高通量測序技術在法醫(yī)學硅藻檢驗中的應用進展

蔡杰，王博，陳建華，鄧建強

海南醫(yī)學院法醫(yī)鑒定中心 海南省熱帶法醫(yī)學司法鑒定工程研究中心 海南省院士工作站（熱帶法醫(yī)學）海南醫(yī)學院法醫(yī)學教研室，海南 ?？?571199

水中尸體檢驗是法醫(yī)學實踐和研究的重要內(nèi)容之一，判斷死者是生前溺水死亡還是死后拋尸入水，以及推斷落水地點成為研究的核心和重點。硅藻在自然界（特別是水中）大量存在，在溺水過程中硅藻會隨同溺液進入人體，因此尸體器官組織中存在硅藻是認定生前溺水的“金標準”[1]，硅藻檢驗主要通過對硅藻形態(tài)學特征或者區(qū)分硅藻DNA 分子差異來進行。近年來，隨著高通量測序技術的快速發(fā)展，特別是測序成本有了較大幅度的下降，高通量測序技術被廣泛應用于包括硅藻在內(nèi)的微生物群落結構等方面的研究[2-5]。本文擬就法醫(yī)學硅藻檢驗的現(xiàn)狀和困境、高通量測序技術的基本原理及其在法醫(yī)學硅藻檢驗中的應用價值和前景進行綜述。

1 法醫(yī)學硅藻檢驗現(xiàn)狀及困境

法醫(yī)學實踐中，硅藻檢驗可應用于區(qū)分生前溺死和死后拋尸入水、推斷溺水地點[6]等。硅藻能夠用于推斷溺水地點是因其對于水體環(huán)境的變化敏感，不同水域的硅藻種類會因環(huán)境的變化而具有很大的差異[7-8]。推斷溺水地點需要了解所在地區(qū)主要水域的硅藻種群分布規(guī)律，必須對該地區(qū)水域不同時間的硅藻種群分布狀況進行詳細調查和總結。

目前法醫(yī)學硅藻檢驗的研究方法主要分為形態(tài)學方法和分子生物學方法2種。形態(tài)學方法是通過硝酸消化、微波消解等[9]方法將硅藻從溺液、組織中分離出來，然后利用光學顯微鏡或電子顯微鏡對硅藻形態(tài)特征進行觀察，確定所檢測樣本內(nèi)所含的硅藻種類及數(shù)量，這是目前法醫(yī)學實踐中硅藻檢驗的常規(guī)方法[10]。但硅藻的形態(tài)學檢驗有其不足，如掃描電子顯微鏡價格昂貴，檢驗過程中需要對數(shù)量龐大的照片中的硅藻種類進行人工判讀，成本高，費時費力；且硅藻種類和形態(tài)繁多，故其形態(tài)學分類對檢驗人員的硅藻分類經(jīng)驗要求較高，檢驗人員需要經(jīng)過多年的培養(yǎng)和實踐才能勝任，而全世界范圍內(nèi)正面臨傳統(tǒng)分類學專業(yè)人員的不斷減少[11]，致使基于形態(tài)學特征的硅藻檢驗技術廣泛應用更加困難。雖有將人工智能（artificial intelligence，AI）技術用于掃描電子顯微鏡照片識別的報道[12-15]，但其應用的可靠性仍有待進一步研究。

