硅藻定量分析在溺死診斷中的應(yīng)用

杜宇坤，張?zhí)烊~，劉景建，劉超，康曉東，鄭冬云，石河，徐曲毅，馬開(kāi)軍，趙建

1.廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所 法醫(yī)病理學(xué)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510442；2.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515；3.上海市公安局物證鑒定中心 法醫(yī)物證學(xué)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海市現(xiàn)場(chǎng)物證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200083；4.昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500

1904 年，REVENSTORF 首次在溺死者肺內(nèi)觀察到硅藻后，硅藻檢驗(yàn)逐漸成為溺死診斷最常用的實(shí)驗(yàn)室檢查方法[1-5]。過(guò)去硅藻檢驗(yàn)結(jié)果診斷溺死的原則是，肺組織硅藻檢驗(yàn)為陽(yáng)性，肝、腎、牙齒、骨髓等器官中也檢出硅藻，且硅藻種類與實(shí)地水樣一致，即可診斷為溺死[5]。但是，有研究[3-4,6-11]在溺死尸體中未檢出硅藻或在非溺死尸體器官組織中檢出硅藻，使硅藻檢驗(yàn)診斷溺死的價(jià)值受到質(zhì)疑。多年來(lái)，研究者不斷探索硅藻診斷溺死的標(biāo)準(zhǔn)，提出了建立非溺死尸體各組織器官硅藻的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)以甄別溺死或死后入水，但在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的應(yīng)用效果并不理想[3,5,12]。

本課題組前期研究[13-17]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)硅藻定量分析肺組織與水樣硅藻含量比值（CL/CD值）能夠有效區(qū)分溺死與死后入水。因此，本研究擬對(duì)490例水中尸體的硅藻檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，研究溺死及死后入水者肺、肝、腎組織和水樣中的硅藻含量及種類，探討硅藻定量分析在溺死診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 案例情況

收集廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所與上海市公安局物證鑒定中心于2013 年6 月—2021 年1 月鑒定的490例死因明確的水中尸體案例，尸體均完整。根據(jù)490例尸體的死因分為溺死組和死后入水組，其中溺死組468例，死后入水組22例，同時(shí)提取尸體處發(fā)現(xiàn)的水樣（實(shí)際取水樣案例數(shù)為405例，其中溺死組390例，死后入水組15例）。溺死的診斷依據(jù)為通過(guò)案情調(diào)查或有目擊者確認(rèn)溺死，具有溺死的典型病理特征[5]，排除鎮(zhèn)靜安眠類、有機(jī)磷類、毒品及鼠藥類等常見(jiàn)毒（藥）物中毒。死后入水組案例的死因?yàn)轱B腦損傷、機(jī)械性窒息和電擊死。

1.2 硅藻檢驗(yàn)

參照《法庭科學(xué)硅藻檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)范微波消解-真空抽濾-顯微鏡法》（GA/T 1662—2019）[18]對(duì)上述尸體的肺、肝和腎組織進(jìn)行組織樣本提取，提取前所有工具、器皿均用超純水沖洗，確認(rèn)不含硅藻。采用微波消解-真空抽濾-自動(dòng)掃描電子顯微鏡（microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy，MD-VF-Auto SEM）法[19-20]進(jìn)行硅藻檢驗(yàn)。

1.2.1 微波消解

提取肺組織2 g，肝、腎組織各10 g，現(xiàn)場(chǎng)水樣30 g于消解管中，加入8 mL 65%濃硝酸（德國(guó)Merk 公司）和2 mL 30%過(guò)氧化氫（德國(guó)Merk 公司）。將消解管置于Multiwave 3000 微波消解儀（奧地利Anton Paar公司）中進(jìn)行消解。程序設(shè)定：將功率在5 min內(nèi)由0 W升至800 W，保持該功率10 min，然后停止微波消解，通過(guò)強(qiáng)風(fēng)冷卻30 min。

1.2.2 真空抽濾

將各組織消解液分別倒入濾杯內(nèi)使用HL-6 多聯(lián)真空抽濾儀（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）進(jìn)行抽濾（真空度400 mmHg），加入50 mL 超純水使濾膜表面接近中性，再加入10 mL 無(wú)水乙醇脫去濾膜內(nèi)水分后取出濾膜。

