙泊酚對照組（P組）及正常對照組（C組）。其中P組、M1組、M2組及M3組均加入丙泊酚5 μg/ml[7]，C組不作任何處理，正常培養(yǎng)于養(yǎng)魚用水中。所有實驗組每孔容量均為3 ml。

1.2.2 中樞神經(jīng)細胞凋亡檢測 經(jīng)28℃培養(yǎng)1 d后，將斑馬魚胚胎剝除卵膜，并用超純水清洗2次，于含有濃度為2.5 μg/ml吖啶橙的培養(yǎng)液中避光培養(yǎng)30 min，超純水清洗3遍，染色后每組采用隨機抽樣法抽取10個置于熒光顯微鏡下拍照，使用NIS-Elements D 3.20軟件采集并分析斑馬魚胚胎中樞神經(jīng)細胞凋亡數(shù)。

1.2.3 反應能力評估 其余150個斑馬魚胚胎分組及處理同1.2.1。28℃培養(yǎng)5 d后，每組采用隨機抽樣法抽取10條斑馬魚進行反應能力評估。行為學分析儀采集20 min內(nèi)2個明暗周期（即黑暗5 min、光照5 min交替2個周期）的運動速度，分析每分鐘平均運動速度[8]。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnet檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組斑馬魚胚胎中樞神經(jīng)細胞凋亡數(shù)的比較 C組中樞神經(jīng)凋亡細胞數(shù)為（12.90±1.21）個，P組為（23.10±2.12）個，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明丙泊酚5 μg/ml可致斑馬魚胚胎中樞神經(jīng)細胞凋亡。M1組、M2組及M3組中樞神經(jīng)凋亡細胞數(shù)分別為（20.30±1.96）、（18.10±2.01）和（11.40±1.79）個。與 P組比較，M3組中樞神經(jīng)細胞凋亡數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明經(jīng) 2 000 μg/ml二甲雙胍處理，中樞神經(jīng)細胞凋亡情況得到改善，見圖1、2（插頁）。

圖1 斑馬魚胚胎中樞神經(jīng)細胞凋亡分析部位示意圖（黃色虛線內(nèi)為分析部位，綠色小點為凋亡細胞）

圖2 5組斑馬魚胚胎中樞神經(jīng)細胞凋亡表型圖（綠色小點為凋亡細胞）

2.2 各組斑馬魚反應能力的比較 C組每分鐘平均運動速度為（2.06±0.08）mm/s，P 組為（0.91±0.08）mm/s，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明丙泊酚 5 μg/ml可致斑馬魚每分鐘平均運動速度明顯減慢，反應能力降低。M1組、M2組及M3組每分鐘平均運動速度分別為（0.85±0.07）、（1.15±0.06）和（1.46±0.08）mm/s，與P組比較，M2組和M3組每分鐘平均運動速度增快，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），說明經(jīng)1 000和2 000 μg/ml二甲雙胍處理后，斑馬魚反應能力得到改善。

3 討論

神經(jīng)細胞凋亡是大腦發(fā)育的一個重要環(huán)節(jié)，在大腦發(fā)育建立中，神經(jīng)細胞初始數(shù)量遠超生理需要，其中50%～70%會走向凋亡，故細胞凋亡是神經(jīng)發(fā)育的重要組成部分，一旦凋亡程序被外界因素干擾，就會使發(fā)育畸形的概率增加。有研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚可引起神經(jīng)細胞凋亡，導致認知功能障礙[9-10]。二甲雙胍作為廣泛使用的降糖藥，近年來發(fā)現(xiàn)對神經(jīng)系統(tǒng)損傷具有保護作用[2-5]。在顱內(nèi)腫瘤放療后患兒中，使用二甲雙胍可以明顯改善其認知功能[2]。動物實驗也證實二甲雙胍對中風后的小鼠具有神經(jīng)修復功能[3]，二甲雙胍處理的小鼠形成新的記憶比對照組小鼠快[4]。