硅藻分子生物學檢驗方法是近年來逐步發(fā)展起來的硅藻檢驗新方法，是法醫(yī)學領域硅藻形態(tài)學檢驗方法的重要補充。該方法通過獲取和分析一段或幾段硅藻特異性DNA 序列實現(xiàn)對硅藻種類的鑒定，具有可靠、高效、易于標準化的優(yōu)點，已被廣泛應用于生態(tài)學研究、藻類種屬鑒定等。與硅藻形態(tài)學檢驗方法相比，硅藻分子生物學檢驗方法大大減少了檢驗所需的樣本量，提高了檢驗的靈敏度和可靠性，很大程度上降低了硅藻檢驗結果出錯的概率[16-23]，并且硅藻分子檢驗方法對環(huán)境和實驗者人體的危害遠低于硅藻形態(tài)學檢驗方法。但當前法醫(yī)學硅藻分子生物學檢驗方法還不完善，一方面其檢測缺乏標準化方法，另一方面，目前基于PCR 和第一代測序為主的硅藻分子研究技術，對于法醫(yī)學實踐中所涉及研究樣本中含有多種硅藻種屬的情況，在技術方面存在不足，影響其在法醫(yī)學實踐中的廣泛應用[24-25]。近年來，隨著DNA 測序技術的快速發(fā)展，開始有研究嘗試將高通量測序技術應用于法醫(yī)學硅藻DNA 檢驗，為從檢驗技術角度解決硅藻檢驗難題提供了新的思路與方向[26]。

2 高通量測序技術及其應用于硅藻研究的技術關鍵

SANGER 等[27]開發(fā)的基于雙脫氧末端終止法的DNA 測序技術奠定了一代測序的基礎，后續(xù)用熒光基團標記、平行毛細管電泳技術對Sanger 測序法進行改進[28-29]。然而，一代測序技術由于通量較低的限制，無法滿足遺傳學研究對大批量測序的需求。因此，逐步發(fā)展出高通量測序技術[30-31]。

高通量測序技術于2005年興起，經(jīng)歷了從短讀長到長讀長的發(fā)展歷程，高通量、短讀長的測序技術被稱為二代測序技術，高通量、長讀長的測序技術被稱為三代測序技術。二代測序技術以美國Roche 公司的454平臺、美國Illumina 公司的Solexa 平臺和美國Thermo Fisher Scientific 公司的Solid 平臺為代表。三代測序技術以美國PacBio 公司的單分子實時（single molecule real time，SMRT）測序和英國Oxford Nanopore Technologies 納米孔單分子測序技術為代表。與二代測序技術相比，三代測序技術無需PCR 擴增，可實現(xiàn)對單個DNA 分子的測序，避免了PCR 過程中出現(xiàn)的系統(tǒng)偏好性[32]，其在保持二代測序技術高通量低成本優(yōu)勢的同時提高了讀長，但較高測序錯誤率和高昂的儀器試劑價格，在一定程度上限制了其應用。

高通量測序技術的出現(xiàn)和發(fā)展，使DNA 測序技術實現(xiàn)了從單一的反應體系到高效、快速、海量DNA分子同步檢測的跨越式發(fā)展，直接推動了人類對DNA 相關研究的爆發(fā)式發(fā)展，但目前仍然存在一系列問題需要解決。各高通量測序技術平臺分別有其優(yōu)勢和劣勢，不同測序平臺采用不同的測序分析軟件，由于所用算法的差異，測序準確率各不相同，分析結果的一致性也尚需進一步驗證[33]。當前用于高通量測序序列拼接的算法根據(jù)拼接策略分為基于Greedy 策略的算法、基于Overlap-Layout-Consensus策略的算法和基于De Bruijn Graph 策略的算法，其中基于Greedy 策略的算法是最早應用的算法[34]，適合于硅藻DNA 高通量測序的序列拼接，但其存在計算資源量耗費大的問題，也需要進一步改進[35]。

硅藻作為當前生命科學領域的研究熱點之一，主要集中于生物監(jiān)測、生物地理學、植物區(qū)系研究等領域[36]。其中，硅藻及其群落的分類和特征是最重要的研究內(nèi)容，最初主要采用基于形態(tài)學觀察的方法，后來隨著DNA 分子標志技術的快速發(fā)展，特別是以PCR 為基礎的分子檢測技術的廣泛應用，硅藻研究開始進入DNA 分子水平。但是，由于硅藻研究的主要樣本是自然環(huán)境的水樣，其中含有的硅藻數(shù)量和種類繁多，所以，在高通量測序應用于硅藻檢驗之前，硅藻DNA 分子水平的研究主要針對培養(yǎng)的單一、純種硅藻進行，無法實現(xiàn)對水樣中硅藻種類、群落特征、物種豐富度等內(nèi)容的研究，高通量測序技術的出現(xiàn)，使得這些問題得以迎刃而解，包括硅藻在內(nèi)的藻類高通量測序程序見圖1[37]。