1.2.3 掃描電子顯微鏡觀察

應(yīng)用SCD005 離子濺射儀（德國(guó)Leica 公司）真空噴鍍金膜后將樣品座置于Phenom XL G2 臺(tái)式掃描電子顯微鏡（荷蘭PhenomWorld 公司）下觀察。每個(gè)樣品座都由來(lái)自廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所或上海市公安局物證鑒定中心的2 名具有豐富硅藻檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)的法醫(yī)學(xué)專家進(jìn)行檢驗(yàn)。計(jì)算硅藻含量（個(gè)/10 g）=組織檢出硅藻數(shù)×10/組織質(zhì)量，記錄硅藻種類，計(jì)算CL/CD值[14-17]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 24.0 軟件（美國(guó)IBM 公司）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。硅藻含量和CL/CD值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，并依據(jù)肺組織對(duì)水樣中硅藻的富集程度將CL/CD值分為≤1、＞1～＜2 和≥2 3 個(gè)范圍；依據(jù)硅藻含量將水樣分為＜100、100～1 000、1 000～10 000、＞10 000 4組。對(duì)溺死組和死后入水組各器官與水樣中硅藻含量、硅藻種類數(shù)、CL/CD值比較，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布和方差齊性使用兩樣本間t檢驗(yàn)，不符合則使用秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 溺死組和死后入水組硅藻檢驗(yàn)結(jié)果

468例溺死組案例中，肺組織均檢出硅藻，陽(yáng)性率為100.0%；424例肝組織中檢出硅藻，陽(yáng)性率為90.6%；431例腎組織中檢出硅藻，陽(yáng)性率為92.1%。肺、肝和腎組織中同時(shí)檢出硅藻的共計(jì)400例，總陽(yáng)性率為85.5%。

22例死后入水組案例中，19例肺組織中檢出硅藻，陽(yáng)性率為86.4%；7例肝組織中檢出硅藻，陽(yáng)性率為31.8%；6例腎組織中檢出硅藻，陽(yáng)性率為27.3%。肺、肝和腎組織中同時(shí)檢出硅藻的共計(jì)6例，總陽(yáng)性率為22.2%。

2.2 各器官和水樣中硅藻含量

468例溺死組案例中，肺、肝、腎組織和水樣中硅藻含量分別為（113 235.9±317 868.1）、（26.7±75.6）、（23.3±52.2）和（12 113.3±21 760.0）個(gè)/10 g。其中76.9%肝組織和74.1%腎組織硅藻含量小于20 個(gè)/10 g。肺組織、水樣中硅藻含量高于肝、腎組織中硅藻含量（P＜0.05），肝組織和腎組織中硅藻含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

死后入水組有18例（81.8%）肺組織硅藻含量低于600 個(gè)/10 g，肺組織硅藻含量少于溺死組（P＜0.05）。

2.3 溺死組各器官和水樣中硅藻種類

肺、肝、腎組織和水樣中硅藻種類數(shù)分別為（7.5±2.8）、（2.6±1.9）、（2.9±2.1）和（8.9±3.0）種，其中水樣的硅藻種類最多，水樣、肺組織中硅藻種類數(shù)多于肝組織和腎組織（P＜0.05），腎組織中硅藻種類數(shù)多于肝組織（P＜0.05）。肺、肝、腎組織硅藻種類數(shù)量與水樣相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

2.4 CL/CD值

390例溺死組和15例死后入水組的平均CL/CD值分別為（100.6±830.7）和（0.3±0.4）。由表1 可見(jiàn)，兩組共有128例CL/CD值≤1，31例CL/CD值在＞1～＜2，246例CL/CD值≥2；CL/CD值≥2 的案例全部來(lái)自溺死組，死后入水組86.7%（13/15）的CL/CD值≤1。

表1 溺死組和死后入水組CL/CD 值Tab.1 The CL/CD between drowning group and postmortem immersion group

由表2 可見(jiàn)，當(dāng)水樣中硅藻含量增加時(shí)，CL/CD值減?。划?dāng)水樣中硅藻含量＜1 000 個(gè)/10 g 時(shí)，CL/CD值離散趨勢(shì)較大。

表2 溺死組CL/CD值Tab.2 The CL/CD of drowning group（）

表2 溺死組CL/CD值Tab.2 The CL/CD of drowning group（）

3 討論

法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)用于診斷溺死一直充滿爭(zhēng)議，主要在于有時(shí)溺死者體內(nèi)無(wú)法檢出硅藻，而在非溺死者體內(nèi)又可以檢出硅藻[3-4,6-11]。傳統(tǒng)的硅藻檢驗(yàn)方法回收率低，難以對(duì)各組織器官進(jìn)行硅藻定量分析[19-20]。而MD-VF-Auto SEM 法最大程度地避免了硅藻富集過(guò)程中的損失，顯著提高了組織器官的硅藻回收率及硅藻陽(yáng)性檢出率[14,19-20]。本研究中溺死組100.0%案例的肺組織檢出硅藻，85.5%案例的肝、腎組織中同時(shí)檢出硅藻。