在分子生物學水平上，二甲雙胍對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用機制尚不完全清楚。腺苷酸活化蛋白激酶[adenosine 5'-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK]，是目前二甲雙胍在體內(nèi)最主要的作用靶點之一。CREB結(jié)合蛋白（CREB-binding protein,CBP）在胚胎神經(jīng)前體細胞的發(fā)育過程中必須存在，CBP需要被非典型蛋白激酶C（atypical PKC,aPKC）激活才能完成此作用。aPKC-CBP是AMPK的下游通路之一，二甲雙胍作為AMPK的激動劑可以激活神經(jīng)前體細胞中aPKC-CBP通路[11]，進而促進神經(jīng)細胞生長及修復[4-5，12]。

在沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1,SIRT1）及過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子 1α（peroxlsome proliferator-activated receptor-γ coactlvator-1α,PGC-1α）相關通路領域，已有的研究表明AMPK-SIRT1信號通路的功能紊亂可誘導七氟烷所致的神經(jīng)細胞凋亡和認知功能障礙[13]。而AMPK的激動劑可以激活AMPK-SIRT1-PGC-1α通路，該通路通過抑制氧化應激和提高線粒體功能，從而減少七氟烷麻醉所致神經(jīng)細胞的凋亡、發(fā)揮抗氧化作用及改善認知功能[14]。AMPK可以增加還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NADH）的水平，繼而誘導激活SIRT1，而SIRT1的乙?；梢赃M一步激活促進PGC-1α的表達。PGC-1α通過結(jié)合過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferatoractivated receptor,PPARγ），調(diào)節(jié)線粒體生物合成的關鍵蛋白并促進線粒體的功能和代謝。線粒體是自由基產(chǎn)生和誘發(fā)凋亡的重要場所，七氟烷麻醉可以引起術后認知功能障礙模型中大鼠海馬區(qū)發(fā)生氧化應激，使氧自由基產(chǎn)生積累，積累的自由基可以通過過氧化線粒體膜的脂質(zhì)，進而激活線粒體凋亡，最終引起神經(jīng)細胞的凋亡。而七氟烷引起的氧化應激可以使用AMPK的激動劑逆轉(zhuǎn)，具體表現(xiàn)為激活AMPK-SIRT1-PGC-1α可以逆轉(zhuǎn)由于七氟烷麻醉導致的大鼠海馬凋亡神經(jīng)細胞數(shù)目的減少、cleaved天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase-3）上調(diào)，線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential,MMP）和 ATP 的下調(diào)[14]。

已有研究證明，丙泊酚所致神經(jīng)細胞凋亡與中樞炎癥及氧化應激有關，表現(xiàn)為丙泊酚可致大鼠活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）、氧化應激產(chǎn)物2,4-二硝基酚（2,4-dinitrophenol,DNP）和4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal,HNE）及凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3等表達升高[9]。筆者推測丙泊酚亦可能通過干擾AMPK通路加重認知功能障礙，而二甲雙胍作為經(jīng)典AMPK激活劑，推測可以通過激活AMPK而產(chǎn)生丙泊酚麻醉后神經(jīng)保護作用。故后續(xù)的研究仍需進一步驗證二甲雙胍對丙泊酚誘導神經(jīng)毒性改善的具體分子機制。

本研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍1 000 μg/ml可以改善丙泊酚所致斑馬魚反應能力減低（P＜0.05），但對于中樞神經(jīng)細胞凋亡數(shù)的改善尚不明顯（P＞0.05）。二甲雙胍2 000 μg/ml可以同時改善丙泊酚所致斑馬魚中樞神經(jīng)細胞凋亡（P＜0.01）及反應能力降低（P＜0.01），故筆者推測二甲雙胍對丙泊酚所致的神經(jīng)毒性的保護作用存在濃度依賴。

綜上所述，二甲雙胍可以改善丙泊酚所致斑馬魚神經(jīng)毒性，具體機制有待于進一步研究。