由圖1 可知，高通量測序技術應用于硅藻分類研究受多個關鍵技術環(huán)節(jié)影響，主要環(huán)節(jié)有硅藻DNA 提取、硅藻分子標志物的選擇和硅藻參考數(shù)據(jù)庫的選取。

圖1 藻類分類高通量測序流程圖Fig.1 High-throughput sequencing flow chart of algae classification

2.1 硅藻DNA 提取

硅藻DNA 提取效率對硅藻群落組成的準確鑒定和定量分析有著重要影響。雖然硅藻DNA 提取方法具有不同技術路線，但過程不外乎細胞裂解、DNA 分離和DNA 純化3 個環(huán)節(jié)。細胞裂解是否完全、基質是否會吸附DNA、酶抑制劑的共提取和DNA 降解是硅藻樣本DNA 提取過程中面臨的主要問題[38]。細胞裂解一般采用PK、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、SDS 等化學試劑消化降解，特異性與蛋白質、脂質等結合或者利用研磨、振蕩等物理破碎的方法，破壞硅藻的硅殼結構，釋放硅藻DNA，再利用DNA 自身的物理化學性質進行純化。以目前廣泛使用的PowerSoil?DNA Isolation 試劑盒（美國Mobio 公司）為例，其裂解步驟中既有玻璃珠擊打破碎，又有SDS細胞裂解成分，但目前各種試劑盒對硅藻DNA 的提取效果缺乏對比性研究報道。

2.2 硅藻分子標記

硅藻DNA 分子標記的選擇和篩選，是硅藻分類效能的關鍵，對高通量測序技術用于硅藻研究來說，亦是如此[39]。硅藻的DNA 來自硅藻的細胞核、線粒體和葉綠體三部分，因此，目前關于硅藻分類的分子標記選擇的研究，也主要集中在硅藻核糖體基因、線粒體基因和葉綠體基因的單獨使用或者聯(lián)合使用[40]。

2.2.1 核糖體基因

核糖體基因是藻類分類中研究較多的基因，因其廣泛存在于各類細胞中，很少發(fā)生大規(guī)模的橫向基因遷移，具有一系列從非常保守到高變的區(qū)域，又因其所承受的選擇壓力不同，使得核糖體DNA 各區(qū)域核苷酸的保守序列差異明顯，所以適用于生物分類研究[41]。硅藻是真核生物，其核糖體DNA 由核糖體基因和與之相鄰的間隔區(qū)域組成，包括5.8S rDNA、18S rDNA、28S rDNA 和內(nèi)轉錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS），18S rDNA 的可變區(qū)進一步分為V1～V9 區(qū)，ITS rDNA 包括ITS-1 和ITS-2[42]。硅藻核糖體基因的研究主要集中在18S rDNA 基因、ITS rDNA 基因等。目前的研究[43]已經(jīng)證實，通過高通量測序技術測定18S rDNA、ITS rDNA 某個可變區(qū)的序列，可以反映不同樣本微生物群落間的差異，因而被廣泛應用于藻類的系統(tǒng)發(fā)育和分類學研究。ZIMMERMANN 等[44]通過對硅藻18S rDNA V4 區(qū)種內(nèi)、種間距離的計算分析，建議將18S rDNA 作為硅藻的DNA 條形碼。郭瑞軍[45]通過將18S rDNA V9 區(qū)域的高通量測序結果與掃描電子顯微鏡結果比較，認為高通量測序技術在硅藻屬水平的分類鑒定中具有優(yōu)勢。馬奔[46]利用高通量測序技術對微囊藻ITS 區(qū)進行測序，發(fā)現(xiàn)其對微囊藻具有較好的分類效果。