在溺死過(guò)程中，溺死者在水中有劇烈的主動(dòng)呼吸，溺液被反復(fù)吸入肺組織，該過(guò)程可持續(xù)6 min左右[5]，因此，溺死尸體肺組織硅藻含量高于水樣（P＜0.05）。而肺組織硅藻含量與溺液硅藻含量成正相關(guān)，所以CL/CD值可消除溺液硅藻變化的影響[14-17]，更有利于對(duì)溺死尸體肺組織硅藻富集程度的分析。本研究結(jié)果也顯示，溺死組CL/CD值大于死后入水組（P＜0.05）。以上結(jié)果說(shuō)明，在溺水劇烈的呼吸運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，水樣中大量的硅藻進(jìn)入肺中并保留，甚至富集。死后入水組有81.8%（18/22）的案例肺組織硅藻含量低于600個(gè)/10 g，低于溺死組（P＜0.05），且死后入水組86.7%（13/15）的CL/CD值≤1，而CL/CD值≥2 的全部為溺死案例。死后入水時(shí)，由于缺乏主動(dòng)呼吸，只有少量的硅藻隨水一起被動(dòng)地進(jìn)入肺部，肺組織的硅藻含量一般較低。因此，CL/CD值也可能反映溺死者溺死時(shí)肺部呼吸活動(dòng)的強(qiáng)度，CL/CD值越高，越有可能診斷為溺死。但值得注意的是，溺死組部分案例的CL/CD值也＜2，無(wú)法單純依據(jù)CL/CD值區(qū)別溺死和死后入水。本研究結(jié)果顯示，水樣中硅藻含量越低（＜1 000），CL/CD值的離散趨勢(shì)越大，此時(shí)肺對(duì)水中硅藻的富集作用不明顯，使CL/CD值不準(zhǔn)確[14]。有些案例水樣中硅藻含量極少，而肺組織中硅藻含量卻很高，可能原因是尸體發(fā)現(xiàn)地并非死者的入水地點(diǎn)，所取的水樣并非死者吸入的溺液，從而使CL/CD值偏大。

由于水樣本身和溺死時(shí)間不同，或受尸體腐敗、在水中浸泡時(shí)間等因素影響，各器官和水樣中硅藻含量差異較大，如水井、自來(lái)水和高原地區(qū)水體中硅藻含量較低，冬季水體中硅藻含量較低[7,14]；隨著尸體浸泡時(shí)間延長(zhǎng)，特別是尸體腐敗或水壓較高的情況下，硅藻會(huì)通過(guò)破口進(jìn)入人體[21]，從而影響各器官和水樣中的硅藻含量。而從490例案例總體來(lái)看，溺死組肺組織硅藻含量和死后入水組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），因此硅藻肺組織定量分析結(jié)果可以作為溺死診斷的證據(jù)。溺死過(guò)程中，硅藻隨溺液被吸入肺部，并由于肺泡-毛細(xì)血管屏障作用，絕大部分硅藻被截留在肺組織中，僅有少量硅藻進(jìn)入體循環(huán)，進(jìn)而到達(dá)肝、腎等器官，因此不同組織器官的硅藻含量差異較大[2-5]。本研究結(jié)果顯示，溺死尸體肝組織和腎組織中硅藻含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但遠(yuǎn)小于肺組織和水樣中硅藻含量（P＜0.05），且76.9%的肝組織和74.1%的腎組織硅藻含量小于20 個(gè)/10 g，該結(jié)果可以用來(lái)評(píng)估硅藻檢驗(yàn)結(jié)果的有效性，即當(dāng)發(fā)現(xiàn)肝組織或腎組織中的硅藻含量大于肺組織或水樣中的硅藻含量時(shí)，表明可能存在污染。對(duì)溺死組各器官和水樣中硅藻種類數(shù)的分析發(fā)現(xiàn)，水樣中硅藻種類最多，肝組織中硅藻種類最少，且都小于水樣中硅藻種類數(shù)量（P＜0.05）。這是因?yàn)槟缢罆r(shí)，硅藻隨溺液進(jìn)入肺組織，部分硅藻穿過(guò)肺泡-毛細(xì)血管屏障進(jìn)入肺毛細(xì)血管，并隨血液循環(huán)到達(dá)肝組織[5,22-23]。內(nèi)部器官中的硅藻來(lái)自溺液，硅藻種類只是水中硅藻群落的一部分，因此器官中的硅藻種類可能比水樣中的少。

綜上所述，對(duì)水中尸體內(nèi)部器官和水樣進(jìn)行硅藻定量分析可為溺死診斷提供支持性證據(jù)，引入CL/CD值這一參數(shù)進(jìn)行分析，能更準(zhǔn)確地進(jìn)行溺死診斷。