2.2.2 線粒體基因

線粒體基因具有高重排率和低突變率的特點[47]，應用于硅藻分類研究主要集中在細胞色素c氧化酶亞基I（cytochrome c oxidase subunit I，COI）。COI基因已被成功用于多種動物和某些原生生物的DNA條形碼分析[48-49]，EHARA 等[50]基于COI基因的研究表明，該區(qū)段可以用于硅藻分類，并證明了8種硅藻系統(tǒng)的進化關系。但是，有研究[51]表明COI基因主要適用于硅藻低分類單元和某些近緣物種的鑒別。

2.2.3 葉綠體基因

硅藻葉綠體基因主要集中在葉綠體中編碼核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基（ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit，rbcL）基因和23S rDNA V 結構域的UPA（universal plastid amplicon）基因。rbcL 基因以單拷貝形式存在，不發(fā)生基因轉變；長度達到1 400 bp，有足夠的分子性狀用于分支分析；進化速率較適于研究遠緣親屬間及科級以上的系統(tǒng)關系[51-52]。UPA基因廣泛存在于硅藻中，通用性較高，且在硅藻中易于擴增，UPA基因曾一度被認為是藻類DNA 條形碼的首選基因。然而進一步研究[51]發(fā)現(xiàn)，UPA基因在硅藻類群中的高保守性限制了其作為硅藻DNA 條形碼的應用。黃艷等[53]對紅藻的rbcL、UPA、COI基因區(qū)域進行測序對比，發(fā)現(xiàn)測序成功率從高到低依次為rbcL、UPA、COI，得出rbcL 的硅藻種屬分類能力優(yōu)于COI的結論。HAMSHER 等[54]通過對rbcL-3p和UPA區(qū)域進行對比研究，也建議將rbcL-3p作為硅藻分類的首選基因。

2.2.4 聯(lián)合應用

線粒體基因、葉綠體基因和核糖體基因普遍存在于藻類細胞中，對單一基因位點的檢測有時往往無法實現(xiàn)滿意的藻類種屬鑒別[55]。通過多個DNA 分子標志的聯(lián)合應用，可以提高對藻類種屬鑒別的能力，如MONIZ 等[56-57]通過對28 種硅藻（89 個樣本）的18S rDNA、COI和ITS2+5.8S rDNA 的分析，建議將ITS2+5.8S rDNA 作為硅藻分類的條形碼，后又對114 種硅藻的ITS2+5.8S rDNA 序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，建議將ITS2+5.8S rDNA 作為硅藻門內(nèi)中心綱和硅藻綱的DNA 條形碼。

2.3 硅藻參考序列數(shù)據(jù)庫

高通量測序技術要實現(xiàn)對硅藻的分類，必須與參考數(shù)據(jù)庫中已被分類的硅藻序列進行比對匹配，因此參考數(shù)據(jù)庫的準確性和完整性對硅藻分類尤為重要。目前已有多個與硅藻分類有關的分類參考數(shù)據(jù)庫，但這些數(shù)據(jù)庫存在著不同程度硅藻序列的分類錯誤，不同數(shù)據(jù)庫間參考序列數(shù)量偏差極大，不同種類硅藻的序列錄入差別較大，且有些種類缺乏[58]。VASSELON等[59]利用形態(tài)學方法和高通量測序技術對法國某個島嶼河流的監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，高通量測序和形態(tài)學檢驗中只有13%的硅藻種類相同，分析其差異可能主要來源于高通量測序參考數(shù)據(jù)庫的不完善。RIVERA 等[60]在對布爾熱湖的底棲硅藻DNA 進行高通量測序與傳統(tǒng)形態(tài)學分類比較中也發(fā)現(xiàn)同樣的問題。因此，在通過高通量測序技術進行硅藻研究中，數(shù)據(jù)庫的完善、糾錯、擴大以及選擇，直接影響后續(xù)分析結果。表1為硅藻常見DNA 比對數(shù)據(jù)庫的匯總。

表1 目前常用硅藻DNA 比對數(shù)據(jù)庫Tab.1 Currently commonly used database of diatom DNA alignment

總之，與硅藻高通量測序研究技術相關領域的研究，為將該技術應用于法醫(yī)學硅藻檢驗提供了研究基礎，但基于法醫(yī)學硅藻檢驗的特殊性，將該技術應用于法醫(yī)學，尚需解決一系列技術難題。

3 高通量測序技術應用于法醫(yī)學硅藻檢驗的現(xiàn)狀及技術難題

高通量測序技術本身具有的技術優(yōu)勢決定了其特別適合法醫(yī)學硅藻分子檢驗的要求，直接將相關學科的硅藻研究結果應用于法醫(yī)學硅藻檢驗實踐存在極大風險：一方面法醫(yī)學硅藻檢驗涉及的樣本（如溺死者肺、肝、腎等器官組織）為法醫(yī)學科特殊檢材，其他學科的研究成果不適用；另一方面則是為解決實際應用中溺水地點推斷的問題，法醫(yī)學對硅藻種群關系的區(qū)分提出了更高的要求，對參考數(shù)據(jù)庫的覆蓋程度提出了更高的標準。相較其他領域，應用高通量測序技術進行法醫(yī)學硅藻檢驗，在同樣的關鍵技術環(huán)節(jié)，面臨不一樣的技術要求和難題。

3.1 DNA 的提取

溺死地點水樣、溺死組織的樣本采集及后續(xù)DNA 的提取是應用高通量測序技術進行硅藻種屬檢驗的基礎。溺死地點水樣、溺死組織的采集雖然已有相應的標準[61]，但現(xiàn)有標準都是針對硅藻形態(tài)學檢驗制定的，缺乏針對硅藻分子生物學檢驗的相關標準規(guī)范。由于檢材、水樣等的復雜性和多樣性，每個案件中樣本的情況都不同，硅藻在不同水域、不同人體組織的含量與分布存在差異，增加了制定統(tǒng)一標準的困難，需要大量研究數(shù)據(jù)支撐。NGUYEN 等[62]對7 種成品試劑盒的硅藻DNA 提取效果進行比較，發(fā)現(xiàn)提取的DNA 普遍存在RNA 污染，推測與樣本中抑制物未能完全去除有關。王志龍等[63]發(fā)現(xiàn)，不同DNA 提取方法對微生物群落的多樣性存在較大影響，但這些研究都是針對自然環(huán)境樣本進行的，與法醫(yī)學樣本中充斥著大量人體組織DNA 的情況存在差異，因此，需要評價不同硅藻DNA 提取方法對法醫(yī)學不同硅藻樣本的DNA 提取效果，甚至需要建立專門適合人體組織硅藻DNA 提取的技術方法體系，此需求是法醫(yī)學硅藻研究所特有的，只有依靠法醫(yī)學自身的研究和積累去完成。后續(xù)可以開展針對法醫(yī)學溺死樣本硅藻DNA 提取方法的專項研究，如不同DNA 提取方法效果的比較，綜合考慮可靠性、經(jīng)濟性、普及性等因素，制定統(tǒng)一的法醫(yī)學溺死樣本硅藻DNA提取方法標準。

3.2 分子標志的選擇

硅藻DNA 不同區(qū)域的保守度不同，擴增區(qū)域的選擇會對硅藻種群分類的分析結果產(chǎn)生影響。CAI等[64]對淤泥中的微生物多樣性進行分析，發(fā)現(xiàn)微生物的多樣性和擴增區(qū)域具有很大關系。同一樣本用不同引物得出的微生物種群豐度存在差異[65]。理想的引物是用一種引物盡可能多地擴增出樣本DNA，同時有效區(qū)分不同種屬，但“通用引物”都是基于已有序列進行設計，通過少量已知序列設計的引物檢測大量未知微生物存在嚴重問題，不同的引物對不同種屬硅藻的覆蓋度不同，導致硅藻種屬結果與實際情況存在較大偏差[66]。同時，含硅藻的人體組織樣本中含有大量人體DNA，這就要求設計硅藻種屬特異性較強的引物以避免人類DNA 的干擾，同時實現(xiàn)可擴增的硅藻種類最大化，因此需要對已有硅藻研究的引物進行篩選，設計適合法醫(yī)學硅藻檢驗的分子標志引物，后續(xù)可以設計簡并引物[67]來擴大覆蓋度或針對單一硅藻種屬設計特異性引物。當前法醫(yī)學硅藻檢驗中應用較多的引物主要集中在硅藻核糖體、葉綠體區(qū)域，如KANE 等[68]選擇16S rDNA 區(qū)域引物對水樣和組織中微型浮游生物的PCR 產(chǎn)物進行分析，發(fā)現(xiàn)微型浮游生物的16S rDNA 的PCR 分析有助于溺水的確定。袁文勇等[69]利用硅藻DNA 的5.8S+ITS2 區(qū)域的片段長度多態(tài)性來區(qū)分生前溺死和死后拋尸入水，取得了較好的效果，但由于樣本量很少，需要考慮其偶然性。ZHAO 等[70]利用對硅藻18S rDNA V7 區(qū)域的測序分析技術可實現(xiàn)對不同水域不同生長環(huán)境的硅藻種群的有效識別。VINAYAK[71]利用實驗動物研究不同硅藻葉綠體基因位點用于硅藻分類的效果，發(fā)現(xiàn)UPA的分類效果強于rbcL，并用DNA 測序的方法證明了硅藻檢驗是區(qū)分生前溺死和死后拋尸入水的有力證據(jù)。LIU 等[72]用高通量測序技術和形態(tài)學檢驗方法對實際案件組織中的硅藻進行檢驗，比較兩者的可靠性，提出當前高通量測序技術應用于硅藻檢驗最大的困難是缺乏可靠的硅藻分類參考序列。FANG 等[55]利用焦磷酸測序對家兔肺組織和可疑溺液分別進行測序，發(fā)現(xiàn)用AdvISER-M-PYRO 算法對測序結果進行處理后，通過溺死組織中的浮游生物群落可追溯溺液的來源。KAKIZAKI 等[26]將高通量測序技術應用于實際案例，發(fā)現(xiàn)高通量測序技術所需的樣本量從常規(guī)硅藻檢驗所需的10 g降低到200 mg，具備更高的靈敏度。

通過對已有文獻的硅藻分子標志引物進行篩選，應 用Basic Local Alignment Search Tool（BLAST，https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）檢驗以排除人類基因的干擾，目前已報道的可以排除人體組織影響的硅藻分子標志引物匯總見表2。

表2 可以排除人體組織影響的硅藻檢驗引物匯總Tab.2 Summary primers for diatom tests which can exclude the influence of human tissues

續(xù)表2Continued Tab.2

3.3 測序數(shù)據(jù)庫

目前利用高通量測序技術進行法醫(yī)學硅藻檢驗分類所依賴的參考數(shù)據(jù)庫尚不完善，硅藻種類尚未實現(xiàn)全覆蓋，且各數(shù)據(jù)庫中硅藻分類也存在不同程度的分類錯誤和序列錯誤。因此，高通量測序能否有效應用于法醫(yī)學硅藻檢驗，還需要大量的數(shù)據(jù)積累，對各地硅藻種類進行調查，建立各地符合法醫(yī)學實踐需求的硅藻分子檢測參考數(shù)據(jù)庫。

總之，高通量測序技術雖已廣泛應用于生命科學的諸多領域，但其在法醫(yī)學硅藻檢驗中的研究和應用尚處在起步階段，面臨著諸多問題和挑戰(zhàn)，但從長遠來說，在法醫(yī)學硅藻檢驗中應用高通量測序技術具有良好的前景，相信隨著技術的進步和相關難題的攻克，必將在法醫(yī)學溺水案件鑒定中發(fā)揮重要作用。